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方法論記事

アデノ随伴ウイルスベクターの低速逆行性腎盂注射 による マウス腎臓への効果的かつ安全な遺伝子送達

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DOI:

10.3791/67716

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2025年8月1日

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1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University, 3Division of Neuroscience, Oregon National Primate Research Center

この記事について

サマリー

このレポートでは、マウス腎臓への効果的かつ安全な遺伝子導入のための腎盂 を介した AAV ベクターの局所注射方法について詳しく説明します。

要約

腎臓への遺伝子送達のための効果的な in vivo ツールと方法の開発は、腎臓病の基礎腎臓研究と遺伝子治療を進めるために非常に重要です。さらに、高度な遺伝子検査によって単一遺伝子腎臓病に対する意識が高まっていることから、治療が困難な遺伝性腎臓病の治療、さらには治癒する遺伝子治療の可能性が浮き彫りになっています。この点で、アデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターは、 in vivo 遺伝子送達のための堅牢なプラットフォームとしてますます注目を集めています。しかし、腎臓内の治療的に関連する各細胞型へのAAVベクター媒介遺伝子送達の最も効果的かつ最も安全な方法はまだ完全には確立されていません。ここでは、AAVベクターの低速逆行性腎盂(RP)注射の方法が詳細に説明され、適切に選択されたAAVキャプシドと併用した場合にマウス腎臓を形質導入するその高い可能性が実証されます。さらに、この方法は、標準的な塩化セシウム超遠心精製AAV(CsCl AAV)ベクターだけでなく、遠心限外ろ過されたAAV(CU AAV)ベクターミニプレップでも有効であることが示されており、AAVベクターの専門知識を必要としない技術を使用して迅速かつ簡単に調製できます。一例として、この研究は、CsClとCU AAV-KP3ベクターの両方のゆっくりとしたRP注射が、必然的に組織損傷につながる以前に報告された流体力学的アプローチとは異なり、明らかな組織損傷なしにマウス腎臓の近位尿細管の堅牢な形質導入をもたらすことを示しています。したがって、この研究は、選択されたAAVキャプシド由来ベクターのゆっくりとした逆行性RP注射が、腎臓への遺伝子送達のための効果的かつ安全な方法であることを強調しています。この方法は、遺伝子治療研究を含む幅広い腎臓研究に適用できます。CU AAVベクターミニプレップを使用すると、スループットが大幅に向上し、予備データの生成と重要な洞察の取得に必要な時間とコスト効率が向上します。

概要

小型および大型の実験動物における腎臓への遺伝子送達の効果的かつ安全な方法は、基礎腎臓研究を進め、革新的な治療アプローチを模索する重要な機会を提供します。このような方法の確立は、さまざまな腎臓病の遺伝子治療に特に関連しています。臨床遺伝子検査の最近の進歩により、単一遺伝子性腎障害の有病率が以前の推定よりも高く、慢性腎臓病 (CKD) 患者の約 30% が罹患していることが明らかになりました1。CKD は進行性の腎障害を特徴とし、最終的には腎不全に至りますが、真に効果的な疾患修飾療法はありません。血液透析と腎移植は現在利用可能な治療法です。ただし、CKD 患者の生活の質を著しく損なう制限があります2。このように、遺伝性疾患を治療するための臨床的に証明された強力なアプローチである遺伝子治療は、CKD 3,4,5,6 につながる遺伝性腎臓病の効果的な治療のための新しい手段として近年大きな注目を集めています。このアプローチは、病気の根本原因に直接対処し、治療法を提供する可能性があります。

この分野では着実な進歩が進んでいますが、腎臓への遺伝子送達は、研究と治療の両方の現場で依然として重大な課題です。腎臓の複雑な構造と、糸球体内皮細胞、糸球体基底膜、足細胞足突起で構成される糸球体濾過バリアなどの独特の生理学的障壁により、治療遺伝子で腎臓細胞を効率的に標的とすることは困難です。腎臓を標的とした遺伝子送達には、腎皮質 (RC) 直接注射 7,8、腎動脈 (RA) 注射 9,10,11、腎静脈 (RV) 注射 12,13,14、腎盂 (RP) 注射 15,16,17,18,19,20、21、22、23、24、25および静脈内(IV)注射19、26、27、28、29、30ウイルスまたは非ウイルス遺伝子送達ベクター、ならびに超音波およびマイクロバブル媒介核酸送達31,32.これらのアプローチは、形質導入効率または機能的転帰が変動し、多くの場合、調整が困難な一貫性のない結果をもたらしました(参考文献3,33,34,35でレビュー)。腎臓への遺伝子送達はまだ未発達であり、ベクターシステムと方法論を直接比較することは困難です。しかし、高濃度の薬剤を腎臓に直接投与することを容易にする局所送達方法は、一般に全身 IV 送達よりも優れた結果を達成しています。さらに、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターは、その堅牢な安全性プロファイルと臨床翻訳の実績があります36,37、最も研究されており、腎臓遺伝子導入の主要な選択肢と見なされています。

一般的なAAV血清型および改変されたカプシドは、マウス28,30,38へのIV注射後の腎臓におけるメサンギウム細胞および間葉系細胞の効果的な形質導入を実証している。特に、最近の研究では、AAV9のIV投与がネフローゼ症候群およびアルポート症候群のマウスモデルで足細胞を効果的に形質導入できることが示されていますが、この効果は健康な腎臓では観察されません38,39、および操作されたAAV2キャプシドのIV投与は、マウスの健康な腎臓と炎症を起こした腎臓の両方の糸球体内皮細胞のみを標的とすることができます40.歴史的に、尿細管はIV経路を介して形質伝達することが困難でした。しかし、AAV-KP141などの選択されたAAVキャプシドのRP注入は、ベンチマークAAV9キャプシド38で達成されたレベルよりも桁違い高いレベルで近位尿細管の形質導入を達成できることが最近発見されました。さらなる改善が必要ですが、これらの進歩により、基礎腎臓研究と遺伝子治療に新たな道が開かれ、以前は達成できなかった機会がもたらされます。

