初期ゼブラフィッシュ幼生における低分子スクリーニングと毒性試験

サマリー

このプロトコルは、受精後3〜7日のゼブラフィッシュの幼生における薬物スクリーニング手順と、それに続く形態学的評価を説明しています。

要約

ゼブラフィッシュは、ヒトトランスレーショナルリサーチ、低分子や環境汚染物質の毒性試験、治療薬の発見、その他の生物医学研究への応用において、著名なモデル生物となっています。提示されたプロトコルは、初期段階のゼブラフィッシュの幼生(受精後3〜7日齢、dpf)の薬物スクリーニングと毒性試験の明確なガイドを提供することを目的としています。ゼブラフィッシュの幼生における毒性試験について、いくつかの方法論が発表されていますが、曝露時間、培地変化率、形態スコアリングなどに関する標準化されたプロトコルは存在しません。実験を行うのに理想的な幼虫の年齢、その年齢に最適なプレートサイズ、試験化合物の無駄を抑えながら信頼性の高い結果を提供する培地交換率、統計的に容易に定量化できる形態スコアリングシステムを実験的に決定しました。この原稿では、3〜7 dpfのゼブラフィッシュ幼生における毒性試験のプロトコルが詳細に説明されており、薬物毒性試験のギャップを狙い、魚胚急性毒性試験と同様の標準化された方法への第一歩を踏み出すことを目的としています。

概要

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、近年、強力な脊椎動物モデル生物として登場し、生物医学研究を進めるための研究でますます人気が高まっています¹。ヒトのタンパク質コード遺伝子の約70%は少なくとも1つのゼブラフィッシュオルソログを持っており、ゼブラフィッシュ²ではヒトの病気の原因となる遺伝子の~82%が少なくとも1つのオルソログ遺伝子を持っています。遺伝的保存は、同様の基本的な臓器のパターン形成と形態と相まって、ゼブラフィッシュをヒト疾患研究の興味深いモデルにしており、医薬品開発に不可欠な分子レベル^1,2,3での種間比較を可能にしています。

ゼブラフィッシュは急速に成長し、受精後10時間(hpf)に尾芽が形成され、最初の体節は16hpfで現れます。胚は、受精後2~3日(dpf)で絨毛膜から出ます。4 dpfまでに消化管が完全に発達し、5 dpfまでに水泳用膀胱が膨らみ、自由に泳ぎ回ったり、餌を探したりできるようになりました。5 dpfで給餌する能力にもかかわらず、給餌されていない幼虫は、少なくとも7 dpfまで卵黄由来の栄養素のみで生存することができ、汚染を引き起こし、薬物スクリーニング、毒物学、および行動試験を妨げる可能性のある外部給餌の必要性を回避します⁴。7 dpfまでに、幼虫はまた、心臓と血管系、筋肉、および骨^5,6を含むいくつかの基本的な臓器系を備えた完全なボディプランを作成します。ゼブラフィッシュの胚も生体外で受精し、外部で発生し、生命初期には光学的に透明であるため、遺伝子編集や低分子のスクリーニングに非常にアクセスしやすい^3。さらに、その小さなサイズと高い繁殖率により、より多くの複製を含めることができ、統計検出力が向上するだけでなく、マルチウェルプレートの使用により、薬物量を節約し、スループットを向上させることができます。

動物モデルにおける新規低分子のスクリーニングは、薬剤が有益な効果または有害な効果を生じる能力を決定するために重要であり、したがって、さらなる試験に有効な化合物と、その活性を変更するために修飾が必要な可能性のある他の化合物を特定します。薬物スクリーニングプロセスの一環として、標的化合物の致死濃度50(LC₅₀)を特定する必要があります。これにより、予備的な毒性試験の一環として、試験動物の50%で死に至る作業濃度が得られます。

ゼブラフィッシュの胚における受精後96時間までの毒性試験(hpf)には、標準化されたプロトコル、すなわち魚胚急性毒性(FET)試験(TG236)^が存在します7。FET試験では、新たに受精した卵子を最大96時間5濃度の化学物質に曝露し、致死性の兆候、すなわち(i)卵子の凝固、(ii)体節形成の欠如、(iii)卵黄嚢からの尾芽の剥離の欠如、および(iv)心拍の欠如を観察します。この試験により、急性毒性とLC₅₀の測定が可能になります。さらに、スクリーニングに使用するテストチャンバーのサイズ(24ウェルプレート)、テストチャンバー内の卵子の分布、ハウジング条件などについてもアドバイスし、有効で再現性のある結果を確保します⁷。

