オープンソースのMicro-Managerプラグインを開発し、構造化照明顕微鏡で蛍光双極子のライブビュー観察を可能にしました。このプラグインは、2Dと3Dの両方の双極子向きの観測をサポートしています。
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この記事について
サマリー
要約
蛍光偏光顕微鏡(FPM)は、蛍光色素の位置と双極子配向を画像化できます。超解像蛍光偏光顕微鏡の成果にもかかわらず、取得後への依存がリアルタイム観察を妨げています。偏光構造化照明顕微鏡(pSIM)は、蛍光双極子の超解像イメージングを高速に行え、生細胞アプリケーションに最適です。私たちは、偏光画像のリアルタイム再構成と蛍光双極子の表示のためのオープンソースの実装を開発しました。さらに、3D方位マッピング(3DOM)を達成するために手法を拡張し、複雑な生物学的研究への有用性を広げました。さらに、既存のSIMマイクロスコープを偏光イメージングに拡張する方法を徹底的に紹介し、マイクロスコープを制御するためのMicro-Manager 2.0の詳細な構成ガイドを提供し、偏光イメージングのリアルタイムプレビューを可能にしました。さらに、pSIMと3DOMの両方を網羅する完全な再構成のためのMATLABコードを提供しています。この包括的なガイドは、初心者が操作をすばやく習得し、簡単に開始できるように支援することを目的としています。
概要
蛍光偏光顕微鏡(FPM)は、蛍光色素の位置と双極子の配向の両方を同時にイメージングするための強力な技術として登場し、生物学的イメージング1,2に深い洞察を提供しています。FPMは、生体分子の配向の方向観察を容易にすることにより、アクチン3,4,5、微小管5、セプチン6、DNAフィラメント7-9、核孔複合体10、膜タンパク質11などの高分子の複雑な配列を明らかにします.その高速、非侵襲的、および生細胞互換の機能により、高い時間分解能11,12で分子回転ダイナミクスの追跡が可能になります。バイオフォースプローブと統合すると....
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プロトコル
1. 既存の構造化照明顕微鏡を偏光イメージング用に拡張
- SIMマイクロスコープを準備します。
注:読者は顕微鏡のセットアップに一定の基礎があり、すでに構造化された光学顕微鏡を所有していることを前提としています。関連する経験がない場合は、SIMマイクロスコープの構築方法16について詳しく説明したこのホワイトペーパーを参照してください。「HWP+WQP+LCVR」の偏波制御ユニットは、当社のpSIMワーク5 ではピザ渦波板、またはピザ半波板17に置き換えることができる。 - 空間光変調器(SLM)に異なるパターンをロードすることにより、3つのストライプ方向の偏光消光比を測定します。対物レンズの直後に偏光子を配置して回転させ、パワーメーターを使用してレーザー出力を測定します。pSIMの場合、波長板を回転させて、消光比が10>3方向のs偏光を維持します。
- 3DOM の場合、HWP2 を回転させて 6 方向の p 偏光を維持します。SIM 空間マスクを 3DOM 空間マスクに置き換えて、6 方向の 1 次ビームが通過できるようにします ( 図 1B を参照)。
注:pS....
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結果
pSIM法は、s偏光レーザービームを使用した干渉に基づいてSIM顕微鏡で実行できます。S偏光干渉は、最も広く使用されているタイプのSIMであり、高コントラストの照明ストライプを生成します。顕微鏡セットアップのアカデミックプロトタイプは、pSIM5のオリジナル作品に含まれています。 図1で簡単に紹介すると、空間光変調器(SLM)は±1オーダーの回折ビームを生成し、ピザ半波長板は3方向のS偏光を維持します。他のSIMの代替品では、回折ビームを生成するために格子を使用したり、s偏光を維持するために他の偏光変調法を使用したりすることがありますが、これらの顕微鏡は偏光イメージングのために拡張することもできます。
3DOM顕微鏡は、2つの違いがあるにもかかわらず、同様の光学イメージングシステム(図1A
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ディスカッション
私たちの研究では、pSIMと3DOMという2つの偏光イメージング技術をリアルタイムでプレビューできるプラグインを開発しました。どちらの技術も、わずかな変更を加えるだけで既存のSIMシステムで実行できます。pSIMと3DOMマイクロスコープのインストール手順と、マイクロスコープを制御するためのMicro-Managerのセットアップ、ライブビュー偏光結果の取得方法の詳細な手順を提供しました。実験結果には、pSIMでイメージングしたアクチンフィラメントと3DOMでイメージングしたλ-DNAが含まれています。ファロイジン双極子の配向はアクチンフィラメントの方向とほぼ平行ですが、STOYOX Orange蛍光色素の配向はDNA軸に対して垂直です。構造化照明顕微鏡は、ゴルジ装置、微小管ネットワーク18、および小胞体19の高時空間分解能イメージングも達成できる。
pSIMと3DOMの両方用にカスタマイズされたプラグインを開発しました.......
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開示事項
著者は、利益相反を宣言しません。
謝辞
この研究は、中国の国家重点研究開発プログラム(2022YFC3401100)の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 100 nm 蛍光ビーズ | Invitrogen | F8801 | |
| 4% ホルムアルデヒド溶液 | Invitrogen | R37814 | |
| カメラ | Tucsen | Dhyana 400BSI V3 | |
| https://www.tucsen.com/download-software/ 義歯基材 (タイプ I 熱硬化型、液体) | ニューセンチュリーデンタル | N/A | |
| ダルベッコ」のモディファイドイーグル」s 中 | Gibco | C11995500BT | |
| Eclipse TE2000 倒立顕微鏡 | Nikon | TE2000 E | |
| ウシ胎児血清 | Gibco | 10099141C | |
| MATLAB R2019b | MathWorks | Version R2019b | |
| https://ww2.mathworks.cn/downloads/ MetroCon V4.0 | Kopin | Version 4.0 | 空間光変調器 |
| のソフトウェアマイクロマネージャー 2.0 | μ&ミュー;anager | Version 2.0 | Download Micro-Manager 最新リリース |
| MS-2000 XYZ Automated Stage | Applied Scientific Instrumentation | MIM3 | |
| https://www.asiimaging.com/support/downloads/usb-support-on-ms-2000-wk-controllers/ myDAQ | National Instruments | 781325-01 | ソフトウェアとドライバのダウンロード - NI |
| OBIS 561 nm LS 20 mW Laser | Coherent | 1325777 | |
| ファロイジン-AF568 | Invitrogen | A12380 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 | コーニング | 21-040-CV | |
| ポリメタクリル酸メチル | Solarbio | M9810 | |
| ProLong Diamond | Invitrogen | P36980 | |
| 空間光変調器 | Kopin | SXGA-12 | |
| SYTOX オレンジ核酸染色 | Invitrogen | S11368 | |
| Triton X-100 | Invitrogen | HFH10 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | |
| &λ;-DNA | Invitrogen | S11368 |
参考文献
- Zhanghao, K., Gao, J., Jin, D., Zhang, X., Xi, P. Super-resolution fluorescence polarization microscopy. J Innov Opt Health Sci. 11 (01), 1730002(2018).
- Alonso, M. A., Brasselet, S. Polarization microscopy: from ensemble structural imaging....
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再版と許可