本稿では、AAVベクターの低速逆行性RP注射が、マウス腎臓への遺伝子送達のための効果的かつ安全な方法として詳述されている38。この技術の代表的な例として、AAV-KP3は、マウス38においてRP注射後のAAV9と比較して腎形質導入の亢進を示した6つのカプシド(すなわち、AAV-KP1、AAV-KP2、AAV-KP341、AAV-DJ42、AAV2G943、AAV2.7m844)の1つであることの発見に基づいて、模範的なキャプシドとして選択されました.特に、ゆっくりとした逆行性RP注射腎臓組織は、以前に報告された流体力学的アプローチで治療されたものとは対照的に、明らかな組織損傷を示さなかった23,24。さらに、迅速かつ簡単な遠心限外ろ過(すなわち、CU AAVベクター)によって粗く精製されたAAVミニプレップベクター45は、同じベクターゲノム力価で投与した場合に、標準的な塩化セシウム(CsCl)勾配超遠心分離によって精製されたAAVベクター調製物(すなわち、CsCl AAVベクター)によって達成可能なものの約70%の腎形質導入レベルを達成しました。したがって、ここで紹介する方法と観察は、マウスおよび潜在的に大型の動物の腎臓への遺伝子送達を強化しようとしている研究者にとって、貴重で実用的なリソースを提供します。

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プロトコル

ここに記載されているすべての動物実験は、オレゴン健康科学大学 (OHSU) の施設動物管理および使用委員会によって承認され、OHSU の動物管理に関するガイドラインに従って実施されました。本研究では、8週齢のC57BL/6J雄マウスを用いた。この研究で使用された試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. アデノウイルスフリープラスミドトランスフェクションによるAAVベクター作製

  1. 5%二酸化炭素(CO2)を含む37°Cのインキュベーターで、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペニシリンおよびストレプトマイシンミックス、および1 mM L-グルタミンを添加したダルベッコの修正イーグル培地(DMEM)高グルコース(4.5 g / L)でヒト胚腎(HEK)293細胞を培養します。
  2. -2日目(トランスフェクションの48時間前)に、ステップ1.1で説明したように、T225フラスコあたり4 x 106 HEK 293細胞を培地40mLにプレートします。これは、0日目に~95%のコンフルエンスに達します。
    注:培養スケールは、用途に応じて調整できます。AAVミニプレップ(ステップ2)の場合、精製プロセスで通常約50%の材料が失われることを考慮して、ターゲット力価とベクター濃度に基づいて適切な数のフラスコを調製します。50 μLベクター溶液中で3 x 1011 vg/マウスの用量でマウスにRP注射用のAAV9およびAAV-KP3ベクターを>6 x 1012 vg/mLで達成するには、少なくとも2つのフラスコが推奨されます。CsCl密度勾配精製AAVベクター(CsCl AAV)などの大規模なAAVベクター製造には、通常、25本以上のフラスコが使用されます。
  3. 0日目:プラスミドDNAトランスフェクション
    1. トランスフェクションの準備
      1. セルが~95%のコンフルエンシーに達していることを確認します。
      2. 1%ペニシリンとストレプトマイシンのミックスと1 mM L-グルタミンを添加したDMEMを37°Cのウォーターバスで温めます。
      3. 直鎖状ポリエチレンイミン(PEI)溶液を室温にします。
    2. プラスミドDNA混合物の調製
      1. プラスミド(pAAV-CAG-tdTomato、pRepCap、およびpHelperの各15 μg)を、滅菌1.5 mL微量遠心チューブでCaCl2 またはMgCl2 を含まない1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に混合します。DNAの総量は45μg/フラスコです。
        注:プラスミドDNA溶液の量は、最小であれば無視できます。ただし、溶液の総容量が ≥225 μL の場合は、容量調整をお勧めします。この研究で使用されたプラスミドの配列は、 補足ファイル1で入手できます。
    3. PEIトランスフェクション
      1. 90 μLのPEI溶液(1 mg / mL)を1 mLのPBSに加え、50 mLのポリプロピレンチューブでPBS-プラスミドDNAミックス(上記のように調製)と混合します。最終容量は約2mL(培地の5%容量)です。
      2. チューブを5秒間渦巻きさせ、遠心分離機でチューブを短時間回転させて、液体をチューブの底に集めます。
    4. 室温で15分間保持して、プラスミドDNA-PEI複合体を形成します。
    5. 15分間のインキュベーションが完了したら、ステップ1.3.1.2で調製した予熱した無血清培地40 mLをプラスミドDNA-PEI複合体に加えます。容量は約42mLです。
    6. T225フラスコの培地を、ステップ1.3.4で説明した無血清培地を含むプラスミドDNA-PEI複合体と交換します。
    7. 5日目の収穫まで、このトランスフェクション培地中の細胞を維持します(培地の交換は必要ありません)。
    8. 2日目に、プラスミドトランスフェクション効率を評価するために、プラスミド発現蛍光タンパク質(pAAV-CAG-tdTomatoなど)を発現するプラスミドでトランスフェクトされた細胞を観察します。
      注:上記の条件では、通常、トランスフェクション効率が70%を超えます。おそらく無血清環境が原因で、いくつかの形態学的変化(細胞伸長など)が観察される場合があります。
    9. 3〜5日目に、トランスフェクトされた細胞を5%CO2を含む37°Cのインキュベーターで培養し続けます。
    10. 5日目に、細胞とウイルス含有培地の両方を50 mLのポリプロピレンチューブに集めます。
    11. サンプルは、使用するまで-80°Cで保管してください。

