過剰なグルーミング表現型の評価のための ショウジョウバエメラノガスター グルーミング行動の定量化

サマリー

ここで紹介する方法は、特定のグルーミング行動のために Drosophila melanogaster から取得した映像の手動注釈を含む。これにより、グルーミングの発作の数とグルーミングに費やされた全体的な時間の両方を定量化して、非定型の自己グルーミング表現型を評価できます。

要約

ステレオタイプ化されたグルーミングの観察可能な変化は、モデル生物に並進的に適用されます。これらの変化は、人間の行動に同様の逸脱を引き起こす病状の代表です。たとえば、過度のグルーミングは、トゥレット症候群や強迫性障害などの状態に存在する強迫行動や強迫行動の代理として機能します。提示されたグルーミングアッセイは、 ショウジョウバエメラノガスターの異常な自己グルーミング表現型の評価を可能にします。ハエは10分間記録され、これらの記録は観察され、以前に定義されたグルーミング行動についてブラインドで注釈が付けられます。グルーミングの頻度とセルフグルーミングに費やした時間の両方の定量的測定は、映像に手動で注釈を付けることで取得できます。このアッセイは比較的安価で、実験室環境でまだ利用できない材料をほとんど必要とせず、グルーミングの観察を目的とした特定の研究の特定のニーズに合わせて簡単に適応できます。さらに、コンピュータサイエンスを多用する自動化法と比較して、アッセイの実行に必要なスキルのレベルが低いため、このプロトコルは小規模な研究室や学生に適しています。このアッセイを実行するために必要な手順と、現在の制限について詳しく説明します。

概要

ショウジョウバエ・メラノガスター は、行動学および神経生物学的研究において確立されたモデル生物であり、類似したヒトの行動を駆動するメカニズムについての洞察を提供します。この生物の自己グルーミングは、高度に規制され、明確に定義された行動であり、互いに簡単に区別できるステレオタイプのパターンに従います¹。ハエが示す別々のグルーミング行動は、一般に解剖学的領域²によって分類でき、最も簡単に後部または前部として定義できます。 ショウジョウバエの グルーミングは、最初は前部に焦点を当て、その後、後端³に移行します。典型的な条件下では、ハエは清潔さを維持するために(例えば、ほこりを取り除くことによって)グルーミング行動を示し、病原性微生物⁴のような潜在的に有害な外部刺激への曝露に反応して発生します。

グルーミング行動の異常、特に自発的な強迫的なグルーミングは、強迫行動および/または強迫行動の指標としてさまざまなモデルシステムで使用されてきました。げっ歯類、鳥類、イヌ科などの生物における強迫的なグルーミング行動を観察した翻訳的知見は^{、ヒトにおける}同様の....

プロトコル

注: プロトコルの概要を 図 1 に示します。

1. 撮影準備

1. 4つの3ウェル皿を白い面に並べて置き、それぞれをスライドガラスで覆います。
2. カメラ(ここではRaspberry Piシステムですが、高解像度ビデオが可能なカメラで十分です)を皿の上に配置します。
   1. すべての料理がフレーム内にあり、ピントが合っていることを確認してください。
   2. スライドにまぶしさがあって、皿の中のハエの視認性が制限されていないことを確認してください。プレートの位置を調整したり、録画スペースの照明を暗くしたりして、まぶしさを解消します。
   3. 高解像度 (最小 1920 x 1080 ピクセル) を使用して、ハエの手足を正確に視覚化します。
3. 録画が行われているベンチの皿とカメラの位置をマークします。
   注意: これにより、装置の将来の使用でステップ2に費やす時間が制限されます。アッセイを同時に同じ空間で実施することで、意図した操作を超えた要因に基づく挙動のばらつきを抑えることができます。
4. パラフィルムとペーパータオルで覆われた氷のブロックの上で、4〜9日齢のハエを冷やして軽く....

結果

このアッセイは、注釈付きの映像からグルーミング行動の時間と頻度を測定する定量的データを生成します。セットアップの代表的なイメージと動作の定義方法を 図 2 に示します。ビデオ分析によってもたらされる主観性を考えると、ビデオのすべての注釈は、分析を実行する研究者に対して盲検化されるべきです。

この方法は、ショウジョウバエ遺伝子Atg8aがグルーミング行動の発達に果たす役割を評価するために使用されました。Atg8aは、一部のトゥレット症候群(TS)患者で発現が低下しているヒト遺伝子GABARAPと相同である⁹。TSは、チックとして知られる不随意運動と発声を特徴とする状態であり、一般的に強迫行動/強迫行動を誘発する他の状態と併存しています¹³。私たちは、この発現の減少がこの神経発達疾患の発症にどのように影響するかを理解するために、TSや他の神経発達モデルに共通する.......

ディスカッション

全体として、この簡単に実行可能で費用対効果の高いアッセイにより、 ショウジョウバエのメラノガスター グルーミング行動の堅牢な特性評価が可能になります。この手法により、以前に特定された多数のグルーミング行動の頻度、関与に費やした時間、および解剖学的分布についての洞察が得られます。グルーミングが行われる、または進行中であることを示す良い指標は、脚の配置の変更、特に6本の脚のいずれかを上げることです。脚を動かした後の行動に特に注意することは、グルーミング行動を特定するのに役立ちます。このアッセイにより、一般的なトータルグルーミングから、ハエの翼、頭、脚を標的とする解剖学的領域に特有のステレオタイプのグルーミング行動まで、行動のアノテーションが可能になります。これらはいずれも、研究のニーズに合わせて含めることも無視することもできます。ここで提供する代表的なデータでは、トゥレット症候群などの神経発達状態に関連する強迫行動の代表的な尺度として、強迫的なグルーミングを使用しています。歩行パターン、睡眠時間、皿内での転倒頻度に関する情報など、他のデータも収集される場合.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
16GBマイクロSDカード	Adafruit	1294	OS導入用
ディスプレイ	Adafruit	3578	HDMIまたはフレックスケーブルで接続可能なディスプレイなら何でも十分
ショウジョウバエ Atg8a-RNAi UASライン	ブルーミントンストック	センター34340	代表データに使用したライン 代表データに使用した
ショウジョウバエ Ok6 Driver	N/A	代表	データに使用したライン
スライドガラス	フィッシャーサイエンティフィック	12-550-A3	ハエを封じ込める
ヒートシンク	Adafruit		コンピュータの過熱を防ぐ
レンズ	Adafruit	4563	HDカメラのみで使用
PiCamera	Adafruit	4561	ここではHDバージョンを使用しましたが、予算の制約の下で標準カメラを使用できます
Raspberry pi 4	Adafruit	4292	コンピュータ PiSpyは
Ribbionケーブル	上で動作します Adafruit	1648	カメラとディスプレイ
SBコンポーネントの	Adafruit	4301	コンピュータ
を保護します スポットプレート	フィッシャーサイエンティフィック	S99406	パイレックスのバージョンはすでに私たちの使用に利用可能でしたが、細胞培養皿やプラスチックスポットプレートでも十分です
脚	ベストバイ	6355959	カメラの吊り下げと位置決めには、これが可能な任意の装置で十分です
USB C 電源	Adafruit	1995	コンピューターに電力を供給します

接続に使用するため ケース 三