マウス骨髄損傷モデルにおける膜内骨化による出生後骨形成の研究方法の改善

サマリー

マウス骨髄損傷モデルは、出生後の骨形成を膜内骨化で研究するための有用なツールです。この簡略化された外科的プロトコルは、損傷後の新しい骨形成と細胞反応の下流評価のための骨髄アブレーション手順を説明しています。

要約

長骨損傷は、軟骨内または膜内骨形成経路のいずれかを通じて治癒します。軟骨テンプレートを必要とする軟骨内経路とは異なり、膜内骨化のプロセスには、骨格幹細胞および前駆細胞(SSPC)を骨形成骨芽細胞に直接変換することが含まれます。 実験用マウスでこのプロセスをモデル化する外科的方法は限られています。本研究では、マウスの骨髄損傷モデルを改良し、膜内骨化による骨修復の研究を容易にし、出生後の骨形成調節因子を評価しました。この方法は再現性が高く、ユーザーフレンドリーであり、マイクロコンピューター断層撮影法(μCT)と凍結切片組織学を使用して、短期間(損傷後3〜7日)で新しい骨形成の時間的評価を可能にします。さらに、SSPCと成熟骨芽細胞の寄与は、蛍光レポーターマウスとこの膜内骨髄損傷モデルの組み合わせを使用して容易に評価できます。臨床現場では、膜内骨形成は、臨界サイズ欠損、安定化骨折、皮質欠損、腫瘍切除による外傷、および関節置換術の治癒に関連します。

概要

長骨損傷は、軟骨内または膜内骨形成経路を通じて治癒します。軟骨前駆体ステップを必要とする軟骨内経路とは異なり、膜内骨化による骨修復には、骨格幹細胞および前駆細胞(SSPCS)の骨形成骨芽細胞への直接変換が含まれます¹。臨床的には、このプロセスは、臨界サイズ欠損、安定化骨折、皮質欠損、気晴らし骨形成、腫瘍切除による外傷、関節置換インプラントのオッセオインテグレーションなど、さまざまな状況での骨治癒に関連しています^2,3。興味深いことに、長骨骨折の患者の研究では、66%〜82%が骨折を転位させており、骨を安定させるために固定装置が必要でした^4,5。これらの硬直的に安定化された骨は、主に骨折した骨の端が互いに直接接触するときの膜内骨化によって治癒します^6,7。しかし、膜内骨再生の機構的調節は、軟骨内経路を介した骨形成と比較して、比較的研究が進んでいません。米国食品医薬品局(FDA)が承認した骨治癒増強療法は、臨床効果の限定性と高額な費用によって妨げられ、重大な副作用を伴います⁸。

機械的骨髄アブレーションは、膜内骨形成を研究するための貴重なモデルを提供します。この単純な損傷モデルにより、皮質骨を壊すことなく骨髄の骨再生を研究することができます。BMアブレーション後の治癒過程には、明確でありながら重複する段階が含まれます。初期段階は最初の1〜5日で発生し、血栓の形成と炎症を伴い、炎症細胞とサイトカインが治癒を開始します。3日目から14日目までの第2段階は、血管新生、間葉系幹細胞(MSC)の遊走と増殖、骨芽細胞の分化、および織物骨形成などの再生を特徴としています。最終的なリモデリング段階は、手術の約10日後に始まり、骨組織が成熟し、再構築され、骨髄が56日目までに完全に回復するまで^{行われます9。}この迅速な治癒タイムラインにより、BMアブレーションモデルは、特に炎症、前駆細胞の動員、および骨芽細胞の分化の重要な期間中の早期骨修復応答の研究に理想的です。組織学、フローサイトメトリー、定量的μCT解析などの技術を使用して、初期修復段階における細胞応答と骨形成を評価できます。前述の技術を使用して、BMアブレーションモデルは、膜内骨再生のメカニズムに関する洞察を提供し、骨治癒を促進するための主要な治療標的を特定するのに役立ちます。

