方法論記事

エバポレイト光散乱検出器と組み合わせた液体クロマトグラフィーによる脂質ナノ粒子RNA送達系の4成分の決定

DOI：

10.3791/67711

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2025年5月30日

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1Shimadzu (China) Co., Ltd., 2Medical College of Fudan University

この記事について

サマリー

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本研究では、高速液体クロマトグラフィーと蒸発光散乱検出器(ELSD)を組み合わせた脂質ナノ粒子(LNP)RNAデリバリーシステムにおける4成分の定量分析法を確立します。この方法は、良好な分離、高感度、および高効率を備えています。

要約

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この記事では、脂質ナノ粒子(LNP)成分の分析方法を紹介します。LNPは、RNAベースの医薬品の極めて重要なベクターとして機能し、主にコレステロール、修飾付きPEG、イオン化可能脂質、およびヘルパー脂質で構成されています。これらの成分は極性が弱いため、逆相クロマトグラフィーでは強い保持力と分離が困難になるだけでなく、明確な紫外線吸収特性も欠如しています。この課題に対処するために、液体クロマトグラフィーシステムと蒸発光散乱検出器(ELSD)が組み合わされました。クロマトグラフィーカラムの種類を体系的に調整し、移動相のグラジエント溶出プログラムを最適化することで、4 つの重要な成分のベースライン分離を迅速かつ完全に達成しました。最新のELSD技術を活用することで、検出感度が大幅に向上し、メソッドの線形範囲が拡大しました。実験結果から、5 μg/mL から 250 μg/mL の濃度範囲内で、LNP の 4 つの成分は優れた直線性を示し、相関係数はすべて 0.999 を超え、精度は 94.2% から 108.0% の範囲であることが示されました。精密実験では、10 μg/mL 標準溶液の保持時間とピーク面積の相対標準偏差は、それぞれ 0.1% と 2% 未満でした。この分析法を使用してさまざまなLNPサンプルを分析すると、すべての成分がうまく分離され、それぞれの含有量が正確に定量化されるため、この分析アプローチの堅牢な適応性が強調されています。

概要

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脂質ナノ粒子(LNP)は、最も先進的な非ウイルス性遺伝子送達システムの1つであり、主にアンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ヌクレオチド、mRNAなどの核酸薬物の送達に使用されます1,2,3。LNPは一般に、イオン化可能な脂質、ポリエチレングリコール(PEG)修飾脂質、リン脂質、コレステロールの4つの成分で構成されています。その主要な成分はイオン化可能な脂質であり、これは核酸薬物送達の効率を決定する要因です。他の3つの成分は、LNPの安定性を高め、免疫系の認識を低下させることができます4,5,6。

LNP中の4つの成分の比率が異なると、ナノ粒子の自己組織化プロセスに大きな影響を与え、医薬品有効成分(API)のカプセル化効率、その送達効率、in vivoでの放出速度などの特性に影響を与える可能性があります7,8,9。したがって、LNP成分の定量分析法を確立し、それにより最適なLNP送達システム10,11の合成を促進することが不可欠である。

高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、医薬品分析で広く採用されている最新の分析技術であり、その高い効率、感度、および自動化機能で高く評価されています。HPLCには、従来の紫外線(UV)検出器のほか、屈折率検出器(RID)、蒸発光散乱検出器(ELSD)、荷電化粒子検出器(CAD)、高選択性無線周波数(RF)検出器などの汎用検出器など、さまざまな検出器が含まれます12。

LNPの4つの成分が明確な紫外線吸収基を欠いているため、UV検出器では応答が得られないという解析では、汎用検出器の使用が検討されました。RIDはそのようなオプションの1つですが、グラジエント分析には適しておらず、他の2つの汎用検出器と比較して感度が比較的低くなっています。したがって、それは選ばれませんでした12.さらに、CAD検出器は高感度を誇っていますが、その法外なコストにより魅力が損なわれています12。

その結果、ELSD検出器が選択されました。この検出器は、高濃度成分と微量成分の両方の同時分析を可能にする独自のゲインモードオプション「ワイド」を備えており、感度を高め、線形範囲を拡大します。

本稿では、ELSDと組み合わせたHPLCシステムを採用し、クロマトグラフィーカラムの最適化、移動相のグラジエント溶出、およびその他の条件を通じて、LNPの4成分の効率的な分離と定量分析を達成しています13。

