便サンプル中の寄生虫感染を検出するための自動糞便分析装置と直接湿式塗抹顕微鏡の比較分析

サマリー

寄生虫感染症は、特に発展途上国や地域で公衆衛生上の大きな課題となっています。この研究では、自動糞便分析装置を比較して、その診断効果を従来の直接湿式塗抹顕微鏡法と比較します。

要約

社会経済の発展に伴い、腸内寄生虫症の有病率は年々大幅に減少しています。しかし、寄生虫感染症は、特に発展途上国や地域において、世界的に依然として主要な公衆衛生問題となっています。これらの疾患の蔓延を抑制するためには、タイムリーな診断と治療が重要です。従来の直接湿式塗抹顕微鏡法は、広く使用されていますが、労働集約的で、汚染されやすく、技術者のスキルに依存します。本稿では、便サンプル処理を自動化する自動糞便分析装置について紹介し、従来の直接湿式塗抹顕微鏡法に比べて、操作の容易さ、迅速な検出、清潔で衛生的な作業環境、高感度・特異性などの利点を提供し、診断効率と精度を向上させます。

糞便分析法の3つの異なる方法を比較しました。直接湿潤塗抹顕微鏡法、自動糞便分析装置(AIレポート)、自動糞便分析装置(ユーザー監査)です。AIレポートは、自動画像分析と機械学習アルゴリズムを使用して、糞便サンプル中の寄生虫や卵などの成分を特定します。この方法では、多数のサンプルを迅速に処理できるため、効率が向上します。ユーザー監査では、自動糞便分析装置も使用しますが、ユーザー監査の追加ステップが含まれています。経験豊富な技術者がAIレポートをレビューして、結果の精度と信頼性を高めます。この分析装置は、AIレポートで84.31%、ユーザー監査で94.12%の感度を示し、AIレポートで98.71%、ユーザー監査で99.69%の特異性を示し、寄生虫感染症の臨床診断と治療に非常に貴重なツールとなっています。

概要

世界的に、腸管寄生虫疾患は、主に発展途上国において依然として重大な公衆衛生上の問題となっています。中華人民共和国国家衛生健康委員会の歴史的データによると、感染率は1992年の62.63%から2015年には5.96%へと著しく低下したことが明らかになっています^1,2,3。このように劇的な減少が見られる一方で¹、加重国家有病率が0.47%で推定感染者数が598万人であるのに対し³、広東省の住民におけるClonorchis sinensis感染の有病率は4.90%と顕著に高いままです⁴。広東省のような特定の地域では依然としてC. sinensisの感染率が高く、精度の高い診断法の必要性が強調されています。

寄生虫疾患の診断は、顕微鏡検査、医用画像診断、血清学的検査、および分子生物学的手法によって行うことができます。酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を用いた血清学的解析は、寄生虫疾患の診断に有用ですが、感度は約80%と中程度です⁵。分子生物学的診断技術は高い感度と特異性を有していますが⁶、操作が煩雑で時間がかかり、検査コストも高いため、大規模なルーチン検査には適していません。

患者の糞便中からC. sinensis卵を検出することが診断確定の根拠となる。C. sinensis卵を検索するKato-Katz厚塗法は、寄生虫疾患の診断に一般的に用いられる古典的な手法である^7,8。この方法は安価である一方、時間を要し、労力がかかり、大量の検体をスクリーニングする必要がある臨床現場には適していない。現在、多くの一次診療機関では直接塗抹法が採用されている。しかし、この方法も依然として時間と労力を要し、糞便の不快な臭いがあり、さらに交差汚染が起きやすく、バイオセーフティ上のリスクが高く、検査員の習熟度や精勤度に結果が左右されるという課題がある⁹。

従来の診断技術は有用である一方で、感度と実用性に限界があります。しかし、科学技術の絶え間ない進歩により、糞便検査の自動化と標準化が進んでいます。糞便中の寄生虫や寄生虫卵を定量的に検出するためにデジタル画像ベースの手法を利用する自動分析装置が、臨床検査室で普及しつつあります。これらの装置は、操作の簡便さ、迅速な検出、清潔で衛生的な作業環境、ならびに高い感度と特異度といった利点を提供します。自動糞便分析装置は、デジタル画像技術を用いて、顕微鏡とその統合デジタル画像システムを通じて一連の低倍率および高倍率のデジタル写真を撮影し、顕微鏡観察の内容を記録します。その後、システムはこれらの画像をコンピュータデータ処理システムに送信し、それに応じて識別および分析を行います。最近、私たちは糞便検体中の寄生虫およびその卵の検出に重点を置き、広範囲の寄生虫感染症の診断を試みました。陽性検体は、その形態学的特徴の存在によって識別されます。私たちは、糞便検体中の寄生虫検出における自動糞便分析装置を評価し、従来の顕微鏡法を補完する手法としての有用性を確認しました。自動糞便分析装置は、メインフレームと、自動サンプリングユニット、穿刺サンプリングユニット、検体特性および色観察ユニット、カメラユニット、試薬カードユニットを含むいくつかの専門ユニットを備えた付属ソフトウェアで構成されています（図1）。

