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方法論記事

新生児ウサギキットへの脳波および心電図テレメトリーデバイスの埋め込み

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DOI:

10.3791/67740

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2025年2月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 2Unit for Laboratory Animal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Pharmacology, University of Michigan, Ann Arbor, 4Department of Neurology, University of Michigan, Ann Arbor

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

てんかんにおける予期せぬ突然死(SUDEP)のメカニズムは十分に理解されておらず、現在のモデルから翻訳するのは困難です。トランスジェニックウサギは、これらのメカニズムについての洞察を提供する可能性があります。死に至る可能性のある重篤な事象を評価するために、トランスジェニックウサギキットにおける長期にわたる連続的な脳波記録および心電図記録の方法を説明します。

要約

イオンチャネル遺伝子の病原性多様体は、てんかんにおける予期せぬ突然死(SUDEP)の高い割合と関連しています。SUDEPのメカニズムはよくわかっていませんが、発作に加えて自律神経機能障害や心不整脈が関与している可能性があります。一部のイオンチャネル遺伝子は脳と心臓の両方で発現しており、てんかんや心不整脈に関連するイオンチャネル障害の患者ではSUDEPのリスクを高める可能性があります。てんかん変異体を発現するトランスジェニックウサギは、SUDEPの複雑な生理機能を研究するための全生物を提供します。重要なことに、ウサギはマウスモデルよりもヒトの心臓生理機能をより忠実に再現しています。ただし、ウサギモデルでは、侵襲的なモニタリング手順を受ける際に、健康と麻酔に関する追加の考慮事項があります。私たちは、新生児ウサギキットに長期同時脳波(EEG)と心電図(ECG)モニタリングのためのテレメトリーデバイスを外科的に埋め込む新しい方法を開発しました。ここでは、P14(重量範囲175-250g)キットにテレメトリーデバイスを埋め込む外科的手法を、外科的アプローチ、適切な麻酔とモニタリング、および術後ケアに細心の注意を払い、合併症の発生率を低くする方法を示します。この方法により、遺伝性てんかんまたは後天性てんかんのウサギモデルにおける心不整脈、発作、および潜在的なSUDEPの発症の重要なポイントにおいて、神経および心臓の電気生理学を継続的にモニタリングすることができます。

概要

てんかんにおける予期せぬ突然死(SUDEP)は、てんかん患者の主な死因です。SUDEPのメカニズムはよくわかっていませんが、発作1,2,3,4,5,6,7に加えて、自律神経機能障害、無呼吸、心不整脈が関与している可能性があります。チャネル障害に関連する遺伝性てんかんの患者は、SUDEPの発生率が最も高い。例えば、SUDEPは、生後1年以内に発症する遺伝性てんかんであるドラベ症候群の原因遺伝子である電位依存性ナトリウムチャネル遺伝子SCN1A8に変異を持つ患者の最大20%に発生します。てんかんに関連した多くのイオンチャネル遺伝子は、脳と心臓の両方で発現しており、実験室および臨床データは、チャネロパシーに関連した遺伝性てんかん患者に心不整脈が存在する可能性があることを示唆しており、7、9、10、11、12、発作誘発性致死性心不整脈、または発作と不整脈の同時発生によるSUDEPのリスクを高める可能性があります。実験室環境でのSUDEPの評価には、多くの課題があります。心臓の観点から見ると、マウスの心活動電位はヒト13とは非常に異なり、ヒトiPSC心筋細胞モデル14は生物全体の複雑さを再現することはできない。遺伝性てんかんのトランスジェニックウサギモデルは、ウサギの心臓生理学がヒトの心臓生理学13,15により近く再現されるため、SUDEPを研究するための理想的なシステムを提供します。また、複雑な病態生理学を研究するための全生物を提供します。SUDEPは最初の発作の早い時期に発生する可能性があるため、これらの動物モデルを早期に評価することは、発作と心不整脈の両方の発症を理解するために不可欠です。新生児期のビデオ録画は、ウサギのキットがまだ巣にいることが多いため、困難です。従来の有線システムによる連続脳波(EEG)または心電図(ECG)の記録は、キットがダムにある間は不可能です。断続的な録音では、SUDEP に関連するまれなターミナル イベントがキャプチャされる可能性は低いです。そのため、ウサギキットでの脳波と心電図の長期記録、連続性、同時記録を提供するために、ワイヤレス埋め込み型テレメトリモニタリングに目を向けました。