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プロトコル

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1. 楽器の準備

  1. 機器のセットアップ
    1. ELSDと組み合わせたHPLCシステムをセットアップします。
  2. コラムの取り付け
    1. クロマトグラフィーカラム(C4-300、150 mm×内径4.6 mm、5 μm)をカラムの矢印方向に、一方の端をオートサンプラー出口に、もう一方の端をELSD入口に接続した状態で取り付けます。
  3. 移動相調製
    1. 移動相:A相、10 mM TEAA水溶液(pH = 7.0)、およびB相、10 mM TEAAメタノール溶液(pH = 7.0)を調製します。
    2. A相を調製するには、トリエチルアミン1.01gを正確に秤量し、1000mLの水に溶かしてよく混合し、酢酸でpHを7.0に調整します。
    3. B相を調製するには、メタノール1000mLにトリエチルアミン1.01gを溶解して混合し、酢酸とpHを7.0に調整します。
  4. メソッド編集
    1. LC-ELSDの各モジュールの電源スイッチをオンにし、 LabSolutions ソフトウェアを起動します。次に、[ リアルタイム解析 ] ウィンドウを開きます。
    2. 「ファイル」をクリックし、「新規」を選択して、新しいメソッドファイルを作成します。メソッドの LC Stop Time を 15 に変更し、Apply to all Acquisition Time をクリックします。
    3. 次に、[ ポンプ ]をクリックしてポンプパラメータを変更します。分析モードとしてバイナリ高圧 グラジエント (B.GE)を選択し、流速を1.0 mL/minに設定します。
    4. 次に、ポンプ B の初期濃度(%B)を 80% に設定し、移動相のグラジエントを変更します(3 分で %B は 80%、4 分では 5.5 分から 12 分まで %B は 85%、%B は 100%、12.1 分で %B は 80% に戻ります。
    5. 次に、 Column Oven をクリックし、オーブンの温度を55°Cに設定します。 最後に、[ ELSD ]をクリックして、ドリフトチューブの温度を40°Cに変更します。 メソッドを保存します。
      注: パラメータの概要を 表 1 に示します。
  5. 装置を始動し、平衡化します。
    1. [ダウンロードと起動]をクリックして、機器を開始し、平衡化します。

2. 標準溶液とサンプルの調製

  1. 標準溶液の調製
    1. LNP成分標準物質4種をそれぞれ10.0 mg精密に秤量し、メタノール1 mLに溶解し、完全に溶解するまでボルテックスして、各成分10 mg/mLの濃度の原液を得てください。
    2. ピペットを使用して、4つのストック溶液それぞれ100 μLをサンプルバイアルに正確に移し、600 μLのメタノールを加えます。十分に混合して、濃度1000 μg/mLの混合中間溶液1を調製します。
    3. 4つのストック溶液それぞれ20 μLをサンプルバイアルに正確に移し、920 μLのメタノールを加えます。十分に混合して、濃度200μg/mLの混合中間溶液2を調製します。
    4. 次に、 表2に従って、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、および250 μg/mLの濃度で一連の標準溶液を調製します。
  2. サンプル調製
    1. ピペットを使用して、100 μLのサンプルをサンプルバイアルに正確に移し、900 μLのメタノールを加えてよく混合します。この時点で、サンプル中のLNP濃度が10倍に希釈され、LNPが核酸薬物から解離していることを確認してください。

3. データ取得

  1. 標準溶液とサンプル溶液を液体クロマトグラフのオートサンプラーに入れます。
  2. Realtime AnalysisウィンドウのアシスタントツールバーでRealtime Batchをクリックします。次に、[ファイル] メニューの [新規] をクリックして、新しいバッチ テーブルを作成します。
  3. バッチテーブルに、標準溶液とサンプル溶液のVial#、トレイ名、データファイル、注入量を入力し、ステップ1.4で保存したメソッドファイルを選択します。「ファイル」メニューの「バッチ・ファイルの保存」をクリックして、バッチ・ファイルを保存します。
  4. 液体クロマトグラフの圧力とクロマトグラムのベースラインが安定するまで待ちます。次に、アシスタントツールバーの「 リアルタイムバッチを開始 」をクリックして、データ取得を開始します。

4. データ分析

  1. 検量線の確立
    1. LabSolutionsソフトウェアのブラウザウィンドウを開き、標準溶液データを定量結果ビューにドラッグして、検量線を確立します。次に、データ処理パラメータを変更します。メソッドビューで「Edit」をクリックします。
    2. [積分パラメータ]ウィンドウで、勾配値を10000に変更します。次に、[Identification Parameters] で [Identification Method] を [Band] に変更し、[Default Bandwidth] を 0.1 分に設定します。
    3. その後、 定量的パラメータを変更します。 Quantitative Method を External Standardに変更し、 Calibration Levelの# を7に設定します。検量線のタイプとして[ 指数関数的]を選択します。次に、 コンパウンドを修正します。
    4. 4つのLNP成分の名称と標準溶液濃度を入力します。ピーク頂点をダブルクリックして、保持時間を更新します。最後に、[ 表示 ] をクリックして、データ処理パラメーターの変更を完了します。
    5. [Quantitative Results] ビューのサンプル タイプを [Standard (Calc. Point)] に変更します。濃度に応じて、標準溶液のレベルを1〜7に設定します。検量線が確立されたら、メニューバーのFileをクリックし、メソッドファイルを保存します。
  2. サンプルの定量分析
    1. サンプルのデータをブラウザウィンドウの Quantitative Results Viewにドラッグすると、サンプル中の4つのLNPコンポーネントの濃度結果が表示されます。

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結果

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この分析法によるLNP標準液の分析により、4成分の分離度が1.5を超え、ベースライン分離が実現しました。さらに、 図 1 に示すように、高濃度の標準溶液には残留物は観察されませんでした。検量線は 5 〜 250 μg/mL の濃度範囲内で設定され、相関係数はすべて 0.999 を超え、広い線形範囲と優れた直線性が示されました。検量線を 図2に示します。

この分析法の再現性を調べるために、濃度 10 μg/mL の標準溶液を 6 回繰り返し注入し、分析しました。保持時間の相対標準偏差(RSD)は0.1%未満、ピーク面積のRSDは2%未満であり、高い再現性を示しました。対応するクロマトグラムを 図 3 に示します。

実際のLNPサンプルの分析では、サンプルをメタノールで10倍に希釈して、薬物からのLNPの解離を促進しました。その後、LNP中の4つの成分の...