プロトコル

以下の手順は、コネチカット大学保健センターの動物施設管理および使用委員会(IACUC)の承認を得て実施されました。すべての手術は、国立衛生研究所(NIH)のガイドラインで概説されているように、無菌条件下で行われました。疼痛と感染リスクは、適切な鎮痛剤と消毒剤で管理され、良好な結果が得られました。

1. 手術部位と器具の準備

1. 手術室の準備には、臨床グレードの消毒剤クリーナーで作業面を消毒します。
   注:外科医は、滅菌使い捨て手袋、ヘアボンネット、ガウン、マスクなど、適切な個人用保護具(PPE)を着用する必要があります。
2. 滅菌外科用パッドで覆われた加熱パッドを準備します。すべての滅菌器具と試薬(Table of Materials)を集めて配置し、アクセスしやすいようにしてください。

2. 術前麻酔

1. 手術前にすべてのマウスの体重を量ります。ブプレノルフィンの利用可能な製剤に基づいて、使用する鎮痛薬の量を計算します。.
2. 無菌作業スペース内で、誘導室とノーズコーンアセンブリを含む動物の麻酔ユニットを組み立てます。マウスの年齢と体重に応じて、酸素出力を2 L ^min-1 に、イソフルランを1.5-3%(v / v)に設定します。
3. マウスが鎮静されたら、動物を誘導チャンバーから取り出し、仰臥位の滅菌外科パッドに置きます。両目に眼科用潤滑剤を塗布します。ノーズコーンを頭の上に置きます。つま先をそっとつまんで、マウスに十分な麻酔がかけられていることを確認してください。先に進む前に、後肢反射反応がないことを確認してください。
4. 手術の前に、マウスをノーズコーンから簡単に取り外して、皮下経路を介して徐放性ブプレノルフィンの総用量を注射します。総用量は3.25 mg / kgです。.

3.外科的処置の説明

注:この外科的処置は、10週齢から24週齢のC57BL/6雄および雌マウスを利用します。この手順は、他のマウスが示すように、6週齢から33週齢までのマウス、およびさまざまな近交系で実行できます^10,11。若いマウスは短い針の長さが必要な場合がありますが、古いマウスや大きいマウスはより長い針が必要になる場合があります。

1. 26 G針を装備した3 mLシリンジに滅菌生理食塩水を入れます。これを横に置きます。
2. 後肢から毛皮を取り除き、電気または電池式のバリカン(#40ブレード)で手術を行い、手術野から緩んだ毛皮を取り除きます。滅菌綿チップのアプリケーターを使用して、ヨウ素ベースのスクラブ(10%ポビドンヨード)と続いて70%イソプロピルアルコールで手術部位を治療します。膝の中心から外側に向かって円形に掃くように、手術部位をこすります。サイトを乾かします。スクラブ手順を3回繰り返します。
3. マウスを仰向けに置き、手術脚の膝を曲げます。マウスの脚を利き手ではない手で持ち、膝が中指の上に曲がり、2本目の指が大腿骨に、親指が脛骨にくるようにします。
4. メスを使用して、膝蓋骨のすぐ下に小さく浅い水平切開を行います。
   注:この手順により、挿入部位の視覚化が向上します。経験を積むと、この手順はスキップできます。
5. 針を曲げた膝を横切って水平に置き、大腿骨と脛骨の間のスペースを感じて、関節スペースを見つけます。この解剖学的部位をガイドとして使用して、25 Gの針を取り、膝から近位側に向かって遠位大腿骨に手動でドリルで穴を開けます(針をひねると同時に針に適度な圧力を加えることにより)。膝蓋骨を通して、または膝蓋骨の周りに針を挿入します。
6. マウスをX線撮影して、針ができるだけ中心に近い髄腔に適切に配置されていることを確認します(図1)。
7. 25 Gの針を取り外し、すぐに26 Gの針を骨髄腔内の同じ穴に挿入します。髄腔の側面を円を描くように少なくとも5回、滑らかに感じるまで繰り返します。各マウス間でリーミング モーションの数を一定に保ちます。
   注意: 手順3.5および3.7は、慎重に取り扱わないと、外科医に針刺し傷害を引き起こす可能性があります。
8. 26 G針を取り外し、生理食塩水シリンジに接続されている26 G針を交換します。.逆流がクリアになるまでキャビティを洗い流します。これには通常、1.5〜2mLの生理食塩水が必要です。シリンジと針を取り外し、鋭利な容器に安全に廃棄してください。
   注意: 液体を押すときに抵抗があってはなりません。その場合は、針を再挿入して、針が空洞内にあることを確認します。針を途中まで引き抜く必要があるかもしれません。
9. 局所接着剤縫合糸を使用して皮膚の傷を閉じます。