このプロトコルで成功するための鍵は、これらの脆弱な動物に対する適切な麻酔薬と術後サポートです。ウサギは、犬や猫(0.17%-0.24%)と比較して、麻酔薬による死亡のリスクがはるかに高い(1.39%-4.8%)、独特の解剖学的および生理学的特性16,17。この麻酔薬リスクの増加の主な要因には、最適でない気道管理と急性術後合併症が含まれます。ウサギの挿管の難しさには、長くて狭い口と広い舌、口と喉頭の間の鋭角、喉頭蓋の背側変位、喉頭外傷に対する感受性の増加、喉頭痙攣の傾向の増加など、複数の要因が寄与しています18,19,20。即時麻酔エピソードの後、ウサギは生命を脅かす胃腸うっ血症候群を発症するリスクがあります。これは複雑で多因子の問題であり、麻酔は、何らかの理由(緩和されない痛み、吐き気など)で胃の運動性および/または二次性食欲不振を進行的に阻害する直接的な薬物効果を介して寄与すると仮定されています。21.

ウサギの新生児と乳児のユニークな生理機能は、麻酔と手術に関連する課題を悪化させます。ウサギは、生理学的恒常性と特別な解剖学的考慮事項のための未発達のメカニズムで生まれたアルトリシアンヤングを持っています。ほとんどの市販製品は、オランダのベルト付きおよびニュージーランドのホワイトクロスウサギキットの小さな血管サイズ、高い安静時心拍数、色素沈着した皮膚に最適化されていないため、静脈内アクセスとモニタリングは困難です。新生児では心拍出量が基本的に心拍数に依存しており22 、一般に、腎臓または肝臓の経路による薬物クリアランスは成人23と比較して減少しているため、適切な薬物選択と投与量の検討が重要である。ウサギの麻酔薬による死亡の主な原因は、呼吸抑制と無呼吸に続発すると考えられています。すべてのウサギについてすでに議論されている気道管理の問題に加えて、新生児は低酸素血症と高炭酸ガス血症に直面して呼吸意欲が低下しているため、麻酔のこのすでに困難な側面がより危険になります24。

このプロトコルでは、外科的および麻酔薬の生存率が高いてんかんの新生児ウサギモデルにおけるEEGおよびECGテレメトリインプラント(図1)の成功した方法について説明します。この情報により、他の研究者は、てんかん、心不整脈、および関連する神経発達障害の研究を進めるために、困難な新生児ウサギモデルに取り組むことができます。

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プロトコル

記載されているすべての作業は、承認された動物使用プロトコルの一部として、ミシガン大学の動物管理および使用委員会によってレビューおよび承認され、USDA動物福祉法やNIH公衆衛生サービスポリシーなどの関連する連邦法およびガイドラインに沿ったものです。ミシガン大学はAAALACi認定機関です。

1.動物の調理

  1. 手術当日の麻酔時間を最小限に抑えるために、手術日の1〜2日前にラフシェービングキット(年齢P14-P19、体重>175g)をバリカンで行います。
  2. オートクレーブまたはガスは、手順の準備として、すべての手術器具と材料(可能な限り)を滅菌します。
  3. ケタミン (10 mg/kg IM)、ブプレノルフィン HCl (0.01 mg/kg IM) 0.3 mg/mL を 0.03 mg/mL に希釈し、セボフルランと酸素を非再呼吸回路を使用したマスク麻酔で麻酔を誘発します。
  4. 26 G 3/4インチ静脈内(IV)カテーテルを耳介静脈(推奨)または頭蓋静脈に留置し、ヘパリン化生理食塩水10ユニット/ mLで洗い流します。.
  5. #40または#50ブレードを使用して、腹部、胸、背中、首、頭をできるだけ肌に近づけて剃ります。
  6. 角膜潰瘍を防ぐために、非薬用潤滑眼軟膏を塗布します。.
  7. 鎮痛薬(カルプロフェン4 mg / kg SQ-25 mg / mLに希釈)と周術期抗生物質(セファゾリン20 mg / kg IVを50 mg / mLに希釈)を投与します。.手術時間の90〜180分ごとに抗生物質を再投与します。.