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ディスカッション

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LNPの4つの成分はすべて、比較的弱い極性を示します。C18 カラムを使用して分析すると、ターゲット化合物はカラム内で強く保持され、強く保持された成分のリン脂質ピークが広がります。さらに、高濃度溶液を分析した後、C18カラムのヘッドに残留物が蓄積するため、定量の精度が低下する可能性があります。クロマトグラムを 図5に示します。

この分析法を最適化するために、代わりに疎水性が弱いC4カラムを選択しました。この選択は、ターゲット化合物とクロマトグラフィーカラムとの間の相互作用力を低減し、分析時間を短縮することを目的としていました。さらに、最適化された分析法では、システム内の高濃度標準試料からの残留物は検出されませんでした。この実験では、特に生物学的サンプル用のC4カラムを使用しました。このカラムは、シャープで対称的なピーク形状の高分離クロマトグラムが得られるため、分析した成分の分離効率が向上します。

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開示事項

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著者は何も開示していません。

謝辞

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実験用のLNPサンプルを提供してくださったバイオ医薬品企業に感謝するとともに、クロマトグラフィーカラムを提供してくださった島津製作所(上海)グローバルラボ消耗品有限公司に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
酢酸ANPELラボラトリーテクノロジーズ(上海)Inc.CAEQ-4-000319-0050
バランス津製作所(上海)グローバルラボ消耗品AP135W
コラム(上海)グローバルラボ消耗品有限公司シムネックス WP C4(380-01235-74)
ELSD島津製作所(中国)有限公司ELSD-LT III(228-65900-46)
LabSolutionsソフトウェア津製作所(中国)有限公司
島津製作LC (China) CO.,LtdLC40D XR
メタノールANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-003302-4000
ピペット-100µL島津製作所(上海)グローバルラボ消耗品有限公司00-NAR-100
ピペット-1000 & マイクロ;L島津製作所(上海)Global Laboratory Consumables Co.,Ltd00-NAR-1000
TEAANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-012190-0250
超純水システムミリポアZIQ7000T0C
ボルテックスミキサーANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.VM-Bの
島有限公司 島津製作所 島所

参考文献

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  1. Zong, Y., Lin, Y., Wei, T., Cheng, Q. Lipid nanoparticle (LNP) enables mRNA delivery for cancer therapy. Adv Mater. 35 (51), e2303261(2023).
  2. Vlatko, I., et al. Non-immunotherapy application of LNP-mRNA: Maximizing efficacy and safety. Biomedicines. 9 (5), 530(2021).
  3. Eygeris, Y., et al. Chemistry of lipid nanoparticles for RNA delivery. Acc Chem Res. 55 (1), 2-12 (2021).
  4. Sun, D., Lu, Z. R. Structure and function of cationic and ionizable lipids for nucleic acid delivery. Pharm Res. 40 (1), 27-46 (2023).
  5. Rebecca, L., et al. Lipid nanoparticle formulations for enhanced co-delivery of siRNA and mRNA. Nano Lett. 18 (6), 3814-3822 (2018).
  6. Maugeri, M., Nawaz, M., Papadimitriou, A. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nat Commun. 10, 4333(2019).
  7. Renee, C., et al. The effects of PEGylation on LNP based mRNA delivery to the eye. PLoS One. 15 (10), e0241006(2020).
  8. Benedicto, E., et al. Optimization of phospholipid chemistry for improved lipid nanoparticle (LNP) delivery of messenger RNA (mRNA). Biomater Sci. 10 (2), 549-559 (2022).
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  10. Melissa, P., et al. Optimization of lipid nanoparticles for the delivery of nebulized therapeutic mRNA to the lungs. Nat Biomed Eng. 5 (9), 1059-1068 (2021).
  11. Packer, M., et al. A novel mechanism for the loss of mRNA activity in lipid nanoparticle delivery systems. Nat Commun. 12 (1), 6777(2021).
  12. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Dolan, J. W. Introduction to Modern Liquid Chromatography. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2010).
  13. Zhang, L. Z., et al. Effect of mRNA-LNP components of two globally marketed COVID-19 vaccines on efficacy and stability. NPJ Vaccines. 8 (1), 156(2023).
  14. Zhang, Y., Wang, X. Performance comparison of different ELSD detectors in pharmaceutical analysis. Anal Methods. 7 (12), 4800-4807 (2015).

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