FET試験は胚期の毒性試験に適していますが、4dpfを超えることはありません。この時点付近で発生し始める表現型(例えば、脊索⁶の石灰化)の場合、そのような組織の形態学的評価を可能にするために、薬物スクリーニングは4dpf以上進行する必要があります。さらに、薬物曝露は、関心のある表現型が発達する少なくとも1日前に開始することをお勧めします。私たちの知る限り、初期段階のゼブラフィッシュの幼生、特に3〜7dpfのゼブラフィッシュの薬物スクリーニングには、FETと同様の標準化されたプロトコルは存在しません。ゼブラフィッシュの幼生における4dpf以上の薬物試験について記述した研究がいくつか発表されていますが、試験室のサイズ、生物学的および技術的な反復回数、培地の変化率、曝露時間、評価された形態学的欠陥など、利用される方法論には一貫性がありません8,9,10,11,12,13 .このため、標準化された毒性試験とそれに続くゼブラフィッシュの幼生の3-7 dpfでの形態学的変化の視覚的観察のための検証済みプロトコルを開発しました。提案されたプロトコルは、その後、行動解析、遺伝子発現プロファイリング、および組織形態計測などの他の下流の表現型アッセイに利用できます。

プロトコル

ゼブラフィッシュは、EU指令2010/63/EUに従って取り扱われました。すべての実験は、マルタ大学の教員研究倫理委員会(FREC)および合同FREC動物研究部門小委員会(JFARSS)によって承認されました。提案されたプロトコルのフローチャートを 図1に示します。

1.卵の生産、収集、およびメンテナンス

1. 最後の餌付けから少なくとも1時間後、前日に魚を繁殖水槽に設置し、オスとメスを分離する仕切りを設置します。より良い卵生産結果を得るには、女性と男性の比率を高くします。魚を14時間:10時間の明暗サイクルと27-28°Cの周囲温度を備えた部屋に設置します。
   注:1 Lの飼育水槽は3匹の成魚を収容できますが、1.7 Lの飼育水槽は5匹の成魚を収容できます。
2. 翌朝、光が入り始めたら、飼育タンクの水を交換し、仕切りを取り外します。飼育水槽が傾きにくい場合は、傾斜した位置に置き、交配を促進するために浅瀬が利用できるようにします。産卵と交配活動が遅い場合は、45分ごとに繁殖タンクの水を交換してください。魚を最大3時間、または必要に応じて交尾させます。
3. 交配が完了したら、卵を産まなかった雌を優しく絞って、長期的な卵の結合を防ぎます。魚をそれぞれの水槽に戻します。
4. メッシュストレーナーを使用して繁殖タンク内の卵を収集し、胚水(E3)ですすぎ、E3の入ったシャーレに入れます。E3を調製するには、16.67 mLの60x E3(300 mM NaCl、10 mM KCl、20 mM CaCl_{2.2H 2}O、20 mM MgSO 4.7H₂O)を1 mLの0.01%メチレンブルーおよび982 mLの脱イオン水と混合します。未受精卵や破片をすべて取り除きます。100 mm x 15 mmのペトリ皿あたり50個の卵と、150 mm x 15 mmのペトリ皿あたり120個の卵があり、ペトリ皿が混雑していないことを確認してください。
5. 卵を28.5°Cにセットし、14時間:10時間の昼夜サイクルを備えたインキュベーターに保管します。1 dpfで、E3をリフレッシュし、生存不能な卵を取り除き、真菌の増殖を制限します。