2. 手術準備(図2)

  1. 麻酔キットを手術台に移し、直腸体温計で制御される赤外線加熱パッドに仰向けで置きます。
  2. 鼻と口を、非再呼吸性ジャクソンリース回路(0.5 Lバッグ)にスイベルコネクタで接続されたカスタム3Dプリントフェイスマスクに入れ、酸素流量2 L /分でセボフルラン麻酔(効果1.5%-7%)を維持します。
  3. セボフルランで麻酔を維持し、耳または足のパルスオキシメーター、および/または大腿動脈または直接心臓のドップラーを使用して麻酔の深さを監視します。
  4. 心拍数(HR)を180〜260、酸素飽和度>85%)、呼吸数を毎分10〜50回維持するために、手順全体で麻酔を調整します(エクスカーションまたは再呼吸バッグの動きを直接視覚化します)。
    注:利用可能な緊急薬(グリコピロレート、エピネフリン、ドキサプラム)を用意してください。
  5. 前肢をマスクにそっとテープで固定して、キットをフェイスマスクに固定します。
  6. 左後肢を手術台にゆるく固定して、キットを少し右横の位置に配置します。
  7. ベタジンと滅菌生理食塩水を交互に温めた外科用スクラブで腹部全体を準備します。
    注:必要に応じて、追加の外科的解決策を使用してスクラブを仕上げることができます。外科医は、専用のスクラブ、ヘアボンネット、靴カバーを着用し、無菌状態で手術を行うために、滅菌ガウンと手袋を無菌的にスクラブして着用します。
  8. キットの両側に粘着性のサージカルタオルを置き、大きなサージカルドレープで覆います。腹部と胸部が露出するように適切なサイズの穴を開けます。
  9. インプラントを手術野に開き、非吸収性のアンカー縫合糸をインプラントの各アンカー穴に埋め込みます。縫合糸は5〜6cmの尾を取り付けたままにします(図3A)。温めた滅菌生理食塩水のボウルにインプラントを置きます。

3.腹部へのインプラントの配置

  1. 十分な麻酔を確保した後、メスでalba線に沿って皮膚を3cm切開します。
  2. 筋肉を慎重に切開して腹腔を開きます。
  3. インプラントを腹腔の頭蓋部分に留置し、切開部の左側に配置します。
  4. トロカールを使用して、負のECGワイヤーを腹腔からトンネルし、切開部の約2cmの右側に皮膚をトンネルします。残りの3本のワイヤーを切開部の左側に3〜4cmトンネルして、インプラントが腹腔内に快適に収まるようにします。
  5. アンカー縫合糸でインプラントを腹腔の腹壁に固定し、腸が閉じ込められないようにします(図3B)。
  6. 吸収性縫合糸で腹壁を連続パターンで閉じます。
  7. 皮膚の切開部を非吸収性の縫合糸で中断したパターンで閉じます。

4.ECGリードの配置

  1. ネガティブECGリードを皮下から胸部の右上部まで最初の肋骨のレベルでトンネルします。
  2. 皮下ポケットを鈍く解剖し、約10cmのワイヤーをゆるく巻きます。
    注意: 皮膚の下のタイトなコイルは、皮膚の侵食やワイヤーの露出につながる可能性があります。
  3. 余分なワイヤーを切断し、端を非吸収性の縫合糸で絶縁ワイヤーに結び付けて、露出したワイヤーとループを作成します。
  4. 2つの非吸収性縫合糸でループを筋肉に固定します。
  5. ワイヤーの周りの右側の腹膜筋を、1〜2本の吸収性縫合糸で中断したパターンで閉じます。
  6. 右上胸部と右腹部の皮膚を、2〜3本の非吸収性縫合糸で中断したパターンで閉じます。
  7. ポジティブECGリードを左下肋骨にトンネルし、上記の手順を繰り返して筋肉に固定し、切開部を閉じます。
  8. 脳波をトンネル化し、手術野で可能な限り左外側に皮下で導きます。
  9. 出現するワイヤーの周りの左側の腹膜筋に吸収性縫合糸を1つ追加します。非吸収性縫合糸で中断パターンで皮膚を閉じます。
  10. 露出したEEGワイヤーを滅菌アルミホイルで包みます。