4. 術後ケア

1. 手術の直後に、ステップ2.4の投与量を使用して、徐放性ブプレノルフィンの残りの半分の用量を投与します。.
   注:徐放性ブプレノルフィンは、最大72時間の痛みを和らげます。.
2. ヒーティングパッドの上で、動物が手術から目覚めるまで、正常で呼吸が妨げられていない兆候がないか監視します。歩行可能になったら、マウスをケージに戻します。
3. 手術後3日間は1日1回マウスを監視し続けて、マウスが適切に治癒し、完全に動けることを確認し、痛みの兆候を監視します。

5. μCTスキャンと分析のための骨の処理

1. IACUCまたはその他の該当する機関の方針によって規制および承認された人道的な安楽死方法に従ってマウスを安楽死させます。ここでは、CO₂ 吸入の一次安楽死法が使用され、続いて子宮頸部脱臼の二次的方法が使用されました。
2. 後肢の周りの皮膚を剥がし、股関節の四肢全体を切除して大腿骨を採取します。
3. 埋め込みカセットの2つのスポンジの間に各手足を挟みます。カセット内の骨を10%ホルマリン溶液に移し、マウスの年齢とサイズを考慮して、4°Cで5〜7日間固定します。
   注:過固定と過少固定の両方により、骨髄の分解能が低下します。
4. 固定後、カセットをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で5分間3回洗浄します。
5. カセットから手足を取り外し、必要に応じてメスを使用して筋肉を切り取ります。
   注:下流のアプリケーションによっては、乱暴な取り扱いにより骨の骨膜層が破壊される可能性があります。
6. 小さな手術用ハサミまたはメスを使用して靭帯を慎重に切断することにより、膝で大腿骨を分離します。
   注意: 脛骨は、他の用途に使用することも、廃棄することもできます。
7. 大腿骨を1.7mLまたは15mLのコニカルチューブに移し、70%エタノール溶液に入れます。骨は、μCTスキャンの準備が整うまで、4°Cで70%エタノールに留まることができます。
8. 大腿骨の海綿柱パラメータをスキャンおよび評価し、定性的および定量的データを生成します。

6. 凍結切片作成および組織学のための骨の加工

注:骨は、μCTスキャンを受けた後、凍結切片化および組織学のために処理することができます。スキャンは、蛍光標識やその後の抗体染色には影響しません。

1. 骨を70%エタノールからPBSに移し、3回、1回の洗浄につき5分間洗浄します。
2. 10%、20%、30%の一連のショ糖溶液をPBS中で4°Cで各濃度で一晩インキュベートします。骨を30%ショ糖に4°Cで最大5日間、またはこの溶液に-20°Cで最大6〜12か月間、埋め込む準備ができるまで保存します。
   注:ショ糖勾配を使用すると、組織の浸透性が向上します。ステップ6.1の後、骨を30%ショ糖溶液に直接一晩置くことができます。
3. 凍結埋込型を使用して、最適な切断温度(OCT)コンパウンドに骨を埋め込みます。切片の準備ができるまで-80°Cで保管してください。
4. クライオスタット温度を-24°Cから-26°Cに設定したクライオフィルムテープ法を使用して骨を埋め込んだ切片。
5. クライオフィルムの切片を光学接着剤を使用して接着スライドに接着し、紫外線(UV)架橋剤を使用して硬化するまで硬化させます。

