Typha latifolia(ガマ)の培養と微生物のバイオオーグメンテーションのための最適化された方法

サマリー

チファ・ラティフォリアは主に根茎を介して無性繁殖しますが、その広範な根系により収集の課題が生じます。この論文では、種子から T. latifolia を育てる方法を提示し、実験室での栽培を容易にし、植物の無菌成長と微生物の早期バイオ増強の可能性を提供します。

要約

広葉ガマまたはヒヨドリとしてより一般的に知られているチファ・ラティフォリアは、世界中に広がり、北米の湿地生態系を支配しています。北米ではさまざまな種類のガマが侵入性であると考えられていますが、T. latifolia はこの地域の在来種と考えられており、優勢なチファ種として大陸全体で見られます。歴史的に、チファは食料源から建築材料に至るまで、さまざまな機能を果たしてきました。最近では、 T. latifolia バイオレメディエーションの取り組みを支援する著名な種として浮上しています。汚染物質浄化のための人工湿地処理システム(CWTS)の開発への関心が高まるにつれ、実験室環境でガマを栽培するための再現性のある技術が必要になっています。ここで紹介された研究は、種子からT.latifoliaの栽培を成功させるためのさまざまな成長パラメータを調査およびテストしました。チファ種の発芽を成功させるには、瘢痕化(種皮の破裂)が伴い、これは大規模生産のための機械的技術を使用して達成されました。早期の種子定着は、最初の 1 週間は栄養素の低い成長条件に有利に働き、その後の数週間は移植後の生存率を高めるために肥料を導入することが示されました。植物系の微生物によるバイオオーグメンテーションについては、種子を接種物に浸すと、根組織のより広範なコロニー形成と細菌の長期的な持続につながることが結果示されました。漂白剤と洗剤の組み合わせを使用した最適化された種子滅菌技術を使用して、微生物のコロニー形成の成功率を向上させました。この研究で設計された無菌および非無菌の両方の成長血管は、さまざまな条件下での T. latifolia の長期的な成長をサポートします。

概要

コストとエネルギー効率の高い技術として、建設湿地処理システム (CWTS) は、環境汚染物質の修復に大きな人気を集めています ^1,2,3。CWTSは、物理的、化学的、生物学的プロセスを使用して、汚染物質を除去、変換、または安定化します。化学的代謝回転に関与する物理的および化学的プロセスは、CWTSの起源以来十分に特徴付けられてきましたが、植生の影響はほとんど謎めいたままで^した2。近年、植物が廃水中の潜在的な懸念となる有機および無機汚染物質を変換するメカニズムを理解することにますます注目が集まっています^2,4,5。しかし、このような機構研究は、多数の大型植物を栽培し、種子からの成長を促進して、各植物が成長と発達の同じ段階にあることを確認する能力に依存しています。

北米のCWTSは、チファ、スキルプス、ジャンカス、フグマイト種など、この地域の自然湿地に自生する植生を使用して頻繁に確立されます^6,7。植生の選択は、採用されている人工湿地によっても異なり、深さ、水流、基質の調達、および水の調達(再循環の有無にかかわ^らず)が異なる場合があります2。最後に、気候は湿地の植生にも影響を与え、気候が冷涼なほど適応性が高まるため、水中植物が有利になります⁸。チファ種は、環境に急速にコロニーを形成し、多様な^{環境条件に}適応する能力があるため、深い地表流で構築された湿地で特に興味深いものです^9,10。

最近の結果のレビューでは、 チファ 種を使用した87の植物毒性試験のうち、種子から試験植物を開始した研究は15件のみであり、そのうち成熟した植物の成長を調べた研究は¹¹件のみであると報告されています。種子からのガマ実験のこの過小評価は、実験室研究のためのガマの栽培を説明することを目的としたプロトコルに関する文献のギャップを示しています。ここで概説するプロトコルは、無菌および非無菌条件下で種子から成熟植物までの Typha latifolia の成長に関する詳細なプロトコルを提示することにより、このギャップを埋めることを目的としています。さらに、この論文では、早期接種が導入された根茎および内生微生物の長期持続性を維持するのに役立つ種子段階でのガマ種の細菌バイオ増強の技術について説明します。