5.背側表面の準備

  1. その後、非滅菌アシスタントが滅菌ドレープとレッグタイを取り外します。
  2. キットを腹臥位に回し(図2B)、フェイスマスクと回路の間のスイベルコネクタを使用して回転させることにより、フェイスマスクがしっかりと固定されるようにします。必要に応じてパルスオキシスおよび/またはドップラーモニターを調整して、継続的な麻酔薬モニタリングを確保します。
  3. ベタジンスクラブで頭、首、背中全体を含む手術野を準備し、左側の出口ワイヤーの領域の周りをスクラブするように注意します。
  4. 次に、外科医は左側の下に滅菌済みの粘着タオルを置き、ワイヤーのアルミホイルパケットは非滅菌のアシスタントによって保持されます。
  5. アルミパックからワイヤーを滅菌して静かに取り出し、滅菌フィールドに置きます。滅菌タオルでドレープを終了します。
  6. 滅菌ドレープで覆い、滅菌フィールド全体が露出するのに十分な大きさの窓を切り取ります。

6. 脳波リード線の配置

  1. 頭蓋骨を露出させるために、正中線で頭皮を3cm切開します。
  2. トロカールを使用して、左側から頭蓋骨までEEGリードを皮下トンネルでトンネルします。
  3. 露出した頭頂骨から骨膜をメスできれいにしてこすり落とします。
  4. ハンドヘルドドリルを滅菌超音波カバーに挿入します。1.0mmのドリルバリをドリルに挿入します。
  5. ラムダの前方約0.5cm、矢状縫合糸の横0.5cmの頭頂骨に両側のバリ穴を開けます。
    注:背側頭蓋骨にかかる圧力の量には注意してください これは腹側気道を閉塞する可能性があるため、手順のこの時点では呼吸モニタリングが重要です。心拍数の着実または大幅な低下は、呼吸器閉塞(無呼吸に続発する徐脈)を示している可能性があり、即時の評価と行動を促す必要があります。.
  6. 細い鉗子を使用して、バリ穴にネジを挿入します。ドライバを使用して、約半分まで挿入します(図3C)。
  7. 首の後ろに沿って皮下ポケットを鈍く解剖し、約10cmのワイヤーをゆるく巻き付けます。
  8. 余分なワイヤーを切断します。先端から絶縁体を剥がし、ワイヤーを伸ばします。
  9. 露出したワイヤーの端に結び目を作り、小さなループを保ちます。ループをネジの上に置き、ネジを頭蓋骨に締めて、ワイヤーがネジに接触していることを確認します。アース線を左側に、録音線を右側に配置します。
  10. 解析ソフトウェアでテレメトリ信号を評価して、すべてのワイヤが所定の位置に配置されたら、忠実度を確認します。キットが鎮静されている間、EEG信号は低振幅で現れます。
  11. ネジとワイヤーをデンタルアクリルで頭蓋骨に固定し、完全に硬化させます。
  12. 頭と左脇腹に非吸収性縫合糸で皮膚を閉じます。
  13. 各切開部でブピバカイン(最大用量2 mg / kgの5 mg / mLを2.5 mg / mLに希釈)を皮下注射します。.各切開部を、ツベルクリン注射器を使用して投与された少量の皮膚接着剤で覆います。

7. 麻酔の回復

  1. セボフルラン麻酔をオフにし、残りのテープ、ドレープ、麻酔薬のモニタリングを取り外しながら、少なくとも5分間酸素のみを提供します。
  2. 血糖値計で血糖値を確認し、体重(kg)の10%で温めた皮下液を投与します。
  3. 動物が痛みを伴う刺激(つま先のつま先つまみ)に反応したら、37〜38°Cに設定された回復インキュベーターに移動します。
    注:多くの場合、この転送中にキットの温度が大幅に低下します。キットをバイオフィードバック赤外線加熱パッドに戻すか、追加の補助熱を提供することが有益な場合があります。
  4. 直腸温、パルスオキシメータの測定値、心拍数、呼吸数を10〜15分ごとに視覚的に継続的に監視し、記録します。
  5. 動物が一貫して歩行可能で警戒状態になったら、静脈内カテーテルを取り外し、出血が止まるまでその部位に圧力をかけます。

