過剰なグルーミング表現型の評価のための ショウジョウバエメラノガスター グルーミング行動の定量化

Summary

ここで紹介する方法は、特定のグルーミング行動のために Drosophila melanogaster から取得した映像の手動注釈を含む。これにより、グルーミングの発作の数とグルーミングに費やされた全体的な時間の両方を定量化して、非定型の自己グルーミング表現型を評価できます。

Abstract

ステレオタイプ化されたグルーミングの観察可能な変化は、モデル生物に並進的に適用されます。これらの変化は、人間の行動に同様の逸脱を引き起こす病状の代表です。たとえば、過度のグルーミングは、トゥレット症候群や強迫性障害などの状態に存在する強迫行動や強迫行動の代理として機能します。提示されたグルーミングアッセイは、 ショウジョウバエメラノガスターの異常な自己グルーミング表現型の評価を可能にします。ハエは10分間記録され、これらの記録は観察され、以前に定義されたグルーミング行動についてブラインドで注釈が付けられます。グルーミングの頻度とセルフグルーミングに費やした時間の両方の定量的測定は、映像に手動で注釈を付けることで取得できます。このアッセイは比較的安価で、実験室環境でまだ利用できない材料をほとんど必要とせず、グルーミングの観察を目的とした特定の研究の特定のニーズに合わせて簡単に適応できます。さらに、コンピュータサイエンスを多用する自動化法と比較して、アッセイの実行に必要なスキルのレベルが低いため、このプロトコルは小規模な研究室や学生に適しています。このアッセイを実行するために必要な手順と、現在の制限について詳しく説明します。

Introduction

ショウジョウバエ・メラノガスター は、行動学および神経生物学的研究において確立されたモデル生物であり、類似したヒトの行動を駆動するメカニズムについての洞察を提供します。この生物の自己グルーミングは、高度に規制され、明確に定義された行動であり、互いに簡単に区別できるステレオタイプのパターンに従います¹。ハエが示す別々のグルーミング行動は、一般に解剖学的領域²によって分類でき、最も簡単に後部または前部として定義できます。 ショウジョウバエの グルーミングは、最初は前部に焦点を当て、その後、後端³に移行します。典型的な条件下では、ハエは清潔さを維持するために(例えば、ほこりを取り除くことによって)グルーミング行動を示し、病原性微生物⁴のような潜在的に有害な外部刺激への曝露に反応して発生します。

グルーミング行動の異常、特に自発的な強迫的なグルーミングは、強迫行動および/または強迫行動の指標としてさまざまなモデルシステムで使用されてきました。げっ歯類、鳥類、イヌ科などの生物における強迫的なグルーミング行動を観察した翻訳的知見は^{、ヒトにおける}同様の強迫行動を誘発する条件についての洞察を与えている5。これらには、抜毛症、強迫性障害、トゥレット症候群⁶などの状態が含まれます。過度のグルーミング行動は、Drosophila melanogasterの同様の神経発達状態のモデルにおける行動表現型を評価する際のベンチマークとしても使用されています。強迫的なグルーミング行動は、Fragile-X症候群(FSX)および関連する自閉症スペクトラム障害(ASD)のハエモデルで観察されています。過剰な自発的なグルーミングは、ASDおよびFSX関連遺伝子FMR1⁷のオルソログであるdfmr1の突然変異の下で発生します。さらに、これらの変異体では、後端と前端の間のグルーミング分布に顕著な変化があります⁸。これらの変化は、これらの状態の一部の患者が示す強迫的で強迫的な身体に焦点を当てた行動を反映していると解釈されます。本明細書に記載のグルーミングアッセイを用いて、我々は、市販のGAL4ドライバーおよびUAS−RNAi系統⁹により産生されたショウジョウバエ遺伝子Atg8aのRNAi媒介ノックダウン後のハエにおけるグルーミング挙動を観察した。

この方法では、特定のグルーミング行動のためにハエを撮影した映像に手動で注釈を付けます。染料のような間接的な方法を使用するようなグルーミング行動の評価を目的とした以前の研究では、グルーミングの有効性を定量化するのには効果的ですが、グルーミングの持続時間や頻度を測定することはできません¹⁰。しかし、このアッセイでは、 ショウジョウバエ のグルーミングの頻度と期間を、一般的にも解剖学的領域ごとにも定量化することができます。ここで詳述する方法は、簡単に変更でき、計算のバックグラウンドを持たない個人でも実施できるため、現在の自動化方法に比べていくつかの利点があります。必要な機器がほとんどの研究室で簡単に入手できるため、過剰な自己グルーミング表現型の存在を評価するための費用対効果の高い方法を提示します( 資料の表を参照)。これにより、この方法は主に学部の教育機関に容易にアクセスでき、トレーニング環境や教育ラボに容易に適応できます。

