便サンプル中の寄生虫感染を検出するための自動糞便分析装置と直接湿式塗抹顕微鏡の比較分析

サマリー

寄生虫感染症は、特に発展途上国や地域で公衆衛生上の大きな課題となっています。この研究では、自動糞便分析装置を比較して、その診断効果を従来の直接湿式塗抹顕微鏡法と比較します。

要約

社会経済の発展に伴い、腸内寄生虫症の有病率は年々大幅に減少しています。しかし、寄生虫感染症は、特に発展途上国や地域において、世界的に依然として主要な公衆衛生問題となっています。これらの疾患の蔓延を抑制するためには、タイムリーな診断と治療が重要です。従来の直接湿式塗抹顕微鏡法は、広く使用されていますが、労働集約的で、汚染されやすく、技術者のスキルに依存します。本稿では、便サンプル処理を自動化する自動糞便分析装置について紹介し、従来の直接湿式塗抹顕微鏡法に比べて、操作の容易さ、迅速な検出、清潔で衛生的な作業環境、高感度・特異性などの利点を提供し、診断効率と精度を向上させます。

糞便分析法の3つの異なる方法を比較しました。直接湿潤塗抹顕微鏡法、自動糞便分析装置(AIレポート)、自動糞便分析装置(ユーザー監査)です。AIレポートは、自動画像分析と機械学習アルゴリズムを使用して、糞便サンプル中の寄生虫や卵などの成分を特定します。この方法では、多数のサンプルを迅速に処理できるため、効率が向上します。ユーザー監査では、自動糞便分析装置も使用しますが、ユーザー監査の追加ステップが含まれています。経験豊富な技術者がAIレポートをレビューして、結果の精度と信頼性を高めます。この分析装置は、AIレポートで84.31%、ユーザー監査で94.12%の感度を示し、AIレポートで98.71%、ユーザー監査で99.69%の特異性を示し、寄生虫感染症の臨床診断と治療に非常に貴重なツールとなっています。

概要

世界的に、腸内寄生虫症は、主に発展途上国で、公衆衛生上の大きな問題として存続しています。中華人民共和国保健福祉委員会の過去のデータによると、感染率は1992年の62.63%から2015年には5.96%に著しく減少しています^1,2,3。その劇的な減少にもかかわらず¹、加重全国有病率は0.47%、感染者数は推定598万人³、広東省の人口におけるClonorchis sinensis感染の有病率は4.90%^{4と著しく高いままです}。広東省のような特定の地域では、C. sinensisの感染率が依然として高く、正確な診断方法の必要性が強調されています。

寄生虫症の診断は、顕微鏡検査、医用画像、血清学的、および分子的方法によって達成できます。寄生虫症の診断には、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いた血清学的分析が有用ですが、感度は約80%^{5と中程度です}。分子生物学の診断技術は、感度と特異性が高い⁶ですが、面倒で時間のかかる操作や高い検査コストがかかるため、大規模なルーチン検査には適していません。

患者の糞便中のC. sinensisの卵の検出は、診断を確認するための基礎です。C. sinensisの卵を探すKato-Katz厚塗抹法は、寄生虫症の診断に一般的に使用される古典的な方法です^7,8。安価ですが、時間と労力がかかり、大量の検体をスクリーニングする臨床診療には適していません。現在、ほとんどのプライマリー病院では、直接湿式塗抹顕微鏡法を採用しています。しかし、この方法は依然として時間と労力がかかり、不快な糞便臭が伴い、相互汚染、高いバイオセキュリティリスク、および試験担当者の専門知識と勤勉さに依存する結果が発生しやすくなります⁹。

従来の診断技術は価値がありますが、感度と実用性には限界があります。しかし、科学技術の進歩に伴い、糞便検査の自動化と標準化が進んでいます。糞便中の寄生虫や寄生虫卵を定量的に検出するために、デジタル画像ベースの方法を利用する自動装置が臨床検査室で人気を集めています。操作の容易さ、迅速な検出、清潔で衛生的な作業環境、高い感度と特異性などの利点があります。自動糞便分析装置は、デジタルイメージング技術を使用して、顕微鏡とその統合されたデジタルイメージングシステムを通じて一連の低倍率および高倍率のデジタル写真をキャプチャすることにより、顕微鏡観察を文書化します。次に、システムはこれらの画像をコンピューターデータ処理システムに送信し、コンピューターデータ処理システムはそれに応じて画像を特定して分析します。最近では、糞便中の寄生虫とその卵の検出に焦点を当てて、さまざまな寄生虫感染症の診断を試みています。陽性サンプルは、それらの形態学的特性の存在によって識別されます。糞便サンプル中の寄生虫を検出するための自動糞便分析装置を評価し、従来の顕微鏡法の補助としての可能性を確認しました。自動糞便分析装置は、メインフレームと、自動サンプリングユニット、穿刺サンプリングユニット、サンプル特性・色観察ユニット、カメラユニット、試薬カードユニット(図1)など、いくつかの専用ユニットを備えた付属ソフトウェアで構成されています。