7. フローサイトメトリーのプロセッシング

注:このプロトコルは、さまざまな抗体に適合します。骨格幹細胞と前駆細胞の特性評価には、骨髄内の希少な細胞集団である3〜4個の骨を一緒にプールすることをお勧めします。

1. 蛍光活性化セルソーティング(FACS)染色培地(FSM)を調製します。FSMの1000 mL溶液を作るには、100 mLのハンクス平衡塩溶液(HBSS)、10 mLの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、20 mLのウシ胎児血清(FBS)、870 mLのdd H2Oを組み合わせます。FSM溶液を0.2μmフィルターに通します。
2. ティッシュを採取する前に、カルシウムとマグネシウムを含まない滅菌PBSを4〜5mLのペトリ皿に入れます。
3. 消化媒体を準備します
   1. 大腿骨4〜6個ごとに、0.005gのコラゲナーゼPと0.02gのヒアルロニダーゼを含むPBS10mLの消化混合物を調製します。穏やかなボルテックスで混合し、0.22μmのフィルターに通します。
4. ステップ5.2で説明されているように、手術後3日目に骨を採取します。メスの刃ですべての筋肉と結合組織を取り除きます。
5. ペトリ皿に5mLの消化培地を入れます。消化培地に4〜6個の骨を入れます。各骨を細かく切り刻み、最初のカットを縦方向と横方向に切ります。
6. 組織を14mLの丸底チューブに移し、パラフィルムで密封します。チューブをアルミホイルで覆います。
7. チューブをシェーカーに水平に置いたまま、37°Cで20分間振とうします。
8. シェーカーからチューブを取り外します。細胞は下部に凝集します。底部の細胞を乱さずに消化物を穏やかに収集し、消化物を70μmフィルターに通します。濾液を10 mLの冷たいFSMが入った新しい50 mLチューブに集め、氷上に保ちます。
9. 細胞に、残りの5 mLの消化ミックスを加えます。パラフィルムで再度密封し、アルミホイルで覆います。上記のようにチューブを振ってください。手順7.7〜7.8を繰り返します。
10. 37°Cで20分間インキュベートした後、ステップ7.8で使用したのと同じチューブに消化物を移し、さらに10 mLのFSMを入れた70 μmフィルターを通過します。
11. 懸濁液を274 x g 、4°Cで遠心分離します。 上清を吸引し、細胞ペレットを回収します。チューブを軽くたたいてペレットを外します。
    注:遠心力(g)は、ローター半径170mmに基づいています。ローターの半径を確認し、それに応じて速度を調整してください。
12. 赤血球溶解を行うには、1 mLのアンモニウム-塩化カリウム(ACK)溶解バッファーを追加します。すべての試薬と細胞を氷上に保ちます。
13. ACKで細胞をRTで約5分間インキュベートします。細胞を過度に溶解しないように、5分を超えないようにしてください。
14. FSMを9mL加えます。274 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
15. 上清を吸引します。チューブラックでチューブをそっと掻き集めて、セルペレットを砕きます。
16. FSM(4つの骨の容量、組み合わせた骨の数に基づいて調整できます)10mLを追加し、再懸濁します。
17. 各サンプルのアリコートを取り、製造元の指示に従ってヨウ化プロピジウム(PI)を追加します。セルカウンターで生細胞と総細胞をカウントします。
18. フローサイトメトリー解析12,13,14のために所望のマーカーを用いて、サンプルの抗体染色を進めます。