2. AAVベクターの遠心限外ろ過(CU)精製(AAVミニプレップ)

  1. ステップ1.3.11の凍結サンプルを37°Cのウォーターバスで解凍します。
  2. DNAドットブロットアッセイ(フラクション1として使用)のために1 mLの粗ライセートを取っておきます。
  3. 80 μLの1M塩化マグネシウム(MgCl2、最終濃度2 mM)、160 μLの0.1M水酸化ナトリウム(NaOH、最終濃度0.4 mM)、および16 μLのセラチアマルセセンスエンドヌクレアーゼ(最終濃度100単位/ mL)を50 mLチューブに加えます。37°Cで1時間インキュベートします。インキュベーション中は15分ごとにサンプルをボルテックスします。
  4. Serratia marcescensエンドヌクレアーゼ処理サンプルを250 mL遠心分離機ボトルに集め、4°Cで10,000 x g で30分間遠心分離します。
  5. 50 mL血清学的ピペットを使用して、上清を50 mLポリプロピレンチューブに移します。
  6. 上清をろ過し、0.45 μm PVDFシリンジフィルターを使用して破片を除去します。DNAドットブロットアッセイ(フラクション2として使用)のために、0.45 μmろ過したサンプル1 mLを脇に置いてください。
  7. 100 kDaの分子量カットオフ(MWCO)遠心限外ろ過チューブに10 mLの分子グレードの水を加え、4°Cで2,000 x g で10分間遠心分離します。フロースルーを取り外します。
  8. PBS中の5%ソルビトール15 mLを遠心限外ろ過チューブに加え、4°Cで2,000 x g で10分間遠心分離します。フロースルーを取り外します。
  9. ステップ2.6で説明したように、0.45 μmろ過サンプルを最大15 mL添加し、約500 μLの目標容量に達するまで、4°Cで2,000 x g で15分間遠心分離して濃縮します。DNAドットブロットアッセイ(フラクション3として使用)のために1 mLのフロースルーを取っておきます。
    注:各遠心分離の前に、ピペットで保持物を再懸濁して、濃度勾配を破壊します。ピペットチップでメンブレンに触れないでください。15分間の遠心分離後に目標容量に達しない場合は、チューブ内の残りの容量に基づいて時間を調整して、必要に応じて遠心分離を延長します。
  10. サンプル全体がろ過され、目標容量の約500 μLに達するまで、ステップ2.9を繰り返します。DNAドットブロットアッセイ(フラクション4およびフラクション5として使用)のために、ステップ2.10の1回目と2回目の反復からのフロースルーの1 mLを脇に置いておきます。
    注:単一の遠心限外ろ過チューブを使用して、2つ以上のフラスコから得られたサンプルを処理できます。
  11. PBSに15 mLの5%ソルビトールを加え、約500 μLの目標容量に達するまで、4°Cで2,000 x g で15分間遠心分離します。DNAドットブロットアッセイ(フラクション6として使用)のために1 mLのフロースルーを取っておきます。
  12. 手順2.11(分数7として使用)を繰り返します。
    注:下流の実験でより高いAAV力価が必要な場合は、最終的なターゲット容量をさらに150 μLに減らすことができます。
  13. 限外ろ過したAAVベクターをOリング付きの2 mLスクリューキャップチューブに移します。DNAドットブロットアッセイ(フラクション8として使用)のために、10 μLの限外ろ過されたAAVベクターを脇に置いておきます。
  14. 前述のようにDNAドットブロットアッセイによってAAV力価を決定します46。
    注:CU精製ベクター(CU AAV)は、CsCl精製ベクター(CsCl AAV)と比較して、より高いレベルの空のキャプシド汚染と宿主細胞由来の不純物を含んでいます。これらの要因は形質導入効率と免疫応答に影響を与える可能性があるため、データ解釈では慎重な考慮が必要です。