図1: 機器のコンポーネント この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

この研究では、2024年7月に広東省人民病院の入院患者から採取した2,305の新鮮な便サンプルを、自動糞便分析装置と直接湿式塗抹顕微鏡法(図2)を用いて二重盲検法で評価しました。1つのグループは直接湿式塗抹顕微鏡法を使用してテストを実施し、もう1つのグループはAIが生成したレポートを備えた自動糞便分析装置を使用しました。各グループからの結果を文書化した後、実験者の3番目のグループは、自動分析装置によってキャプチャされた画像を手動でレビューしました。寄生虫や卵の疑い、自動分析から逸脱した画像、ぼやけた画像や欠落している画像、複雑な背景に過剰な残留物が含まれている画像などがないか、精査しました。このプロセスには結果の修正が含まれ、これは自動糞便分析装置のユーザー監査と呼ばれていました。最終的に、4人目の個人が調査結果を要約し、統計的に分析しました。全自動糞便器具の有効性は、寄生虫/卵子の二重盲検検出によって評価され、3つの方法論で検出時間と結果を比較しました。

図2:研究計画の概略図<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67706/67706fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

プロトコル

この研究は、中国広州市南医科大学広東省人民病院の倫理審査委員会によって承認されました(承認番号:KY2024-445-02)。すべての参加者は、登録前に書面によるインフォームドコンセントに署名しました。本試験に使用した試薬および機器は、資料表に記載されています。

1. 標本コレクション

1. 自動糞便分析装置メーカーの検体採取チューブを利用して、キャップがかけられ、密閉可能で、清潔で乾燥し、漏れがなく、マルチポイントサンプリングに適した開口部と容量があることを確認します。
2. 粘液、膿、血液を含む新鮮な異常な便をできるだけ多く選択し、目標量は約0.5gです。糞便が希薄または水っぽい場合は、使い捨てのピペットを使用して必要なサンプル量を収集します。
   注:患者以外のすべての糞便サンプルからの汚染を防ぐように注意する必要があります。これには、浣腸や油性下剤からの糞便、便器やトイレからのサンプル、植物、土壌、下水、消毒剤、洗剤、尿、月経血、または白血によって汚染された糞便が含まれますが、これらに限定されません。

2. 糞便検査方法

1. 直接湿式塗抹顕微鏡法^10,11
   1. 1〜2滴の生理食塩水をきれいな顕微鏡スライドに塗布します。
   2. 異常な領域または糞便の複数の領域から少量のサンプルを採取して、塗抹標本にします。
   3. サンプルをスライド上に均等に広げます。汚れの厚さを調整して、細部が見えるようにします。
   4. 気泡を避けて、塗抹標本の上にカバースリップを置きます。
   5. 10 以上の視野を低倍率 (10 倍) でスキャンします。寄生虫の卵や寄生虫が検出された場合は、高倍率(40倍)に切り替えて詳細な形態観察を行ってください
      注:見逃すリスクを最小限に抑えるために、「胸壁」シーケンスでのスライドの低倍率検査をお勧めします。
2. 自動糞便分析装置(図3)
   1. コンピュータとアナライザーの電源を入れ、クリックしてソフトウェアを起動し、ユーザー名とパスワードのログイン情報を入力して、機器がセルフチェックを実行するのを待ちます。
   2. 適切なサンプル収集チューブを使用して、適格な糞便を収集します.
      注:粘液、膿、または約0.5gの血液を含む新鮮な異常な糞便が好ましいサンプルです。
   3. サンプル収集チューブをアナライザーのサンプルホルダーに置き、サンプルラックを自動サンプルインレットに置き、セルフチェック後の最初のテストの開始をクリックします。
      注意: 後続のテストは、機器によって自動的に検出および実施されます。装置ロボットは、文書化のためにサンプルを撮影します。
   4. サンプルチューブに5 mLの希釈液を加え、空気圧混合でよく混合し、サンプルを沈殿させてから分析します
      注:検体採取チューブには、大量の植物繊維、種子、未消化の食品残渣など、病理学的に重要でない残留物を除去するための特別なフィルターが敷かれています。
   5. サンプルを計数セルに流して分析し、分析装置が顕微鏡下で高解像度の顕微鏡画像をキャプチャし、ソフトウェアが画像を処理して認識します。
   6. Resultインターフェースに切り替えて、テスト画像を確認し、結果をLaboratory Information Management System(LIS)に送信するか、印刷します。
   7. [停止] をクリックしてテストを終了します。
   8. [フラッシュしてシャットダウン] を選択します。
   9. 濃縮クリアリング液のラックをロードします。機器は自動的にフラッシュされ、シャットダウンします。

