初期ゼブラフィッシュ幼生における低分子スクリーニングと毒性試験

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、近年、強力な脊椎動物モデル生物として登場し、生物医学研究を進めるための研究でますます人気が高まっています¹。ヒトのタンパク質コード遺伝子の約70%は少なくとも1つのゼブラフィッシュオルソログを持っており、ゼブラフィッシュ²ではヒトの病気の原因となる遺伝子の~82%が少なくとも1つのオルソログ遺伝子を持っています。遺伝的保存は、同様の基本的な臓器のパターン形成と形態と相まって、ゼブラフィッシュをヒト疾患研究の興味深いモデルにしており、医薬品開発に不可欠な分子レベル^1,2,3での種間比較を可能にしています。

ゼブラフィッシュは急速に成長し、受精後10時間(hpf)に尾芽が形成され、最初の体節は16hpfで現れます。胚は、受精後2~3日(dpf)で絨毛膜から出ます。4 dpfまでに消化管が完全に発達し、5 dpfまでに水泳用膀胱が膨らみ、自由に泳ぎ回ったり、餌を探したりできるようになりました。5 dpfで給餌する能力にもかかわらず、給餌されていない幼虫は、少なくとも7 dpfまで卵黄由来の栄養素のみで生存することができ、汚染を引き起こし、薬物スクリーニング、毒物学、および行動試験を妨げる可能性のある外部給餌の必要性を回避します⁴。7 dpfまでに、幼虫はまた、心臓と血管系、筋肉、および骨^5,6を含むいくつかの基本的な臓器系を備えた完全なボディプランを作成します。ゼブラフィッシュの胚も生体外で受精し、外部で発生し、生命初期には光学的に透明であるため、遺伝子編集や低分子のスクリーニングに非常にアクセスしやすい^3。さらに、その小さなサイズと高い繁殖率により、より多くの複製を含めることができ、統計検出力が向上するだけでなく、マルチウェルプレートの使用により、薬物量を節約し、スループットを向上させることができます。

動物モデルにおける新規低分子のスクリーニングは、薬剤が有益な効果または有害な効果を生じる能力を決定するために重要であり、したがって、さらなる試験に有効な化合物と、その活性を変更するために修飾が必要な可能性のある他の化合物を特定します。薬物スクリーニングプロセスの一環として、標的化合物の致死濃度50(LC₅₀)を特定する必要があります。これにより、予備的な毒性試験の一環として、試験動物の50%で死に至る作業濃度が得られます。

ゼブラフィッシュの胚における受精後96時間までの毒性試験(hpf)には、標準化されたプロトコル、すなわち魚胚急性毒性(FET)試験(TG236)^が存在します7。FET試験では、新たに受精した卵子を最大96時間5濃度の化学物質に曝露し、致死性の兆候、すなわち(i)卵子の凝固、(ii)体節形成の欠如、(iii)卵黄嚢からの尾芽の剥離の欠如、および(iv)心拍の欠如を観察します。この試験により、急性毒性とLC₅₀の測定が可能になります。さらに、スクリーニングに使用するテストチャンバーのサイズ(24ウェルプレート)、テストチャンバー内の卵子の分布、ハウジング条件などについてもアドバイスし、有効で再現性のある結果を確保します⁷。

FET試験は胚期の毒性試験に適していますが、4dpfを超えることはありません。この時点付近で発生し始める表現型(例えば、脊索⁶の石灰化)の場合、そのような組織の形態学的評価を可能にするために、薬物スクリーニングは4dpf以上進行する必要があります。さらに、薬物曝露は、関心のある表現型が発達する少なくとも1日前に開始することをお勧めします。私たちの知る限り、初期段階のゼブラフィッシュの幼生、特に3〜7dpfのゼブラフィッシュの薬物スクリーニングには、FETと同様の標準化されたプロトコルは存在しません。ゼブラフィッシュの幼生における4dpf以上の薬物試験について記述した研究がいくつか発表されていますが、試験室のサイズ、生物学的および技術的な反復回数、培地の変化率、曝露時間、評価された形態学的欠陥など、利用される方法論には一貫性がありません8,9,10,11,12,13 .このため、標準化された毒性試験とそれに続くゼブラフィッシュの幼生の3-7 dpfでの形態学的変化の視覚的観察のための検証済みプロトコルを開発しました。提案されたプロトコルは、その後、行動解析、遺伝子発現プロファイリング、および組織形態計測などの他の下流の表現型アッセイに利用できます。

ゼブラフィッシュは、EU指令2010/63/EUに従って取り扱われました。すべての実験は、マルタ大学の教員研究倫理委員会(FREC)および合同FREC動物研究部門小委員会(JFARSS)によって承認されました。提案されたプロトコルのフローチャートを 図1に示します。