3. AAVベクターのCsCl密度勾配精製

  1. ステップ1.3.11の凍結サンプルを37°Cのウォーターバスで解凍します。
  2. 4°Cで10,000 x g で30分間遠心分離し、細胞破片を除去します。
  3. 上清を回収し、ポリエチレングリコール8000(PEG、最終濃度8%)と塩化ナトリウム(最終濃度500 mM)を加えて、上清にAAVベクターを沈殿させます。
  4. 氷上で3時間インキュベートします。
  5. 10,000 x g で4°Cで30分間遠心分離して、AAVを含むペレットを得る。
  6. 上清を除去し、10mlのサルコシル含有再懸濁バッファー(50 mM HEPES、150 mM NaCl、1%サルコシル、pH 8.0)でペレットを再懸濁します。
  7. ペレット懸濁液を15 mLのポリプロピレンチューブに移し、4°Cで一晩保持します。
  8. 翌日、ペレット懸濁液をセラチアマルセセンスエンドヌクレアーゼ(最終濃度200単位/ mL)およびMgCl2 (最終濃度2 mM)で処理します。
  9. 37°Cで1時間インキュベートします。
  10. 4°Cで10,000 x g で30分間遠心分離します。
  11. 上清を回収し、塩化セシウム(CsCl、屈折率の最終濃度(RI)= 1.3710 +/- 0.0005)およびEDTA(最終濃度20 mM)を加えます。
  12. サンプルを29.9 mL超遠心チューブにロードし、トッピング溶液(50 mM HEPES、150 mM NaCl、20 mM EDTA、CsCl(RI = 1.3710 +/- 0.0005)、pH 8.0)をいっぱいになるまで加えます。
  13. 41,000 x g で12°Cで22時間遠心分離します。
  14. 超遠心分離管の底部と側面に穴を開けて、それぞれ2 mLの合計15個のフラクションを収集します。
  15. 各画分10 μLを使用してRIをチェックし、DNAドットブロットアッセイ46を実行します。
  16. RIおよびDNAドットブロットアッセイの結果に基づいて、AAVベクターを含む最適な5つのフラクションを決定します。
  17. 最良の5つのフラクション(合計約10 mL)を組み合わせ、RIを1.3710 +/- 0.0005に調整します。
  18. サンプルを11.2 mLの超遠心チューブにロードし、いっぱいになるまでトッピング溶液を加えます。
  19. 65,000 x g で12°Cで12時間遠心分離します。
  20. 11.2 mL超遠心分離管の底面と側面に穴を開けて、それぞれ0.5 mLの合計18個のフラクションを収集します。
  21. 各画分10 μLを使用してRIをチェックし、DNAドットブロットアッセイ46を実行します。
  22. RIおよびDNAドットブロットアッセイの結果に基づいて、AAVベクターを含む最適な6つのフラクションを決定します。
  23. 最良の6つの画分(合計約3 mL)を組み合わせ、透析カセットにロードします。
  24. 透析カセットを1.3 Lの透析バッファー(0.001%非イオン性界面活性剤を添加したPBSバッファー)に攪拌バーで2時間浮かせて、CsClを除去します。
  25. ステップ3.24を2回繰り返します(合計6時間の透析)。
  26. カセットを、0.001%界面活性剤を添加したPBSバッファー中の500 mLの5%ソルビトールに2時間移し、バッファー交換を行います。
  27. 透析カセットからサンプルをシリンジで採取し、採取したサンプルを0.22 μm PVDFシリンジフィルターでろ過します。
  28. 定量的ドットブロットアッセイによるAAV力価の測定46.

4. SDS-PAGEとそれに続く銀染色によるAAVベクター調製物の品質評価

  1. ベクター調製物(CsCl AAVベクターの場合は1 x 1010 vg、CU AAVベクターの場合は1 x 109 および1 x10 10 vg)を、合計18 μL(ベクター調製:6x Laemmli= 15:3)の6x Laemmliバッファーと混合し、100°Cで5分間加熱します。
  2. 熱処理したAAVベクター調製物を7.5%SDS-PAGEゲルにロードし、Tris-glycine-SDSゲルランニングバッファーを使用してサンプルを20 mAで電気泳動します。
  3. ジェルカセットからジェルを取り出し、超純水ですすぎ、製造元の指示に従って銀染色キットを使用して染色します。
  4. CsCl AAVベクターをロードしたゲルを現像液中で7分間インキュベートし、CU AAVベクターをロードしたゲルを2分間インキュベートしてシグナル飽和を避けます。
    注:Cu AAVベクター調製物には、CsCl AAVベクターと比較して高レベルのタンパク質不純物が含まれています。したがって、CsCl AAVおよびCU AAVベクターをロードしたゲルは、ゲルランニング後に分離し、染色法の高感度によるシグナル飽和を防ぐために別々に銀染色しました。

5. ウェスタンブロットによるCU AAVベクター調製物中のAAV VPタンパク質の同定

  1. 1 x 109 vgのCU AAVベクター調製物を6x Laemmliバッファーと合計18 μL(ベクター調製:6x Laemmli = 15:3)で混合し、100°Cで5分間加熱します。
  2. 熱処理したAAVベクター調製物を7.5%SDS-PAGEゲルにロードし、Tris-glycine-SDSゲルランニングバッファーを使用してサンプルを20 mAで電気泳動します。
  3. セミドライ転写システムを使用して、メタノールで活性化されたポリ二フッ化ビニリデン(PVDF)膜上にゲル中のタンパク質を電気転写します。
  4. 5%脱脂乳を1x Tris緩衝生理食塩水とTween 20(TBST)で室温で1時間ブロックします。
  5. ブロックされた膜を一次抗体溶液(ウサギポリクローナル抗VP抗体、1x TBSTで5%スキムミルクで1:1000に希釈)とともに4°Cで一晩インキュベートします。
  6. メンブレンを1x TBSTで10分間、3回洗浄します。
  7. メンブレンを二次抗体溶液(西洋わさびペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ウサギIgG抗体、1x TBSTで5%脱脂乳で1:5000に希釈)とともに室温で1時間インキュベートします。
  8. メンブレンを1x TBSTで10分間、3回洗浄します。
  9. ウェスタンブロットイメージングシステムを使用してメンブレン上のシグナルを視覚化します。