図1: 装置の構成部品。 ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

本研究では、2024年7月に広東省人民医院の入院患者から採取した2,305件の新鮮な便検体を、自動便分析装置と直接塗抹鏡検法を用いて二重盲検法で評価した（図2）。一方のグループは直接塗抹鏡検法で検査を行い、もう一方はAI生成レポートを備えた自動便分析装置を用いて検査した。各グループの結果を記録した後、3番目の実験者グループが、自動分析装置によって撮影された画像を読影した。彼らは、寄生虫または虫卵の疑いがある画像、自動分析の結果と異なる画像、不鮮明または欠落している画像、および過剰な残渣を含む複雑な背景を持つ画像を精査した。このプロセスで結果の修正を行い、これを自動便分析装置のユーザー監査とした。最終的に、4人目の担当者が結果をまとめ、統計分析を行った。完全自動便分析装置の有効性は、寄生虫および虫卵の二重盲検検出を通じて、3つの手法間で検出時間と結果を比較することで評価された。

図 2: 研究計画の概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

本研究は、中国・広州のSouthern Medical University、広東省人民病院の倫理審査委員会の承認を得て実施されました（承認番号：KY2024-445-02）。すべての参加者は、登録前に書面によるインフォームドコンセントに署名しました。本研究に使用した試薬および器具は、材料リストに記載されています。

1. 検体採取

1. 自動糞便分析装置メーカー指定の検体採取チューブを使用する。チューブはキャップ付きで密封可能であり、清潔かつ乾燥し、漏れがなく、多点サンプリングに適した開口部と容量を備えていることを確認すること。
2. 粘液、膿、または血液を含む新鮮な異常糞便を、目標量約0.5 gできるだけ多く採取する。糞便が希薄または水様である場合は、使い捨てピペットを用いて必要なサンプル量を採取する。
   注：患者以外のすべての糞便サンプルによる汚染を防ぐよう注意する必要がある。これには、灌腸剤や油性下剤による糞便、差し込み便器やトイレからのサンプル、植物、土壌、下水、消毒剤、洗剤、尿、経血、または白帯下による汚染を受けた糞便が含まれるが、これらに限定されない。

2. 糞便検査法

1. 直接ウェットマウント鏡検法^10,11
   1. 清潔な顕微鏡スライドグラスに、生理食塩水を1〜2滴滴下します。
   2. 塗抹用に、糞便の異常部位または複数の部位から少量の検体を採取します。
   3. サンプルをスライド上に均一に広げます。詳細が確認できるよう、塗抹標本の厚さを調整してください。
   4. 気泡が入らないように注意しながら、塗抹標本の上にカバーガラスを載せます。
   5. 低倍率（10倍）で10視野以上を走査する。寄生虫卵または寄生虫が検出された場合は、高倍率（40倍）に切り替え、詳細な形態観察を行う。
      注：見落としのリスクを最小限に抑えるため、スライドを「バトルメント（城壁状）」順に低倍率で検査することを推奨します。
2. 自動糞便分析装置（図3)
   1. コンピューターと分析装置の電源を入れ、ソフトウェアを起動してユーザー名とパスワードを入力してログインし、装置によるセルフチェックが完了するまで待機します。
   2. 適切な検体採取チューブを用いて、適格な糞便を採取してください。
      注：粘液、膿、または血液を含む、重量約0.5 gの新鮮な異常便を推奨サンプルとします。
   3. 検体採取チューブを分析装置のサンプルホルダーに設置し、サンプルラックを自動検体導入部に配置して、セルフチェック完了後、最初の検査のために「Start」をクリックします。
      注：以降の検査は、装置によって自動的に検出および実施されます。装置のロボットが記録用にサンプルの写真を撮影します。
   4. サンプルチューブに希釈液を5 mL加え、ニューマチックミキシングで十分に混合し、分析前にサンプルを静置させてください。
      注：検体採取チューブには特殊なフィルターが内蔵されており、大量の植物繊維、種子、未消化の食物残渣など、病理学的意義のない残留物を除去します。
   5. サンプルを計数セルに流して解析を行います。解析装置が顕微鏡下で高解像度の顕微鏡画像を撮影し、ソフトウェアがそれらの画像を処理および認識します。
   6. 〜に切り替えます 結果 インターフェースでテスト画像を確認し、結果をラボ情報管理システム（LIS）に送信するか、または印刷します。
   7. クリック 停止 テストを終了します。
   8. 「フラッシュおよびシャットダウン」を選択します。
   9. 濃縮洗浄液のラックをセットしてください。装置が自動的にフラッシュ洗浄を行い、シャットダウンします。