Protocol

注: プロトコルの概要を 図 1 に示します。

1. 撮影準備

1. 4つの3ウェル皿を白い面に並べて置き、それぞれをスライドガラスで覆います。
2. カメラ(ここではRaspberry Piシステムですが、高解像度ビデオが可能なカメラで十分です)を皿の上に配置します。
   1. すべての料理がフレーム内にあり、ピントが合っていることを確認してください。
   2. スライドにまぶしさがあって、皿の中のハエの視認性が制限されていないことを確認してください。プレートの位置を調整したり、録画スペースの照明を暗くしたりして、まぶしさを解消します。
   3. 高解像度 (最小 1920 x 1080 ピクセル) を使用して、ハエの手足を正確に視覚化します。
3. 録画が行われているベンチの皿とカメラの位置をマークします。
   注意: これにより、装置の将来の使用でステップ2に費やす時間が制限されます。アッセイを同時に同じ空間で実施することで、意図した操作を超えた要因に基づく挙動のばらつきを抑えることができます。
4. パラフィルムとペーパータオルで覆われた氷のブロックの上で、4〜9日齢のハエを冷やして軽く麻酔します(CO₂ 麻酔は行動に大きな影響を与えます)。
   1. ハエをブロックに軽くたたいて、麻酔をかけたら、絵筆を使ってできるだけ早くハエを観察室に移動します。
      注:あらゆる種類の麻酔に過度にさらされるとハエに悪影響を与える可能性があるため、この転送はできるだけ早く行う必要があります。
5. 各ウェルに1匹のフライを置きます。
6. 麻酔後 30 分間、ファイルが新しい環境に順応できるようにします。この時点以降は、ストレス要因が加わると行動に影響を与えるため、ハエが生息する井戸に触れたり、邪魔したりしないでください。

2.ハエの記録

1. 30分間の順応後、カメラを使用してハエを記録します。
2. Raspberry PiカメラをPiSpy¹¹ で実行して、行動データ収集を行います。
   注:このソフトウェアは無料でGitHub(https://github.com/gpask/PiSpy)で入手でき、Piシステムは300ドル未満で簡単にセットアップできます。他のカメラ(すでに利用可能な場合)も、映像を録画するのに十分です
3. Piで録音を開始するには、以下のコマンドフローを使用します。
   1. ターミナルを開き、 cd PiSpyと入力します。次に、「 python3 PiSpy.py」と入力し、目的の録画時間を入力して、目的のフレームレートを入力します。目的の解像度を選択し、[ クイックキャプチャ]をクリックします。
   2. プレビューカメラ機能を使用して、ハエにピントが合い、十分に見えることを確認します。
4. ハエを24fpsの推奨フレームレートで10分間記録し、ファイルを保存します(PiSpyは自動的にビデオフォルダに保存されます)。

3. ビデオ解析(図2)

1. ビデオを分析するには、ファイルをElan 6.8ソフトウェア¹²にインポートします。
   注:このソフトウェアは、もともとビデオの詳細な注釈付けとグルーミング行動の詳細な分析のための心理言語学の獣脂のために開発されました
2. 下図のように各行を割り当てて、個々の映像に手動で注釈を付けます。
   1. これを行うには、次のコマンド フローを使用します: Tier > Add 新しい Tier > Type の [Location in the dish in the dish on Tier Name (Tier 新しい Tier Type Location in the dish on Tier Name (Tier 新しい Tier Type Type Location)] の [Tier Name (> 追加)] を選択します。
3. 研究のニーズに応じて、さまざまな特定の行動(前方および後方のグルーミング、歩行、睡眠、立っている)を記録し、定量化します。
   1. 以下の手順に従って注釈を付けます。
      1. 注釈を付ける層をダブルクリックします。右クリックして、選択したティアに沿ってカーソルをドラッグし、1回のグルーミング試合が見られる期間使用します。左クリックし、[ 新しい注釈 ] を選択し、新しく強調表示された期間をダブルクリックします。その時点で示した動作の省略形を入力します。
   2. ビデオをゆっくりと観察し、マウスでビデオをこすり洗いし、注釈を付けます。アノテーション中に1つのフライウェルにズームインして、行動の誤識別を防ぎます。これには、フライでグラスの端を叩いたり、足をずらしたりすることが含まれますが、最初はグルーミングのように見えるかもしれません。
4. ビデオに完全に注釈が付けられたら、各動作の内訳を取得します。この機能を使用するには、ビデオ全体で同じ省略形または注釈が使用されていることを確認してください。
   注:Elan 6.8は、動作が発生する回数、動作の合計時間、および各動作に費やされた平均時間を提供します。
   1. グルーミングの発作を2秒間の中断のないグルーミングと定義します。観察された各動作を次のように特定します。アッセイの実施前に、解剖学的領域のパラメータを定義します。
      1. 前方グルーミング:フライボディの前部で行われるグルーミングを前方グルーミングと特定します。
         注:この動作は、ほとんどの場合、ハエの前部2本の脚で、頭やテングなどの前部をこすります。
      2. 後方グルーミング:フライボディの前後端で行われるグルーミングを後方グルーミングと特定します。
         注:さらに、簡単にするために、翼は後部に含まれていました。この動作には、ほとんどの場合、中央と最も後方の脚のセットをその場でこする動きが含まれます。後方グルーミングが発生していることを示す良い指標は、 図2Dに示すように、一見すると、ハエが最も後足を失っているように見えることです。