1.卵の生産、収集、およびメンテナンス

1. 最後の餌付けから少なくとも1時間後、前日に魚を繁殖水槽に設置し、オスとメスを分離する仕切りを設置します。より良い卵生産結果を得るには、女性と男性の比率を高くします。魚を14時間:10時間の明暗サイクルと27-28°Cの周囲温度を備えた部屋に設置します。
   注:1 Lの飼育水槽は3匹の成魚を収容できますが、1.7 Lの飼育水槽は5匹の成魚を収容できます。
2. 翌朝、光が入り始めたら、飼育タンクの水を交換し、仕切りを取り外します。飼育水槽が傾きにくい場合は、傾斜した位置に置き、交配を促進するために浅瀬が利用できるようにします。産卵と交配活動が遅い場合は、45分ごとに繁殖タンクの水を交換してください。魚を最大3時間、または必要に応じて交尾させます。
3. 交配が完了したら、卵を産まなかった雌を優しく絞って、長期的な卵の結合を防ぎます。魚をそれぞれの水槽に戻します。
4. メッシュストレーナーを使用して繁殖タンク内の卵を収集し、胚水(E3)ですすぎ、E3の入ったシャーレに入れます。E3を調製するには、16.67 mLの60x E3(300 mM NaCl、10 mM KCl、20 mM CaCl_{2.2H 2}O、20 mM MgSO 4.7H₂O)を1 mLの0.01%メチレンブルーおよび982 mLの脱イオン水と混合します。未受精卵や破片をすべて取り除きます。100 mm x 15 mmのペトリ皿あたり50個の卵と、150 mm x 15 mmのペトリ皿あたり120個の卵があり、ペトリ皿が混雑していないことを確認してください。
5. 卵を28.5°Cにセットし、14時間:10時間の昼夜サイクルを備えたインキュベーターに保管します。1 dpfで、E3をリフレッシュし、生存不能な卵を取り除き、真菌の増殖を制限します。

2. テストプレートの準備

1. 3 dpfで、100 μLの容量に設定された1,000 μLマイクロピペットを使用して、健康そうな孵化した胚1個を96ウェルプレートの各ウェルに移します。
   注:孵化していない胚は、化合物の取り込みが変動する可能性があるため、使用しないでください。健康に見える胚を使用することで、試験中のバイアスも制限されます。ピペットチップのサイズにより、ゼブラフィッシュの胚を物理的に損傷を与えることなく簡単に採取できます。さらに、マイクロピペットは、トランスファーピペットとは対照的に、ウェルに分注される量をより適切に制御できます。
2. 12ウェルプレートで、各試験化学物質の所望の濃度を別々のウェルで調製します(ここでは、100 μMから6.25 μMの濃度範囲のボスチニブ)。各ウェルに、マイクロピペットを使用して必要な量の試験薬液を追加し、E3を使用して最大2.4mLにします。
   注:関連する試験化学物質に使用する適切な濃度を決定するために、文献検索を実施する必要があります。情報が利用できない場合は、適切な濃度範囲が決定されるまで、いくつかの濃度を試すことができます。最低5つの濃度を使用する必要があり、最高濃度は100%の死亡率を引き起こし、最低濃度は観察可能な影響を引き起こさない⁷。
3. ストックテストケミカルの溶解に使用する溶媒に応じて、車両制御を準備します。
   注:多くの試験化合物は水溶性ではないため、水溶液を生成するには、エタノールやジメチルスルホキシド(DMSO)などの特定の溶媒(「ビヒクル」)に溶解する必要があります。DMSOは、ビークルコントロールとして使用する場合、1%の濃度を超えないことが望ましいが、これはゼブラフィッシュ¹⁴において安全であることがわかった濃度である。
4. 200 μLマイクロピペットを使用して96ウェルプレートに存在するE3溶液をすべて取り出し、試験対象の対応する培地100 μLと交換します。濃度ごとに合計24匹の幼虫を必ずテストしてください。シングルまたは8チャンネルの200μLマイクロピペットを使用して、試験薬品を対応する試験プレートウェルに移します。コントロール(E3、化学車両、ポジティブコントロールなど)を含めます。
   注:プレートのセットアップは、最大4つの異なる試験化学物質または同じ化学物質の4つの異なる濃度に対応します。図 1に、同じ化学物質(ボスチニブなど)の5つの濃度とコントロールを併用して調査するためにセットアップされたテストプレートの例を示します。
5. 曝露後24時間で、形態学的スコアリング(セクション3で説明)を行い、半培地を交換し、50μLの培地を取り除き、新たに調製した培地と交換します。その過程で死んだ幼虫をすべて取り除いて記録します。幼虫を28.5°Cに設定し、14時間:10時間の昼夜サイクルを備えたインキュベーターに保管します。7 dpf までこのプロセスを繰り返します。