プロトコル

1.種子の傷跡化

1. ガマの種は、2023 年秋にカナダのアルバータ州カルガリーの湿地 (北緯 51.11312 度、西経 114.39381 度) から調達されました。秋にガマの花序を集め、使用するまで紙袋に入れて暗所で保管してください。まだ茎にある場合は、春に花序を集めますが、種子の回復は減少します。
2. 庭ばさみを使用して、花序の根元から~2cmの植物の茎を切ります。花序から種子を引き抜き、ブレンダーの容量が約4分の1になるまで実験室のブレンダーに入れます。これは、圧縮されていない約250mLの種子です。
3. ブレンダーに水道水500mLを入れます。ブレンダー内のヘッドスペースを10cm維持します。中低速で20秒間ブレンドし、すぐに大きな1 Lビーカーに移します。得られた溶液は粘性があるはずです。
4. この種子水スラッジの約100 mLをブレンダーに戻し、ブレンダーに400〜600 mLの新鮮な水道水を入れます。中高速で20秒間ブレンドし、すぐに新鮮な1 Lビーカーに移します。
5. ビーカーに水道水を800 mLまで満たし、少なくとも60秒間放置します。傷がついた生存可能なガマの種はビーカーの底に沈み、プルームとくちばし(ガマの種の構造の説明については 図1 を参照)が上部に浮きます。ビーカー上部のスラッジをすくい取り、下部の種を邪魔せずにビーカーからゆっくりと水を注ぎます。種子を100mLビーカーに移します。
6. 手順1.5の残りのガマスラッジでブレンドプロセスを繰り返します。
7. 種子の入ったビーカーを攪拌プレートに置き、中速で1時間回転させます。1時間後、ビーカーの上部に浮かんでいる植物材料をすくい取ります。
8. 真空に濾紙を取り付けたビュヒナー漏斗に種子を注ぎ、種子を一晩乾燥させます。乾燥種子は、15 mLの円錐形ポリプロピレンチューブに-20°Cで保存できます。

2. 非滅菌技術による発芽

1. 1%フィトア^ガー12を含む半強度のMurashigeおよびSkoog(MS)培地プレートを調製します。
2. 約1 mLの乾燥種子を15 mLの円錐形ポリプロピレンチューブに入れ、10 mLの水道水で満たします。オービタルシェーカーを低速で24時間回転させ、発芽を誘導します。
3. 15 mLの円錐形ポリプロピレンチューブに3 mLが残るように余分な水を取り除きます。
4. 1000 μLのプラスチックピペットチップの先端を切断してボアサイズを大きくし、シード溶液を激しくピペットでピペットングして、ピペットチップ内にシードを懸濁させます。
5. 半分の強度のMS寒天プレートに種子と水を置きます。プレートを回転させて種子を均等に分配します。
6. プレートを実験室のシーリングフィルムで包み、23°C、湿度70%で16時間/8時間の明暗サイクルで成長チャンバーに入れます。プレートを1週間(最大2週間)インキュベートして、種子の発芽を誘導します。

3.無菌技術による発芽

注:さまざまな種子滅菌プロトコルをテストし、比較しました。完全に滅菌された種子を生産しながら最高の発芽率を生み出す技術は、以前のプロトコル¹³ から修正され、ここで説明する。

1. 1%フィトア^ガー12を含む半強度MS培地プレートを調製します。
2. 約1 mLのシードを15 mLの円錐形ポリプロピレンチューブに入れ、10 mLの滅菌ddH₂Oで満たします。オービタルシェーカーに中高速で10分間置きます。
3. 水を取り除き、5 mLの0.1%ポリソルベート20溶液(滅菌ddH₂Oで調製)を15 mLのコニカルポリプロピレンチューブに加えます。オービタルシェーカーに中高速で10分間置きます。
4. 溶液を取り出し、5 mLの30%市販の漂白剤と0.025%ポリソルベート20溶液(滅菌ddH₂Oで調製)を15 mLのコニカルポリプロピレンチューブに加えます。中高速で30分間振とう。
5. 溶液を取り出し、滅菌ddH₂Oと交換します。中高速で5分間振とうします。合計3回の水すすぎを繰り返します。
6. 15 mLの円錐形ポリプロピレンチューブに滅菌ddH₂Oを充填し、低速で24時間回転させて発芽を誘導します。24時間後、プラスチックチューブに3 mLが残るように余分な水を取り除きます。
7. 1000 μLのプラスチックピペットチップの先端を無菌的に切断し、激しくピペットでチップ内に種子を懸濁させます。
8. 半分の強度のMS寒天プレートに種子と液体をプレートします。プレートを回転させて種子を均等に分配します。
9. プレートを実験室のシーリングフィルムで包み、23°C、湿度70%で16時間/8時間の明暗サイクルで成長チャンバーに入れます。プレートを1週間(最大2週間)放置して、発芽させます。