Results

このアッセイは、注釈付きの映像からグルーミング行動の時間と頻度を測定する定量的データを生成します。セットアップの代表的なイメージと動作の定義方法を 図 2 に示します。ビデオ分析によってもたらされる主観性を考えると、ビデオのすべての注釈は、分析を実行する研究者に対して盲検化されるべきです。

この方法は、ショウジョウバエ遺伝子Atg8aがグルーミング行動の発達に果たす役割を評価するために使用されました。Atg8aは、一部のトゥレット症候群(TS)患者で発現が低下しているヒト遺伝子GABARAPと相同である⁹。TSは、チックとして知られる不随意運動と発声を特徴とする状態であり、一般的に強迫行動/強迫行動を誘発する他の状態と併存しています¹³。私たちは、この発現の減少がこの神経発達疾患の発症にどのように影響するかを理解するために、TSや他の神経発達モデルに共通する...

Discussion

全体として、この簡単に実行可能で費用対効果の高いアッセイにより、 ショウジョウバエのメラノガスター グルーミング行動の堅牢な特性評価が可能になります。この手法により、以前に特定された多数のグルーミング行動の頻度、関与に費やした時間、および解剖学的分布についての洞察が得られます。グルーミングが行われる、または進行中であることを示す良い指標は、脚の配置の変更、特に6本の脚のいずれかを上げることです。脚を動かした後の行動に特に注意することは、グルーミング行動を特定するのに役立ちます。このアッセイにより、一般的なトータルグルーミングから、ハエの翼、頭、脚を標的とする解剖学的領域に特有のステレオタイプのグルーミング行動まで、行動のアノテーションが可能になります。これらはいずれも、研究のニーズに合わせて含めることも無視することもできます。ここで提供する代表的なデータでは、トゥレット症候群などの神経発達状態に関連する強迫行動の代表的な尺度として、強迫的なグルーミングを使用しています。歩行パターン、睡眠時間、皿内での転倒頻度に関する情報など、他のデータも収集される場合...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
16GBマイクロSDカード	Adafruit	1294	OS導入用
ディスプレイ	Adafruit	3578	HDMIまたはフレックスケーブルで接続可能なディスプレイなら何でも十分
ショウジョウバエ Atg8a-RNAi UASライン	ブルーミントンストック	センター34340	代表データに使用したライン 代表データに使用した
ショウジョウバエ Ok6 Driver	N/A	代表	データに使用したライン
スライドガラス	フィッシャーサイエンティフィック	12-550-A3	ハエを封じ込める
ヒートシンク	Adafruit		コンピュータの過熱を防ぐ
レンズ	Adafruit	4563	HDカメラのみで使用
PiCamera	Adafruit	4561	ここではHDバージョンを使用しましたが、予算の制約の下で標準カメラを使用できます
Raspberry pi 4	Adafruit	4292	コンピュータ PiSpyは
Ribbionケーブル	上で動作します Adafruit	1648	カメラとディスプレイ
SBコンポーネントの	Adafruit	4301	コンピュータ
を保護します スポットプレート	フィッシャーサイエンティフィック	S99406	パイレックスのバージョンはすでに私たちの使用に利用可能でしたが、細胞培養皿やプラスチックスポットプレートでも十分です
脚	ベストバイ	6355959	カメラの吊り下げと位置決めには、これが可能な任意の装置で十分です
USB C 電源	Adafruit	1995	コンピューターに電力を供給します