3. 形態素評価

1. 実体光学顕微鏡を使用して、個々の試験幼虫を適切な倍率で観察します。
   注:評価可能な形態学的欠陥の例を 表1に示します。
2. 形態は2人の独立したスコアラーによって評価され、2人のスコアラー間で意見の相違がある場合は3人目のスコアラーに相談します。
3. 「不在」は正常な形態(「0」とスコア付け)を示し、「現在」は形態学的異常の存在(「1」とスコアリング)を示すバイナリ法(つまり、存在/不在)を使用して形態をスコアリングします。 図2 は、2日間の薬物曝露後の5 dpfのゼブラフィッシュの例を示しています。これには、影響を受けていないゼブラフィッシュ(図2A)、軽度の心膜浮腫(図2B)、卵黄出血と卵黄の伸展を伴う重度の心膜浮腫(図2C)、色素沈着の減少による発達の遅延、遊泳用膀胱と全長(図2D)、卵黄の腫れと尾びれのねじれ(図2E)、 尾びれの欠如(図2F)、湾曲した脊索(図2G)、切断(図2H)、および壊死を伴う死亡(図2I)。すべての異常な表現型を「1」、影響を受けていないゼブラフィッシュを「0」として採点します。

4. LC₅₀ の決定

1. 形態評価に続いて、濃度に対する7dpfでの累積死亡率をプロットします。例を 図 3 に示します。濃度曲線を使用して、50% の死亡率を引き起こす濃度を推定します。
2. LC₅₀ 濃度が推定されたら、96ウェルプレート内の24匹の複製幼虫をこの単一の推定LC₅₀ 濃度に曝露することにより、上記の実験を繰り返します。

5. 技術的なレプリケート

1. 選択した5つの濃度の同じ化学物質を使用して、少なくともさらに2回、別々の2回にわたって手順全体を繰り返し、結果が再現性があることを確認します。

異常は、7 dpf まで、実験タイムライン全体で個別または累積的に調べることができます。異常ごとの最大形態スコアを使用して、形態学的異常を使用される幼虫の数のパーセンテージとして計算できます。たとえば、7 日目に心膜浮腫の形態スコアがスコアラー 1 と 2 でそれぞれ 19 と 20 の場合、可能なスコアが 24 の場合、つまり 24 匹のうち 19 匹または 20 匹の幼虫が心膜浮腫を示している場合、パーセンテージ スコアは次のように計算できます。

補足表S1 は、慢性骨髄性白血病の治療に適応されるチロシンキナーゼ阻害剤である化合物ボスチニブの毒性試験後の4 dpfでの形態学的スコアリング結果(両方のスコアラー)を示しています15。同じ形態スコアリングが、5 dpfから7 dpfの露出魚に対して繰り返されます。この化合物は、100 μMから6.25 μMの濃度範囲を使用して試験しました。異なる時点で3回の技術的反復が行われ、7 dpfでの平均累積死亡率を使用して、幼虫の50%が生存する濃度であるLC50を決定しました。LC50 は、任意の露光時間時点で測定できます。ただし、これを 7 dpf で計算することをお勧めします。

7 dpf での累積平均死亡率を使用して、図 3 に示す LC50 曲線を生成しました。ボスチニブの場合、LC50濃度は37.95μMと推定されました。

注:この推定LC50 濃度は、このモデルシステムに厳密に適用され、その後、さらに下流の表現型アッセイに使用できます。

図1:3-7 dpfでの幼虫における提案された薬物スクリーニングの概略図。 96ウェルテストプレートは、化合物ボスチニブの100 μMから6.25 μMまでの5つの濃度の調査用にセットアップされています。略語:dpf =受精後日数。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ゼブラフィッシュの幼生に観察された代表的な形態学的欠陥、5dpfでさまざまな化学物質濃度に曝露されたとき(曝露後2日で)。(A)対照(影響を受けない)ゼブラフィッシュ、(B)軽度の心膜浮腫を示すゼブラフィッシュの幼生、(C)重度の心膜浮腫と卵黄出血を伴うゼブラフィッシュ、(D)発達遅延、色素沈着の減少、小さな遊泳膀胱を伴うゼブラフィッシュ、(E)卵黄が腫れ、尾びれがねじれたゼブラフィッシュ、(F)尾びれがないゼブラフィッシュ、(G)湾曲した脊索を持つゼブラフィッシュ、(H)尾が切り詰められたゼブラフィッシュ、 (I)壊死したゼブラフィッシュの死骸。欠陥は赤い矢印で示されます。スケールバー = 1 mm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:死亡率に対する濃度を示すLC50曲線。試験した5つの濃度は、100 μM、50 μM、25 μM、12.5 μM、および6.25 μMであり、死亡率はそれぞれ100%、100%、29.2%、12.5%、および12.5%でした。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:薬物曝露研究後に観察できる視覚形態学的欠陥のリスト。

補足表S1: 4 dpf(曝露後1日)でのボスチニブの代表的な形態学的結果。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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