結果

機械的骨髄(BM)アブレーション手順の成功は、X線イメージングによって検証され、26G針が髄腔に挿入されました(図2A)。X線画像で針が不適切な角度で挿入された、または骨を貫通していることが示された場合、針は適切な角度で再挿入され、正確な配置を確認するために再画像化されました。成功した位置に到達できなかった場合、その動物は分析から除外されました。X線撮影の2次元(2D)イメージングでは、針がBMキャビティ内に挿入されたことを確認できますが、正確な針の経路を確認するには3次元(3D)イメージングが必要です。損傷の程度と位置は、大腿骨の定性的μCT分析により、組織採取時にさらに評価されました(図2B)。損傷後7日で、骨体積分率が7倍に増加し、海綿骨数が2倍になった(図2C-E)、海綿骨の厚さが増加し、小柱間隔が減少したことからも明らかなように、海綿骨の急速かつ強力な再生が見られました(

ディスカッション

その目的は、骨の修復を支配する分子的および細胞的プロセスを研究するための信頼性と再現性のある方法を確立することであり、骨格幹細胞および前駆細胞(SSPC)が骨髄空間/空洞内の骨沈着性骨芽細胞に直接変換することに焦点を当てていました。ここで説明する機械的骨髄アブレーション法は、機械的損傷による骨髄アブレーション用に最適化され検証されたプロトコルであり、膜内骨形成の調査を可能にします。このプロトコルのいくつかのステップは、損傷後の堅牢な骨形成と技術の再現性を確保するために重要です。1つ目は、大腿骨髄腔に針を正確に挿入することです。このステップでの位置ずれは、不完全な骨髄損傷や周辺組織の損傷につながり、結果のばらつきにつながる可能性があります。適切な針の配置を確保するためには、X線イメージングを利用して、骨髄腔をリーミングする前に針の配置を視覚化する必要があります。もう1つの重要なステップは、骨髄腔を生理食塩水で洗い流してBMの残り物を取り除き、骨髄を開梱して、その後の新しい骨形成のためのスペースを作ることです。このプロトコルへの修正は、特定の研究課題、マウス系統、遺伝子型、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10%ホルマリン溶液	Sigma-Aldrich	HT501128
25 G 0.625 in Air-tite EZ Flo Hypodermic Needle	Ait Tite/ Fisher Scientific	14-817-239; ref #NEZ25058
26 G 1/2" Disposable Hypodermic Needles	Exel International/ Fisher Scientific	14-840-83; ref #26402	任意の 26 G 針を代用でき、シリンジから取り外し可能でなければなりません
3 mL滅菌シリンジ	Fisherbrand/ Fisher Scientific	14-955-457
AB滅菌パッド	McKesson / Fisher Scientific	NC0593755	あるいは、オートクレーブ可能な吸収剤パッドを使用することもできます
酢酸、氷河	ミリポア Sigma	AX0073	%
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer	Gibco/ Thermo Fisher Scientific	A1049201	フローサイトメトリーの準備として赤血球の溶解に使用されます
麻酔導入チャンバー 2 L	VetEquip	941444
Betadine (Providone-Iodine) Solution	ペン獣医供給株式会社/フィッシャーサイエンティフィック	NC0158124
ブプレノルフィンHCL注射0.3mg / mL	ジェネリック/ Covetrus	59122	規制物質を購入するための州および連邦のDEAライセンスを取得する必要があります
Calcein-AM	Sigma Aldrich	206700-1MG
コラゲナーゼ P	ロシュ	11249002001	骨の消化に使用されます
綿棒とアプリケーター	フィッシャーブランド/フィッシャーサイエンティフィック	22-363-172
クライオフィルム Type II C(10) 3.5 cm	Section Lab CFS	105
DAPI染色液	Abcam	ab228549
デジタルグラムスケール	Toprime/ Amazon	B06X6LW4V9	任意のブランドのスケールを使用してマウスの秤量
解剖鉗子	フィッシャーブランド/フィッシャーサイエンティフィック	08-953E; 08-953F
解剖ハサミ	フィッシャーブランド/フィッシャーサイエンティフィック	08-940