6.腎盂(RP)注射

  1. 術前のセットアップと麻酔
    1. プラスチック製のビーカーに入った各マウスの体重を、0.1 gまでの精度の体重計で測定します。
    2. メロキシカム(5mg/kg)を体重に応じて皮下投与し、術前鎮痛を提供します。
    3. AAVベクター溶液をPBS中の5%ソルビトールで6.0 x 1012 vg / mLの濃度に希釈し、氷上に保持します。
      注:気密ガラスシリンジとPE-10ポリエチレンチューブのデッドスペースを考慮して、総注入量(50 μL x注射するマウスの数)よりも40 μL多くのAAV溶液を調製します。
    4. 針ホルダーを使用して、30Gの針から針先だけを曲げて折ります。
    5. 実体顕微鏡下で、30 Gの針先、15 cmのPE-10チューブ、30 Gの針、および気密ガラスシリンジを先端からこの順序で接続します(図1D)。
    6. 接続された気密ガラスシリンジを輸液シリンジポンプにセットします。
    7. ステップ6.1.3で調製したAAVベクター溶液90 μLを、輸液シリンジポンプを使用して気密ガラスシリンジに吸引します。
    8. シリンジポンプの注入モードを次のように設定します:目標容量50 μL、流量50 μL/min。
    9. マウスを、100%酸素で1.5〜3.0 L / minの流量で送達された4%イソフルランで満たされたプラスチックチャンバーにマウスを、完全に麻酔するまで置きます。
    10. マウスの鼻を1.5%〜3.0%のイソフルラン流量で鼻錐に入れます。外科手術全体を通して、つま先ピンチ反射によって麻酔の深さを監視します。
    11. 角膜の乾燥を防ぐために、綿の先端のアプリケーターを使用して眼科用軟膏で目を覆います。
    12. 綿の先端のアプリケーターを使用して、脱毛剤でマウスの左裏側から毛を取り除きます。
      注: 脱毛クリームは、皮膚の炎症を防ぐために、すすぎで完全に取り除く必要があります。
    13. 温熱療法ポンプに接続された閉ループヒートパッドの上にマウスを横向きに置き、体温を37°Cに保ちます(粘着テープで固定する必要はありません)。
    14. 切開部位から始まる綿の先端のアプリケーターを使用して、ポビドンヨードと70%エタノールを3回交互に塗布して、剃った部分を消毒します。
    15. マウスを滅菌外科用ドレープで覆います。
  2. 左腎臓へのRP注射
    1. 組織鉗子で皮膚をつまみ、左腎臓の位置の肋椎角レベルで外科用ハサミで皮膚層に約1cmの切開を行います。
    2. 皮膚切開をした後、筋肉層を同じ長さに切ります。
      注:切開の長さが短すぎると、腎臓が露出できず、代わりにサイズが小さい脾臓が誤って露出する可能性があります。一方、切開の長さが長すぎると、腎臓は切開自体によって所定の位置に保たれず、切開から腹部に滑り込み続けます。
    3. 腎臓に直接触れないように、指で腹部をそっと押して、腎臓が切開部位から露出するようにします(図1A)。
    4. 腎盂が小さな白い領域として見えるように、周囲の脂肪を最小限に抑えます。
    5. まず、直線型微小血管クリップで尿管をクランプし、次に腎動脈と腎静脈を湾曲型微小血管クリップで固定します。
      注:腎臓の色が濃い赤色に変わり、腎臓に出入りする血流の遮断に成功したことを確認します(図1B)。
    6. シリンジポンプに接続された30 G針を湾曲した鉗子で骨盤腔に約3 mm挿入し、輸液シリンジポンプを使用して50 μLのAAVベクター溶液の注入を50 μL/minの流量で1分間にわたって開始します(図1C)。
    7. 針とクランプを5分間保持して、注射された腎臓のAAVベクターへの曝露を増やします。
      注:適切な滞在時間は、AAVキャプシドによって異なる場合があります。AAV-KP1またはAAV-KP3ベクターによる形質導入には、5分の滞留時間で十分であることが示されています。
    8. 5分間のインキュベーションが完了したら、クランプを取り外します。
      注:腎臓の色はすぐに暗赤から血の赤に変わり、腎臓の血流の回復を確認します。
    9. 注射針を慎重にゆっくりと引き抜き、同時に綿の先端のアプリケーターを注射部位に圧力をかけます。注射部位からの出血がないことを確認してください。止血パッチを貼る必要はありません。
    10. 腎臓をそっと腹腔に戻します。
    11. 筋肉層を6-0吸収性縫合糸で縫合し、皮膚を5-0モノフィラメント縫合糸で縫合します。
    12. 体液をサポートするために、1 mLの生理食塩水をマウスの背中に皮下投与します。
    13. 使用済みの30 G針先を新しく準備したものと交換し、使用済みの30 G針を有害化学廃棄物管理に関する機関のガイドラインに従って廃棄し、輸液シリンジポンプを使用して50 μLのAAVベクター溶液をロードして次のマウスに投与します。
    14. ステップ6.2.13が不要な最後のマウスを除き、グループ内のすべてのマウスに対してステップ6.2.12〜6.2.13を繰り返します。
    15. 計画されたすべての注射を完了したら、有害化学廃棄物管理に関する機関のガイドラインに従って、汚染された針とポリエチレンチューブを廃棄します。
  3. 術後のモニタリングとケア
    1. RP注射の24時間後および48時間に、術後鎮痛のためにメロキシカム(5 mg / kg)をマウスの背中に皮下投与します。
    2. RP注射の24時間後に、体液をサポートするために1 mLの生理食塩水をマウスの背中に皮下投与します。
    3. 術後1週間、注射されたマウスの体重と一般的な外観を毎日監視します。体重が10%減少した場合は、1mLの生理食塩水をマウスの背中に週3回、1週間皮下投与します。改善が観察されない場合、影響を受けたマウスは安楽死させます。