図 3: 自動糞便分析システムのワークフロー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. 方法論的評価

1. 検出時間の算出
   注：検出時間は、各検査手順の開始時間と終了時間を記録することで算出した。寄生虫検出における各手法の感度と特異度を分析し、検査結果を比較した。
   1. 直接塗抹法（Direct Wet Smear Microscopy method）
      1. 各糞便サンプルについて、米粒大の糞便を採取し、ガラススライド上に均一に広げるまでにかかった時間を測定する。
      2. 各担当者が結果を読影するのにかかった時間を測定する。
      3. 各担当者の塗抹時間と読影時間を合算する。
      4. ステップ 3.1.1.3 の合計値に担当者数を乗じ、直接塗抹法の総検査時間（T₁）を算出する。
      5. ステップ 3.1.1.4 の T₁ を検査サンプル数で除し、直接塗抹法の平均検査時間（t₁）を算出する。
   2. 自動糞便分析装置（AIレポート）
      注：この工程は1名で実施可能である。
      1. 各サンプルにおける自動糞便分析装置の検査時間（T₂）を測定する。
      2. T₂ を検査サンプル数で除し、自動糞便分析装置（AIレポート）の平均検査時間（t₂）を算出する。
   3. 自動糞便分析装置（ユーザー監査）
      1. 各サンプルにおける自動糞便分析装置の検査時間を測定する（ステップ 3.1.2 参照）。
      2. 各サンプルの手動画像レビュー時間を測定する。自動糞便分析装置によってキャプチャされたサンプルの画像レビューを開始した直後にタイマー（ストップウォッチまたはデジタルタイマー）を始動させる。画像を注意深く検討し、関連する構成要素や異常を特定する。そのサンプルのレビューが完了した時点でタイマーを停止し、各サンプルレビューに要した時間を記録して、後の分析のためにスプレッドシートにデータを入力する。
      3. 各サンプルの自動糞便分析装置の検査時間と手動画像レビュー時間を合算する。
      4. ステップ 3.1.3.3 の合計値に担当者数を乗じ、自動糞便分析装置（ユーザー監査）の総検査時間（T₃）を算出する。
      5. T₃ を検査サンプル数で除し、自動糞便分析装置（ユーザー監査）の平均検査時間（t₃）を算出する。
2. 検査結果の比較
   注：自動糞便分析装置のAI生成レポートおよびユーザー監査の結果の性能を、直接塗抹法をベンチマークとして評価した。
   1. ベンチマークとなる直接塗抹法の結果を収集する。
   2. 自動糞便分析装置のAI生成レポートの結果を収集する。
   3. 自動糞便分析装置のユーザー監査の結果を収集する。
3. 評価指標の算出
   1. 自動糞便分析装置（AIレポートまたはユーザー監査）と直接塗抹法の両方の結果が、標的分析物の存在を示した場合、そのサンプルを真陽性（TP）とする。
   2. 自動糞便分析装置（AIレポートまたはユーザー監査）と直接塗抹法の両方の結果が、標的分析物の不在を示した場合、そのサンプルを真陰性（TN）とする。
   3. 自動糞便分析装置のAIレポートまたはユーザー監査が標的分析物の存在を示したが、直接塗抹法でその存在が確認されなかった場合、そのサンプルを偽陽性（FP）とする。
   4. 自動糞便分析装置のAIレポートまたはユーザー監査が標的分析物の不在を示したが、実際には直接塗抹法でその存在が検出された場合、そのサンプルを偽陰性（FN）とする。
   5. 特異度を次のように算出する：
      特異度 = 真陰性 (TN) / (真陰性 + 偽陽性)
   6. 感度を次のように算出する。
      感度 = 真陽性 (TP) / (真陽性 + 偽陰性)
   7. 陽性的中率（PPV）を次のように算出する：
      PPV = 真陽性 (TP) / (真陽性 + 偽陽性)
   8. 陰性的中率（NPV）を次のように算出する：
      NPV = 真陰性 (TN) / (真陰性 + 偽陰性)
   9. 統計ソフトを用いてカッパ値を算出する。
   10. 一致率を次のように算出する：
       一致率 = 一致数（AIおよびユーザーレポートの両方がベンチマークと一致）/ 総サンプル数
   11. 陽性検出率を次のように算出する：
       陽性検出率 = 陽性数 / 総サンプル数