8. 術後のケアとモニタリング

  1. キットをダムに戻し、仲間を産みます。ネスティング材と補助栄養(材料表)がケージ内で利用可能であり、体温調節と回復を助けるために利用可能であることを確認してください。
  2. 手術後7〜10日間は毎日キットをチェックし、毎日体重を量り、ケージ内で栄養を補給します。
  3. 回復後最初の2日間(D1およびD2)は、24時間ごとに追加の鎮痛薬(カルプロフェン4 mg / kg SQ-5 mg / mLに希釈)と皮下液(5〜7 mL)を投与します。.
  4. 回復後最初の3日間(D1、D2、およびD3)は、1日2回キットをチェックし、痛み、歩行、切開の外観、および水分補給の証拠を評価します。この期間中は1日1回、感染の証拠がなく、適切な体温調節ができないことを確認するために、キットの体温を測定してください。
  5. 切開が7〜10日で適切に治癒する場合は、縫合糸を抜いてください。

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結果

このプロジェクトの成功には、インプラント手順と記録プロトコルの複数のパラメーターの開発が必要でした。インプラント手術は16のウサギキットで試みられたか、または行われ、14のウサギが手術を成功裏に生き残った。そのうち12機が実験の終点まで生き残った。術中または術後の死亡の理由は、実験エンドポイントの達成における将来の成功を可能にする手順の変更とともに、 表 1 で強調表示されています。最も一般的な手術合併症は呼吸抑制であり、低酸素症と徐脈を引き起こしました。このプロトコルは、2つのパルスオキシメータとドップラーモニターを含む複数のモニタリングモダリティを含むように変更されました。これにより、手術中に1台のモニターが故障したり緩んだりした場合のバックアップ監視が可能になります。さらに、ウサギの皮膚色素はパルスオキシメトリーの信頼性を低下させる可能性があり、体の複数のポイントからのモニタリングが必要になります。導入と回復は一般的に麻酔の最もリスクの高い期間と考えられていますが、処置中の他のポイントで徐脈につながる呼吸抑制が観察され、常に警戒したバイタルサインモニタリングの必要性が浮き彫りになりました。この合併...

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ディスカッション

麻酔薬の導入、モニタリング、およびサポートについて記載されているプロトコルは、外科的アプローチの研究ニーズと容易さと獣医ケアのゴールドスタンダードとのバランスを取ります。ラボが記載されているプロトコルを標準的な手順として採用する前に、背側皮下インプラントの配置、気管内チューブまたは喉頭マスク気道の使用、心拍数モニタリングのための食道聴診器アタッチメントの使用など、他のいくつかの潜在的な改良が試みられました。しかし、最終的にはさまざまな理由ですべてが放棄されました。テレメトリーの配置には十分な皮下スペースがありますが、テレメトリー本体とワイヤー出口の設計によりデッドスペースを閉じることができないこと、動物の成長を可能にするためのワイヤーの位置決めと巻き取りの課題、およびECGリードを確保するために術中に必要な2つの位置変更により、手術時間が大幅に延長され、不必要な物流上の課題が追加されました。さらに、マスク麻酔の使用は一般的に推奨されていませんが、適切なサイズのLMAがなく、留置後に気管内チューブを固定して維持できないため、これらを選択肢として排除していました。手術中にキ...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