7. 組織採取と凍結切片

  1. 固定および凍結保護液の調製。
    1. 0.2 Mリン酸緩衝液(合計1 L)
      1. 1 Lのガラスビーカーに800 mLの超純水を調製します。
      2. 6.4 gのリン酸一塩基性ナトリウム(NaH2PO4)と21.8 gのリン酸二塩基性ナトリウム(Na2HPO4)を溶液に加えます。
      3. 塩酸でpHを7.4に調整します。
      4. 超純水を1Lまで満たします。
      5. 使用するまで4°Cで保管してください。
    2. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液(合計40mL)
      1. 10 mLの16%PFA、ステップ7.1.1で調製した20 mLの0.2Mリン酸緩衝液、および10 mLの超純水を混合します。
      2. 10 mLを15 mLポリプロピレンチューブにアリコートします。
        注:灌流固定に使用する直前に4%PFA溶液を作ります。
    3. 30%スクロース溶液(合計40mL)。
      1. 30 mLのPBSを12 gのスクロースと混合します。
      2. 完全に溶解した後、PBSを40mLまで充填します。
  2. 灌流固定と組織採取。
    注意: 4% PFA 溶液は吸入すると強力な有害な化学物質であるため、灌流固定はヒュームフード内で行う必要があります。
    1. マウスをイソフルランで麻酔し、仰臥位に置き、四肢を優しくつまんで反応性がまったくないことを確認します。
    2. マウスに麻酔をかけたら、外科用ハサミを使用して尾腹部から剣状突まで切開します。次に、胸骨の両側に沿って2つの横方向の切開を行い、胸壁を前方に引っ込めて心臓と主要な血管を露出させます。
    3. 鋭い解剖 によって 右心房を開き、循環器系を減圧します。25 Gバタフライ針を左心室に挿入し、約10 mL / minの速度で50 mLのPBSを注入し、上行大動脈に流れを向けます。
      注:血液は自家蛍光を示すため、高品質の免疫蛍光(IF)画像を取得するには、放血が重要です。血液を完全に除去するために、この研究では 50 mL の PBS が使用されましたが、20-30 mL が一般的に使用されます。
    4. ステップ7.1.2で調製した4%PFA溶液20 mLを同じ速度で注入し、溶液の切り替え中に空気が導入されないようにします。
    5. 組織を採取し、4%PFA溶液で満たされた15 mLポリプロピレンチューブで4°Cで一晩保持して固定後処理します。採取した組織で蛍光タンパク質が発現した場合は、チューブをアルミホイルで覆い、光から遮ります。
  3. 凍結埋込み
    1. 凍結保護のためにステップ7.1.3で調製した30%スクロース溶液で満たされた15 mLポリプロピレンチューブに組織を移します。
    2. 組織がチューブの底に完全に沈むまで、4°Cに保ちます。
    3. 組織を標準パターン鉗子でプラスチック製のクライオモールドに移します。
    4. OCTコンパウンドを組織の上に置き、組織の向きが正しく、クライオモールドの底と同じ高さであることを確認します。
    5. 上部をOCTコンパウンドで満たします。ピペットチップで気泡を取り除きます。
    6. プラスチック製のクライオモールドを2-メチルブタンを含む極低温浴に入れ、氷バケツで砕いたドライアイスで冷やし、OCT化合物が完全に凍結するまで(OCT化合物が白くなります)。
    7. 使用するまで、ティッシュブロックを-80°Cで保管してください。
  4. 凍結切片
    1. 切片化の前に、凍結組織ブロックを-20°Cのクライオスタットミクロトームに移し、凍結組織ブロックの温度を平衡させます。
    2. クライオスタットミクロトームを使用して、各凍結組織ブロックを所望の厚さ(通常は5 μm)に切片します。免疫蛍光染色のために、組織切片を顕微鏡スライドガラスに置きます。
    3. 切片は後で使用するために-80°Cで保存できます。

8. 免疫蛍光染色

  1. 凍結スライドを室温で30分間乾燥させます。
  2. 液体ブロッカーペンで切片を分離し、室温で5分間乾燥させます。
  3. 切片を150 μLのPBSで10分間再水和します。
  4. スライドを平らな面に置き、セクションごとにPBSで希釈した150 μLの1%ウシ血清アルブミン(BSA)をスライドに加えます。ブロッキングのために室温で45分間インキュベートします。
  5. 150 μLの一次抗体溶液(抗ウィルムス腫瘍1(WT1)抗体、1%BSAで1:100に希釈、抗Na-K-2Cl共輸送体2(NKCC2)抗体、1%BSAで1:100に希釈、または抗アクアポリン2(AQP2)抗体、1%BSAで1:100に希釈)を加え、湿気の多いチャンバーで4°Cで一晩インキュベートします。
  6. 切片を室温でPBSで5分間、3回洗浄します。
  7. 150 μLの二次抗体(抗ウサギIgG Alexa Fluor 647抗体、1%BSAで1:500に希釈)およびLotus tetragonolobus lectin(LTL)-フルオレセイン(1%BSAで1:200に希釈)を加え、室温で60分間インキュベートします。
  8. 切片を室温でPBSで5分間洗浄します。
  9. スライドを平らな面に置き、核染色のために150 μLのHoechst 33342(PBSで1:10,000に希釈)を加えます。光から保護し、室温で10分間インキュベートします。
  10. 切片を室温でPBSで5分間洗浄します。
  11. 20 μLの封入剤とカバーガラスでスライドを取り付けます。イメージングが実行されるまで、スライドを4°Cの暗所に保管します。