図3:自動糞便分析システムワークフロー この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

3. 方法論的評価

1. 検出時間の計算
   注:検出時間は、各テスト手順の開始時間と終了時間を記録することによって計算されました。寄生虫の検出における各方法の感度と特異性を分析することにより、試験結果を比較しました。
   1. 直接湿式塗抹顕微鏡法
      1. 糞便サンプルごとに、米粒サイズの糞便を拾い上げ、スライドガラス上に均等に広げるのにかかる時間を測定します。
      2. 各参加者の結果を読み取るのにかかった時間を測定します。
      3. 各参加者のスワブと読書の時間を追加します。
      4. ステップ3.1.1.3の合計に参加者の数を掛けて、直接湿式塗抹顕微鏡法の合計テスト時間(T₁)を求めます。
      5. ステップ 3.1.1.4 の T₁ を試験したサンプル数で割ると、直接湿式塗抹顕微鏡法の平均試験時間 (t₁) が得られます。
   2. 自動糞便分析装置(AIレポート)
      注:このプロセスは1人で実行できます。
      1. 各サンプル(T₂)の自動糞便分析装置のテスト時間を測定します。
      2. T₂をテストされたサンプル数で割ると、自動糞便分析装置(AIレポート)の平均テスト時間(t₂)が得られます。
   3. 自動糞便分析装置(ユーザー監査)
      1. 各サンプルの自動糞便分析装置のテスト時間を測定します(ステップ3.1.2を参照)。
      2. 各サンプルの手動画像レビュー時間を測定します。サンプルから自動糞便分析装置によってキャプチャされた画像のレビューが開始されたらすぐにタイマー(ストップウォッチまたはデジタルタイマー)を開始します。画像を注意深く調べて、関連するコンポーネントや異常を特定します。そのサンプルのレビューが完了したらタイマーを停止し、各サンプルレビューにかかった時間を書き留め、データをスプレッドシートに入力してさらに分析します。
      3. 各サンプルに、自動糞便分析装置のテスト時間と手動画像レビュー時間を追加します。
      4. ステップ3.1.3.3の合計に参加者の数を掛けて、自動糞便分析装置(ユーザー監査)(T₃)の合計テスト時間を取得します。
      5. T₃をテストされたサンプル数で割ると、Automatic Fecal Analyzer(ユーザー監査)の平均テスト時間(t₃)が得られます。
2. テスト結果の比較
   注:自動糞便分析装置のAI生成レポートのパフォーマンスとユーザー監査結果は、ベンチマークとして直接ウェットスメア法を使用して評価されました。
   1. ベンチマークとなるDirect Wet Smear Microscopy法の結果を収集します。
   2. 自動糞便分析装置のAI生成レポートから結果を収集します。
   3. 自動糞便分析装置のユーザー監査から結果を収集します。
3. 評価メトリックを計算します。
   1. 自動糞便分析装置(AIレポートまたはユーザー監査)と直接湿式塗抹顕微鏡法の結果の両方がターゲット分析物の存在を示している場合、サンプルを真陽性(TP)と見なします。
   2. 自動糞便分析装置(AIレポートまたはユーザー監査)と直接湿式塗抹顕微鏡法の両方の結果がターゲット分析物の不在を示している場合、サンプルを真陰性(TN)と見なします。
   3. 自動糞便分析装置のAIレポートまたはユーザー監査で標的分析物の存在が示されているが、直接湿式塗抹顕微鏡法ではその存在が確認されない場合、サンプルを偽陽性(FP)と見なしてください。
   4. 自動糞便分析装置のAIレポートまたはユーザー監査で標的分析物が存在しないことが示され、Direct Wet Smear Microscopy法が実際にその存在を検出した場合、サンプルを偽陰性(FN)と見なします。
   5. 特異度を次のように計算します:
      特異性=真陰性(TN)/(真陰性+偽陽性)
   6. 感度を次のように計算します。
      感度 = 真陽性 (TP) / (真陽性 + 偽陰性)
   7. 陽性適中率(PPV)を次のように計算します:
      PPV = 真陽性 (TP) / (真陽性 + 偽陽性)
   8. 陰性適中率(NPV)を次のように計算します:
      NPV = 真陰性 (TN) / (真陰性 + 偽陰性)
   9. 統計ソフトウェアを使用してカッパ値を計算します。
   10. コンプライアンス率を次のように計算します。
       コンプライアンス率 = 契約 (AI とユーザー レポートの両方がベンチマークと一致します) / 合計サンプル数。
   11. 次のように陽性検出率を計算します:
       陽性検出率 = 陽性の数 / 総サンプル数。