低プロファイルのクライオスタット/ミクロトームブレードに耐える	タナー サイエンティフィック	TNR315LP
エチカXR ブプレノルフィン 徐放性 1.3 mg/mL	エチカXR/セベトラス	72117	規制物質を購入するための州および連邦のDEAライセンスを取得する必要があります
ファストグリーン、0.2%	電子ミスクロスコピー科学 EMS	50-319-57
ウシ胎児血清熱不活性化	Gibco/サーモフィッシャーサイエンティフィック	A5256801	FACS染色培地(FSM)
Fluoromount-G埋込液の製造に使用	サザンバイオテクノロジー	0100-01
グルシール外用皮膚接着剤	AD外科	GLU-550
ギ抗ウサギAlexa 647	モフィ	ッシャーA21244	1:300希釈
ハンクスの平衡塩溶液(HBSS)	Gibco /サーモフィッシャーサイエンティフィック	14065056	FACS染色媒体(FSM)
加熱パッド(大)	Boncare / Amazon	B0CLHSWXSX	任意のブランドの加熱パッドを使用できる、布カバーを取り外す
ヘマトキシリン	ミリポアシグマ/フィッシャーサイエンティフィ	M1051740500
ヒアルロニダーゼ	ミリポアシグマ	HX0514	骨の消化に使用
イソフルラン動物麻酔システム	VetEquip	901810
KUBTEC パラメータ 2Dキャビネット X線システム	OncoMedソリューション	N/A	任意のX線キャビネットイメージングシステムを使用することができます
マイクロ遠心分離機チューブス	コーニング/トーマスサイエンティフィック	8600A52
顕微鏡カバーガラス、18 mm x 18 mm、#1	グローブサイエンティフィック	1414-10
N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-2-エタンスルホン酸HEPES(1M)	Gibco/ Thermo Fisher Scientific	156300-80	FACS染色培地(FSM)の製造に使用Norland
Optical Adhesive NO61	Edmund Optical	37-322	クライオフィルム切片をスライドに接着するために使用
Osterix Rabbitモノクローナル抗体	Abcam	ab209484	1:500希釈
Peroxigard使用する準備ができてワンステップ消毒剤	Virox Technologies	29101	任意の他の臨床/ラボグレードの消毒剤
プロピジウムヨウ化物(PI)で置き換えることができます	Invitrogen/ サーモフィッシャーサイエンティフィック	P1304MP	核蛍光染色は、死んだ細胞の病巣率カウントを検出するために使用されます
充電式電気トリマー	ウォール/アマゾン	B001FWXKUE	任意のバリカンを使用でき、小型のトリマーは小さな動物を剃ることを容易にします
げっ歯類のノーズコーン	VetEquip	921609
サフラニンO、純度85%、認定	フィッシャーサイエンティフィック	AC419211000
Seal'Nの凍結のCryotrayの正方形型	電子Miscroscopy科学EMS	62642-01	埋め込むために使用されて、他の埋め込まれる型は使用することができる。この特定のモデルには、より深いモールドと、ブロックをシールするための蓋があります
硝酸銀	シグマ・アルドリッチ	S6506	フォン・コッサ染色用硝酸銀
滅菌リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)	Gibco/ Thermo Fisher Scientific	10010023	あるいは、ろ過されオートクレーブされた新たに調製されたPBSを使用することもできます
滅菌標準メス	インテグラ・ミルテックス/フィッシャー・サイエンティフィック	12-460-455
滅菌標準メス	インテグラミルテックス/フィッシャーサイエンティフィック	12-460-455
糖粉末1 KG	サーモフィッシャーサイエンティフィック	036508-A1
スーパーフロストプラスミスクロスコープスライドフィ	ッシャーブランド/フィッシャーサイエンティフィック	1255015	接着スライド
Sure-Tek ティッシュ プロセッシング/埋め込みカセット	フィッシャーブランド ヒストセット/フィッシャー・サイエンティフィック	22-048-141
ティッシュプラス 最適な切断温度 O.C.Tコンパウンド	フィッシャー・サイエンティフィック	23-730-571
ティッシュ・スポンジ	エプレディア/フィッシャー・サイエンティフィック	84-53	ティッシュ・スポンジは、組織を過剰増殖から保護します
トルイジンブルー	フィッシャー科学	AC348600050