9. 組織からのDNA抽出

  1. 市販のキットを使用した組織からのDNA抽出( 材料 表を参照)。
    1. 組織をセラミックビーズチューブに移し、400 μLのDNA抽出バッファー(100 mM NaCl、20 mM EDTA、1%SDS、および50 mM Tris-HCl、pH 8.0)を加えます。
    2. ホモジナイザーを使用して、5 m/s の速度設定で 20 秒間、3 サイクルで組織を均質化します。
    3. 室温で2,000 x g で2分間遠心分離します。
    4. P200ピペットを使用して200 μLの上清を収集し、10 μLのプロテイナーゼK溶液(最終濃度1 mg / mL)を加えます。
    5. ボルテックスして15秒間混合し、55°Cで1時間インキュベートします。
    6. DNA抽出キットから200 μLの溶解バッファーを加えます。
    7. ボルテックスして15秒間混合し、55°Cで15分間インキュベートします。
    8. 250 μLの100%エタノールを加えます。
    9. ボルテックスして15秒間混合し、室温で5分間インキュベートします。
    10. ライセートをDNA抽出スピンカラムに塗布します。
    11. 室温で6,000 x g で1分間遠心分離します。
    12. スピンカラムを新しい2 mLコレクションチューブに入れます。DNA抽出キットから500 μLの最初の洗浄バッファーを加えます。
    13. 室温で6,000 x g で1分間遠心分離します。
    14. スピンカラムを新しい収集チューブに入れます。DNA抽出キットから500 μLの2番目の洗浄バッファーを加えます。
    15. 室温で6,000 x g で1分間遠心分離します。
    16. スピンカラムを新しい2 mLコレクションチューブに入れます。500 μLの100%エタノールを加えます。
    17. 室温で6,000 x g で1分間遠心分離します。
    18. スピンカラムを新しい2 mLコレクションチューブに入れ、室温で20,000 x g で3分間遠心分離します。
      注:このステップでは、エタノールが溶出液に持ち越されると下流のアプリケーションに干渉する可能性があるため、スピンカラム膜が完全に乾燥します。
    19. スピンカラムを新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れます。DNA抽出キットから35 μLの溶出バッファーをスピンカラムに加えます。
      注:回収された溶出液の量は、通常、最初にカラムに適用された溶出バッファーの量より約5 μL少なくなります。
    20. 室温で5分間インキュベートします。
    21. 室温で20,000 x g で1分間遠心分離します。
    22. DNA濃度を測定します。
  2. 定量的PCR(qPCR)によるベクターゲノムコピー数の定量化
    1. ステップ9.1で調製した抽出DNAを分子グレードの水で25 ng / μLの濃度に希釈します。
    2. ベクターゲノム定量用のqPCRプライマーペア(この研究ではtdTomatoを使用しました)と、抽出されたDNAサンプル中の二倍体ゲノムを定量するために使用されるマウス参照遺伝子のqPCRプライマーペアを設計します(この研究ではマウスアグーチ遺伝子が使用されました)。
      注:この研究で使用されたプライマー配列は次のとおりです。
      tdトマトフォワード: 5'-TATGAACGGAGCGAGGGGAG-3'
      tdトマトリバース:5'-TTCCACTAGACCCTGAGCCG-3'
      マウスアグーチフォワード:5'-GGCGTGGTCAGTGGTTGTG-3'
      マウスアグーチリバース:5'-TTTAGCTTCCACTAGGTTTCCTAGAAA-3'
    3. 25 μLのqPCR反応の場合、ステップ9.2.1で4 μLの希釈DNAサンプル(25 μLの反応混合物に合計100 ngのDNA)、12.5 μLの2x qPCR反応バッファー、ステップ9.2.2で調製した20 μMのフォワードプライムとリバースプライムの両方0.5 μL(各プライマーの最終濃度400 nM)、 および7.5μLの分子グレードの水。
    4. qPCR用のプラスミド標準のDNA濃度を4回測定し、DNA濃度の平均値を決定します。
      注:この研究では、マウスアグーチ遺伝子に由来するPCR標的配列を含むスーパーコイル状pAAV-CAG-tdトマトプラスミドおよびスーパーコイル状円状プラスミドを、それぞれベクターゲノムの定量化と正規化に使用しました。
    5. 106のダイナミックレンジをカバーするプラスミドDNA標準試料の一連の1:10連続希釈液を調製します。
      注:各サンプルと標準は、少なくとも二重に分析する必要があります。
    6. 次の熱サイクル条件を使用してqPCRを実行します:95°Cで10分間の最初の熱活性化ステップ、続いて95°Cで15秒間35サイクルの変性、および60°Cで30秒間のアニーリング/伸長。
    7. qPCR反応を完了し、サンプル中のベクターゲノムとマウス参照遺伝子の二本鎖(ds)コピー数値を得た後、ベクターゲノムと参照遺伝子の両方の既知の濃度から生成された標準曲線に基づいて、dsベクターゲノムコピー数を各サンプルの参照遺伝子コピー数に正規化することにより、二倍体ゲノム当量(ds-vg/dge)あたりのdsベクターゲノムコピー数を決定します。
      注:Ds-vg/dgeは、100 ngのマウスゲノムDNAが16,900個の二倍体(2N)マウス細胞(すなわち、二倍体マウス細胞あたり5.92 pgのDNA)を表すという以下の近似値に基づいて決定できます。

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結果

最近の研究では、RP 注射後の AAV9 と比較して腎形質導入の顕著な増強を示す AAV カプシドの小さなサブセットが同定されました38。同定されたサブセットには、DNAシャッフル41によって生成されたキメラAAVキャプシドであるAAV-KP3が含まれる。したがって、この研究では、AAV9 をベンチマークとして AAV-KP3 とともに RP 注射に選択しました。AAV9-CAG-tdトマトベクター(AAV9)およびAAV-KP3-CAG-tdトマトベクター(KP3)を、アデノウイルスフリープラスミドトランスフェクション法によってHEK293細胞で作製し、CsCl密度勾配超遠心分離(CsCl AAV)または100 kDa分子量カットオフフィルター(CU AAV)を使用した遠心限外ろ過(CU)によって精製しました。CsCl AAVを調製するための手順は、以前に説明されている47。

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ディスカッション

このレポートでは、マウス腎臓への遺伝子送達のための局所投与方法としてのAAVベクターの低速逆行性RP注射について詳しく説明しています。RP 注射を安全に行うための重要なステップの 1 つは、注射された腎臓への実質損傷を避けるために AAV ベクターの注射速度を調整することです。流体力学的腎盂注射に関する以前の報告では、100 μLのプラスミドDNA溶液をわずか3秒24以内にマウス腎臓に注入しました。この高速注入は、効果的なDNAトランスフェクションのために一過性の細胞膜透過性を高めるために不可欠ですが、組織損傷を引き起こす可能性があります24。このリスクを軽減するために、シリンジポンプを使用して、50 μL/minの制御された速度でRP を介して ベクターをゆっくりと注入しました。この手順は、RP 注射された腎臓の組織損傷を防ぐことに成功しました。

もう 1 つの重要なステップは、注射時に腎動脈と静脈を...