4. 選択された細菌による種子接種

1. ガマの種子を接種するには、まず上記の無菌種子発芽プロトコルに従ってステップ3.6まで、無菌種子を生産します。上記の手順3.6で説明したように、15 mLコニカルポリプロピレンチューブから最後の水すすぎを取り除きます。
2. 単一の分離株またはコミュニティから接種された一晩培養した微生物培養物を使用して、OD600を測定し、培地で希釈して1.0の吸光度値に正規化します。OD600 が 1.0 に達しない場合は、培養物を長期間インキュベートします。
   注:ここでは、アルバータ州北部の植物の根から単離された Luteimonas sp.から培養物を確立し、顕微鏡的な視覚化のためにDsRed蛍光タンパク質を発現するように結合しました。
3. 培養物1 mLを9300 x g で2分間スピンします。上清を取り除き、ペレットを1 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁します。9300 x g で 2 分間回転させます。
4. 上清を除去し、細菌ペレットを1 mLの滅菌ddH2Oに再懸濁します。
5. 15 mLの円錐形ポリプロピレンチューブで、0.025%有機シリコーン界面活性剤で調製した接種物の1:10希釈液10 mLで約1 mLの種子を低速で24時間振とうします。
6. ステップ3.8から始まる無菌種子発芽プロトコルの残りの部分に従います。

5. 土壌での非無菌ガマの成長

1. 鉢の上から1cmのスペースを残して、選択した低有機物の土で鉢を満たします。土を水道水で事前に湿らせ、土に1cmの穴を開けます。
2. ピンセットを使用して、根を傷つけないように注意しながら、上記の手順3で説明したように成長したMS寒天プレートから1週間発芽した苗をそっと取り除きます。土の各穴に苗をそっと置き、土で覆います。
3. 鉢をトレイに入れ、土の高さまで水道水を入れます。ポット10個ごとに、0.5%20/20/20NPK肥料を100mL加えます。
4. 10個のポットの各セットに、次のように肥料を追加します:2週目-100 mLの0.5%肥料、3週目-100 mLの1.0%肥料、4週目-100 mLの1.0%肥料。
5. 4週間後、毎週の施肥を中止し、1.0%肥料溶液100mLで月に1回だけ施肥します。4週間で、必要に応じて、より大きな鉢に移植します。この時点では、植物は土壌の種類にあまり敏感ではないため、任意の組み合わせを使用してください。
6. ガマが容器を超えたら移植を続けます。枯れ葉をハサミで取り除きます。月に一度、ガマに肥料を与えます。
7. 実験のために、苗木を小さなポットに移植し、空のピペットチップボックスの底に入れると、ボックスの側面で固定されます。これにより、土壌の適切な氾濫が可能になり、湿地の状態を模倣できます。古いガマで実験を行う場合は、鉢をほぼ完全に水に浸すことができるように同様に変更します。