4. 結果の解析

1. データをスプレッドシートに入力し、統計的に解析する。
2. カウントデータについては、率および割合を用いて記述し、対応のある両側カイ二乗検定を用いて群間比較を行う。
3. 独立サンプルT検定を用いて、2つの手法間での平均検出時間を比較する。
4. カッパ（κ）一致度により、手法間での寄生虫種の検出の一貫性を評価する。
5. P < 0.05を統計的に有意とみなす。

結果

3つの検出方法間における検出時間の比較
1サンプル1人あたりの平均検出時間は、直接ウェットプレパラート鏡検法で1.55 min、自動糞便分析装置（AIレポート）で1.30 min、自動糞便分析装置（ユーザー監査）で1.47 minであった。直接ウェットプレパラート鏡検法は、自動糞便分析装置（AIレポート）と比較して1.1倍の時間を要した（t = 2.442, P = 0.020）。一方、自動糞便分析装置（ユーザー監査）と直接ウェットプレパラート鏡検法の所要時間は同程度であった（t = 0.048, P = 0.962, Table 1）。

3つの手法による検出結果の比較
直接湿式塗抹鏡検法では、寄生虫卵陽性検体が51例、陰性検体が2,254例同定され、検出率は2.21%であった。自動糞便分析装置（AIレポート）では、72例の陽性検体が検出され、検出率は3.12%であった。自動糞便分析装置の結果を...

ディスカッション

寄生虫病は、特に栄養失調、発育阻害、貧血、胆道閉塞などの健康問題を引き起こし¹³、不十分な社会経済開発と教育にも関連している発展途上国において、世界的な公衆衛生上の重大な懸念事項¹²を表しています。寄生虫の糞便検査は臨床診療の日常的な部分となっており、精度、速度、効率がそのような検査の重要な要件となっています。

寄生虫検出には、顕微鏡検査、画像検査、血清学、分子技術などのさまざまな方法が採用されています。ELISA は血清学的診断を提供しますが、感度は低くなります⁵。分子法は感度と特^異性6に優れていますが、日常的なスクリーニングには複雑でコストがかかります。糞便サンプル中の卵の直接同定により診断が確定し、Kato-Katzは費用対効果の高い^{従来の方法7,8}ですが、集団スクリーニ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
自動糞便分析装置(FA280S)ソフト	オリエンター	v.1.028(RecoV2.9.14)	自動糞便分析装置(FA280S)システムのソフトウェア
濃縮洗浄液	オリエンター		パイプライン洗浄に最適
カバー グラス	セイルブランド		試料を損傷や汚染から保護します。
使い捨てプラスチックストロー	南通Lingkeバイオテクノロジー		生理食塩水の吸引に使用される使い捨てプラスチックストロー
FA280S	オリエンター	A022201035	全自動糞便分析
装置 フラッシングフルード	オリエンター	Q/WWT-019-2021	全自動糞便分析装置のフラッシングパイプラインが製造されました
顕微鏡	OLYMPUS	3H51278	細胞の観察
顕微鏡スライド		WS-7101	顕微鏡下での検査のために、安定した平坦な表面を提供します。
サンプル希釈剤	オリエンター	四川栄機械 20150025	便サンプルの希釈に適しています
サンプルラック	オリエンター		ローディングラック
サンプルチューブ	オリエンター	四川栄機械 20200204	糞便コレクター
クロエイドナトリウム注射	広東大翔製薬株式会社	H14020786	希釈
SPSS 統計ソフトウェア	IBM	SPSS Statistics 22.0	様々な研究・分析作業に対応
木の棒			糞便サンプルを適量採取するために使用される使い捨ての木の棒。