著者らは、NIH R61NS130070 LLIへの資金提供に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1インチ弾性ラップ - CobanまたはVetwrap3Mhttps://www.3m.com/3M/en_US/p/d/b00003186/
4-0 PDSモノフィラメント縫合糸Ethiconhttps://www.jnjmedtech.com/en-US/company/ethicon/all-products
5-0 エチロンナイロン縫合糸Ethiconhttps://www.jnjmedtech.com/en-US/company/ethicon/all-products
AcquisitionコンピュータDellhttps://www.dell.com/en-us
粘着性サージカルタオルN/AN/A
麻酔回路 - Jackson-Reevs with 0.5 L リブリージングバッグJorVetJ0248GA
Betadine スクラブN/AN/A
ピビカイン (0.5%)N/AN/A投与前に 2.5 mg/mL に希釈
ブプレノルフィン (0.3 mg/mL)N/AN/A投与前に0.03 mg/mLに希釈 
バー - 1.00 mmCell Point Scientific60-1000リル頭蓋
カファゾリン (1 g lypholized)N/AN/A50 mg/mL に希釈
カルプロフェン (50 mg/mL)MWI 獣医投与前に 25 mg/mL に希釈
ットンチップアプリケーターN/AN/
カスタム 3D プリント フェイスマスクN/Ahttps://www.thingiverse.com/thing:923725
歯科用アクリルN/A/A
ダイエットジェル Criticareクリア H2O72-05-5042栄養サポート 
ドッパージェル - アクアソニックパターソン 07-890-5542
ドップラー - Vet-Dop2Patterson07-888-8986
ドキサプラム (20 mg/mL)MWI 獣医N/A緊急のみ
Dumont #5 ファイン鉗子ファインサイエンスツール11254-20ネジ保持用
Duraprep3M8630最終皮膚準備心
電図自動データ解析ソフトウェアemka technologiesN/A
エピネフリン (1:1000)MWI 獣医N/A緊急のみ
ガーゼN/AN/A
コメーター ipet ProMWI Veterinary63867回復不良の場合モニター
グリコピロレート (0.2 mg/mL)MWI 獣医N/A緊急のみ
グラムスケールN/AN/A
止血器ファインサイエンスツール13008-12ループを所定の位置に結びながらワイヤーループを保持
理想的なマイクロドリルセルポイントサイエンティフィック67-1204蓋骨を掘削する
インキュベーターDRE-獣医 (Infantia - NB1)N/A
誘導ボックスVetEquip941444
赤外線加熱パッド - RightTemp JrKent Scientific CorporationRT-0502
IOX2データ収集ソフトウェアemka technologiesN/A
IV カテーテル - Covidein Monoject 26 G, 3/4 inch PTFE パターソン 07-836-8494
ケタミン (100 mg/mL)MWI 獣医N/A
医療用テープN/AN/A
ナローパターン鉗子 - ストレート/12 cmファインサイエンスツール11002-12
新生児聴診器超音波 N/A
オルセン・ヘガー はさみ付きニードルホルダー - 12 cmファインサイエンスツール12002-12縫合用
眼科用軟膏 PuralubeMWI 獣医N/A麻酔中に両眼に投与
眼科用潤滑剤 - Paralube VetPatterson 07-888-2572
パルスオキシメーター (AccuWave Portable )Patterson07-892-9128準備と回復用、心拍数を最大 400 まで読み取り
パルスオキシメーター (SDI - Vet/Ox plus 4700)HeskaN/A術中; 製品終了
レシーバーemka テクノロジーN/A テレメトリ インプラント 4 個ごとに 1 個のレシーバー
腸体温計N/AN/A
メスファインサイエンスツール10003-12
さみファインサイエンスツール14002-12ドレープをカットするには
ドライバー - 1.0 mmN/AN/A電子機器用ミニドライバーセットから
ネジ 00-96 x 3/32 (2.4 mm)Protech International8L0X3905202F
セボフルランMWI 獣医メンテナンス麻酔
セボフルラン気化器および麻酔機N/AN/A
皮膚接着剤、GlutureMWI 獣医34207注射器で控えめに塗布
小さなはさみファインサイエンスツール14084-08
滅菌アルミホイルN/AN/Aを回転させる前にワイヤーを巻き付けるには 
滅菌ペイントブラシN/AN/A歯科用アクリル を塗布するには;
滅菌生理食塩水N/AN/A
滅菌手術用手袋N/AN/A
菌超音波カバーN/AN/A ドリルを覆うには
滅菌水N/AN/A セファゾリン再構成用
外科用ブレード no. 15N/AN/A
外科用ドレープN/AN/A
手術用ガウンN/AN/A
スイベルコネクタ - Jorgensen LabsPatterson 07-802-2349麻酔回路をフェイスマスクに接続するには
テレメトリーインプラントemka technologies easyTEL+_M1_EETA_B_35
トロカールSAITRO-10-6トンネルワイヤーへ
ブ ド骨 コA N・グルします 頭ます 直 は 動物 滅

参考文献

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