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開示事項

H.N.は、タカラバイオ株式会社とCapsigen Inc.からライセンス供与されたAAV関連技術のロイヤリティを受け取り、バイオテクノロジー企業のコンサルタントを務め、Capsigen Inc.の共同創設者であり、Capsigen Inc.とSphere Gene Therapeuticsの株式を保有しています。

謝辞

AAV9のヘルパープラスミドを提供してくれたGuangping GaoとJames M. Wilson、AAV-KP3のヘルパープラスミドを提供してくれたKatja PekrunとMark A. Kayに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.45 μm PVDF シリンジフィルターMilliporeSigmaSLHVR33RS
1.5 mL マイクロ遠心管 Fisher Scientific05-408-129
15 mL ポリプロピレンチューブCorning352097
16% パラホルムアルデヒド (PFA)Electron Microscopy Sciences15710
250 mL 遠心瓶Fisher Scientific055641S24
2F シリコンチューブSai Infusion TechnologiesSIL-2-50 
25G バタフライ針Medex Supply26708
2-メチルブタンMilliporeSigmaMX0760
2x qPCR 反応バッファーFisher Scientific43-676-59Power SYBR Green PCR Master Mix
30G 針Becton-Dickinson & Co305106
50 mL ポリプロピレンチューブCorning430291
5-0 モノフィラメント縫合糸EthiconY463G
5 M NaClLonza51202
6-0 吸収性縫合糸EthiconJ489G
7.5% Mini-PROTEAN TGX プレキャスト
プロテインゲル、10ウェル、30 µL		Bio-Rad4561023
Amersham ImageQuant 800 Western
ブロットイメージングシステム (Cytiva)		Cytiva29459405
Amicon 100 kDa MWCO、15 mL チューブMillipore SigmaUFC910024
抗アクアポリン 2 (AQP2) 抗体Abcamab199975集合管細胞のマーカー
抗 Na-K-2Cl 共輸送体 2
(NKCC2) 抗体		StressMarq BiosciencesSPC-401厚い上行脚細胞のマーカー
抗ウサギ IgG Alexa Fluor 647
抗体		Jackson ImmunoResearch111-605-144
抗ウィルムス腫瘍 1 (WT1) 抗体Abcamab89901ポドサイトのマーカー
Beckman Coulter OptiSeal チューブ、
ポリプロピレン、29.9 mL		Fisher ScientificNC9691210
Beckman Coulter OPTISEAL TUBESFisher ScientificNC9611575
BenzonaseSigma-Aldrich1016970001
ウシ血清アルブミン (BSA)Sigma-Aldrich5470
遠心超濾管MilliporeSigmaUFC9100Amicon 100 kDa MWCO、15 mL
セラミックビーズチューブFisher Scientific15-340-154
セシウム塩化物Sigma-AldrichC3032-1KG
クランプ適用鉗子Fine Science Tools00071-14
クローズドループヒートパッドStryker Medical8002-062-012
コットンチップアプリケーターPuritan806-WC
カバーガラスFisher Scientific12-541B
クライオスタットマイクロトームTanner ScientificTN50
湾曲した鉗子Fine Science Tools11052-10
湾曲型マイクロ血管クリップKleinert-Kutz65145腎動脈および腎静脈用クランプ
透析カセットFisher ScientificPIA52976
DNA 抽出キットQiagen57704QIAamp MinElute Virus Spin Kit
D-ソルビトールSigma-AldrichS6021-1KG
Dulbecco's 改良 Eagle 培養基-
高グルコース		Corning15-013-CVDMEM-高グルコース (4.5 g/L)
EDTAFisher Scientific15-575-020
エタノールDecon Laboratories2716GEA
胎児ウシ血清 (FBS)VWR89510-186
ガスタイトロングラスシリンジHamilton1710 TLL
グルタルアルデヒド溶液Sigma-AldrichG6257
ヒートセラピーポンプKent ScientificHTP-1500
HEPESSigma AldrichH4034-100G
ホイスト 33342InvitrogenH3570
ホモジェナイザーFisher Scientific15-340-163
ヒト胚腎 (HEK) 293
細胞		Agilent240073
氷バケツFisher Scientific07-210-104
注入シリンジポンプHarvard Apparatus70-4507
イソフルランPiramal Critical CareNDC 66794-017-10
L-グルタミンFisher Scientific25030-081
液体ブロッカーペンTed Pella22309
Lotus tetragonolobus レクチン (LTL)-
フルオレスセイン		Vector LaboratoriesFL-1321-2近位尿細管のマーカー
塩化マグネシウム (MgCl2)MilliporeSigmaM1028
メロキシカムVetOneNDC 86136-012-10鎮痛剤
顕微鏡ガラススライドFisher Scientific12-550-15
マウンティング媒体SouthernBiotech0100-01
針ホルダーFine Science Tools12501-13
OCT コンパウンドSakura Finetek4583
眼科用軟膏Bausch & LombNDC 24208-313-3

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