6.無菌苗の成長

1. 苗成長室の設計
   注:各苗成長チャンバーユニットの組み立てには、2つの培養ボックス、ルアーロックチップ付きの1つのシリンジ、使い捨ての0.2μm滅菌フィルター、および耐熱シリコンが必要です。チャンバーのセットアップを視覚的に表現するには、 図2 を参照してください。
   1. 培養ボックスから蓋を取り外し、ハンドヘルドドリルを使用して蓋の中央に直径3.5cmの穴を開けます。耐熱シリコンを使用して、2つの蓋の上部を接着します。
   2. 培養ボックスの1つの下隅にシリンジチップのサイズ(直径~1 cm)の穴を開けます。注射器の先端を切り取り、注射器の本体を捨てます。
   3. 耐熱シリコンを使用して、ボックスの外側にあるルアーロックスレッドを使用して、シリンジの先端を培養ボックスに固定します。
   4. 使用前に少なくとも24時間前にシリコンを硬化させてください。
2. 土壌中の無菌成長
   1. ステップ3で説明した無菌種子発芽プロトコルに従って、無菌種子を取得します。
   2. 無菌成長チャンバーユニットに、水道水で濡らしたお好みの土を入れます。
   3. 液体で20分サイクルでオートクレーブし、ルアーロックの先端をアルミホイルで覆います。24時間後、液体20分サイクルでシステムを再度オートクレーブします。層流フードで後続のすべての手順を実行します。
   4. 0.2 μmのフィルターユニットを成長チャンバーのルアーロックアタッチメントに取り付けます(図2)。成長チャンバーを開き、500 μLのフィルター滅菌1%20/20/20肥料を土壌に加えます。滅菌ヘラで土を混ぜます。土壌を混合する際、滅菌ddH₂Oを加えて、過飽和することなく適切に水和されるようにします。
   5. 滅菌カミソリの刃を使用して、生後1週間の苗を含むプレートからMS寒天培地を4等分します。滅菌スパチュラを使用して寒天部分を土の上に置きます。
   6. 成長チャンバーユニットを、23°C、湿度70%で16時間/8時間の昼夜サイクルで植物成長インキュベーターに入れます。
3. 水耕栽培溶液での無菌成長
   1. ステップ3で説明した無菌発芽プロトコルに従って、無菌種子を取得します。
   2. ピペットチップボックスと半強度のMS寒天培地を液体20分サイクルでオートクレーブします。層流フードでは、チップインサートの底を滅菌実験室用シーリングフィルムで包みます。各ピペットチップの開口部を寒天でほぼ上まで満たします。
   3. チップインサートをチップボックスに戻し、ボックスの底に半分の強度のホーグランド水耕栽培成長液(0.5 mM NH₄H₂PO₄、3 mM KNO₃、2 mM Ca(NO₃)₂、1 mM MgSO₄、0.023 mM H₃BO₃、0.005 mM MnCl₂・4H₂O、0.0004 mM ZnSO₄・7H₂O、 0.0002 mM CuSO₄・5H₂O、0.00007 mM H₂MoO₄・1H₂O、および0.045 mM FeSO₄・7H₂O、pH 7.0に調整)。
   4. MS寒天プレートから苗木を慎重に取り出し、チップボックスインサートのピペット開口部にある寒天の上のMS寒天に置きます。
   5. チップボックスの蓋を閉め、23°C、湿度70%で16時間/8時間の昼夜サイクルで成長チャンバーに入れます。
   6. 植物がチップボックスに対して大きすぎる場合は、手順5.1で説明した培養成長チャンバーに移植します。移すには、植物と一緒に寒天プラグ全体を取り外し、放射状に切り込みを入れたフォームストッパーに移します。フォームストッパーは2つの培養ボックスの間に配置でき、下部の培養ボックスには半分の強度のホーグランドで満たすことができます。

結果

図1は、くちばしを取り除いた不完全に傷ついた種子、および傷跡のない種子とともに、瘢痕化プロセスを経たチ ファ の種子の表現を示しています。主に完全に傷つけられた種子を生産するのに十分なブレンド時間であることを確認してください。

種子を傷つけて乾燥させた後、非滅菌発芽技術を使用して種子の生存率をテストする必要があります。7日の終わりに、種子の少なくとも20%が芽組織で出現ラジカルを持っているはずです。発芽率が低い場合は、種子の生存率が低いか、成長条件が不十分であることを示している可能性があります。種子の滅菌は発芽率が高くなる傾向があります(図3)。滅菌は種子をさらに化学的に瘢痕化し、発芽を促進するのに役立つことが提案されています。

プレートから土壌に移動するとき、苗の約10%〜40%は生き残るはずです。無菌増殖条件下では、より低いレベルの生存率が期待できます。土壌に移植する場合、移植後1〜2週...

ディスカッション

ここで提示するプロトコルは、実験室での用途のための種子からのガマ種の成長に関する詳細なガイドを提供します。ガマは根茎の挿し木から簡単に繁殖できますが、種子から植物を始めることで、サンプル セット内の遺伝的変異が可能になり、植物が同等の成長段階にあることが保証され、微生物のバイオオーグメンテーション実験のための早期コロニー形成の機会が得られます。より侵略的なガマ種の繁殖は在来種の移動を促進する可能性があるため、収集されている種を正しく識別することが重要です¹⁴。さらに、侵略的な雑種は繁殖力が低下することが多く、根茎の活力が高まると、異交配の減少により遺伝的多様性が低下した湿地を支配できる可能性があります¹⁵。ガマの種はオンライン小売業者から入手できますが、国際自然保護連合(IUCN)の最も懸念されていない種としてリストされているため、許可なく公有地から収穫されることもあります¹⁶。ガマを収穫するときは、地元の植物識別キーを参照して...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.2 & micro;m無菌フィルター	VWR	514-4126
3′,5′-ジメトキシ-4′-ヒドロキシアセトフェノン	ファイトテック・ラボ	S7777
蓋付きの培養箱(77mm&時間;77mm&時間;97mm)	ミリポーア・シグマ	V8505
耐熱シリコーンシーラント高温用	インペリアル・マニュファクチャリング・グループ	KK0205
実験室用シーリングフィルム	ミリポーア・シグマ	P7793
村重とSkoogメディア	ファイトテック・ラボ	M401
オルガノシリコーン界面活性剤	ファイトテック・ラボ	S7777
植物過多類	ゴールドバイオテクノロジー	P1003
ポリソルベート20	ロシュ	11332465001