4. 結果を分析します

1. スプレッドシートにデータを入力し、統計的に分析します。
2. カウントデータについては、説明に率と比率を使用し、対応のある4テールカイ二乗検定を使用してグループ間を比較します。
3. 独立サンプルのT検定を使用して、2つの方法の平均検出時間を比較します。
4. Kappa(κ)一致を介して、技術間の寄生虫種検出の一貫性を評価します。
5. P < 0.05 は統計的に有意であると考えてください。

結果

3つの検出方法間の検出時間の比較
平均検出時間は、Direct Wet Smear Microscopy法で1人1サンプルあたり1.55分、Automatic Fecal Analyzer(AIレポート)で1人1サンプルあたり1.30分、Automatic Fecal Analyzer(ユーザー監査)で1人1サンプルあたり1.47分でした。直接湿式塗抹顕微鏡法は、自動糞便分析装置(AIレポート)と比較して1.1倍の持続時間を必要としました(t = 2.442、P = 0.020)。逆に、全自動糞便分析装置(ユーザー監査)と直接湿式塗抹顕微鏡法の持続時間はほぼ同じでした(t = 0.048、P = 0.962、表1)。

3つの方法の検出結果の比較
Direct Wet Smear Microscopy法では、51の陽性寄生虫卵サンプルと2,254の陰性サンプルが同定され、検出率は2.21%でした。...

ディスカッション

寄生虫病は、特に栄養失調、発育阻害、貧血、胆道閉塞などの健康問題を引き起こし¹³、不十分な社会経済開発と教育にも関連している発展途上国において、世界的な公衆衛生上の重大な懸念事項¹²を表しています。寄生虫の糞便検査は臨床診療の日常的な部分となっており、精度、速度、効率がそのような検査の重要な要件となっています。

寄生虫検出には、顕微鏡検査、画像検査、血清学、分子技術などのさまざまな方法が採用されています。ELISA は血清学的診断を提供しますが、感度は低くなります⁵。分子法は感度と特^異性6に優れていますが、日常的なスクリーニングには複雑でコストがかかります。糞便サンプル中の卵の直接同定により診断が確定し、Kato-Katzは費用対効果の高い^{従来の方法7,8}ですが、集団スクリーニ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
自動糞便分析装置(FA280S)ソフト	オリエンター	v.1.028(RecoV2.9.14)	自動糞便分析装置(FA280S)システムのソフトウェア
濃縮洗浄液	オリエンター		パイプライン洗浄に最適
カバー グラス	セイルブランド		試料を損傷や汚染から保護します。
使い捨てプラスチックストロー	南通Lingkeバイオテクノロジー		生理食塩水の吸引に使用される使い捨てプラスチックストロー
FA280S	オリエンター	A022201035	全自動糞便分析
装置 フラッシングフルード	オリエンター	Q/WWT-019-2021	全自動糞便分析装置のフラッシングパイプラインが製造されました
顕微鏡	OLYMPUS	3H51278	細胞の観察
顕微鏡スライド		WS-7101	顕微鏡下での検査のために、安定した平坦な表面を提供します。
サンプル希釈剤	オリエンター	四川栄機械 20150025	便サンプルの希釈に適しています
サンプルラック	オリエンター		ローディングラック
サンプルチューブ	オリエンター	四川栄機械 20200204	糞便コレクター
クロエイドナトリウム注射	広東大翔製薬株式会社	H14020786	希釈
SPSS 統計ソフトウェア	IBM	SPSS Statistics 22.0	様々な研究・分析作業に対応
木の棒			糞便サンプルを適量採取するために使用される使い捨ての木の棒。