2. テストプレートの準備

1. 3 dpfで、100 μLの容量に設定された1,000 μLマイクロピペットを使用して、健康そうな孵化した胚1個を96ウェルプレートの各ウェルに移します。
   注:孵化していない胚は、化合物の取り込みが変動する可能性があるため、使用しないでください。健康に見える胚を使用することで、試験中のバイアスも制限されます。ピペットチップのサイズにより、ゼブラフィッシュの胚を物理的に損傷を与えることなく簡単に採取できます。さらに、マイクロピペットは、トランスファーピペットとは対照的に、ウェルに分注される量をより適切に制御できます。
2. 12ウェルプレートで、各試験化学物質の所望の濃度を別々のウェルで調製します(ここでは、100 μMから6.25 μMの濃度範囲のボスチニブ)。各ウェルに、マイクロピペットを使用して必要な量の試験薬液を追加し、E3を使用して最大2.4mLにします。
   注:関連する試験化学物質に使用する適切な濃度を決定するために、文献検索を実施する必要があります。情報が利用できない場合は、適切な濃度範囲が決定されるまで、いくつかの濃度を試すことができます。最低5つの濃度を使用する必要があり、最高濃度は100%の死亡率を引き起こし、最低濃度は観察可能な影響を引き起こさない⁷。
3. ストックテストケミカルの溶解に使用する溶媒に応じて、車両制御を準備します。
   注:多くの試験化合物は水溶性ではないため、水溶液を生成するには、エタノールやジメチルスルホキシド(DMSO)などの特定の溶媒(「ビヒクル」)に溶解する必要があります。DMSOは、ビークルコントロールとして使用する場合、1%の濃度を超えないことが望ましいが、これはゼブラフィッシュ¹⁴において安全であることがわかった濃度である。
4. 200 μLマイクロピペットを使用して96ウェルプレートに存在するE3溶液をすべて取り出し、試験対象の対応する培地100 μLと交換します。濃度ごとに合計24匹の幼虫を必ずテストしてください。シングルまたは8チャンネルの200μLマイクロピペットを使用して、試験薬品を対応する試験プレートウェルに移します。コントロール(E3、化学車両、ポジティブコントロールなど)を含めます。
   注:プレートのセットアップは、最大4つの異なる試験化学物質または同じ化学物質の4つの異なる濃度に対応します。図 1に、同じ化学物質(ボスチニブなど)の5つの濃度とコントロールを併用して調査するためにセットアップされたテストプレートの例を示します。
5. 曝露後24時間で、形態学的スコアリング(セクション3で説明)を行い、半培地を交換し、50μLの培地を取り除き、新たに調製した培地と交換します。その過程で死んだ幼虫をすべて取り除いて記録します。幼虫を28.5°Cに設定し、14時間:10時間の昼夜サイクルを備えたインキュベーターに保管します。7 dpf までこのプロセスを繰り返します。

3. 形態素評価

1. 実体光学顕微鏡を使用して、個々の試験幼虫を適切な倍率で観察します。
   注:評価可能な形態学的欠陥の例を 表1に示します。
2. 形態は2人の独立したスコアラーによって評価され、2人のスコアラー間で意見の相違がある場合は3人目のスコアラーに相談します。
3. 「不在」は正常な形態(「0」とスコア付け)を示し、「現在」は形態学的異常の存在(「1」とスコアリング)を示すバイナリ法(つまり、存在/不在)を使用して形態をスコアリングします。 図2 は、2日間の薬物曝露後の5 dpfのゼブラフィッシュの例を示しています。これには、影響を受けていないゼブラフィッシュ(図2A)、軽度の心膜浮腫(図2B)、卵黄出血と卵黄の伸展を伴う重度の心膜浮腫(図2C)、色素沈着の減少による発達の遅延、遊泳用膀胱と全長(図2D)、卵黄の腫れと尾びれのねじれ(図2E)、 尾びれの欠如(図2F)、湾曲した脊索(図2G)、切断(図2H)、および壊死を伴う死亡(図2I)。すべての異常な表現型を「1」、影響を受けていないゼブラフィッシュを「0」として採点します。

4. LC₅₀ の決定

1. 形態評価に続いて、濃度に対する7dpfでの累積死亡率をプロットします。例を 図 3 に示します。濃度曲線を使用して、50% の死亡率を引き起こす濃度を推定します。
2. LC₅₀ 濃度が推定されたら、96ウェルプレート内の24匹の複製幼虫をこの単一の推定LC₅₀ 濃度に曝露することにより、上記の実験を繰り返します。

5. 技術的なレプリケート

1. 選択した5つの濃度の同じ化学物質を使用して、少なくともさらに2回、別々の2回にわたって手順全体を繰り返し、結果が再現性があることを確認します。

結果

異常は、7 dpf まで、実験タイムライン全体で個別または累積的に調べることができます。異常ごとの最大形態スコアを使用して、形態学的異常を使用される幼虫の数のパーセンテージとして計算できます。たとえば、7 日目に心膜浮腫の形態スコアがスコアラー 1 と 2 でそれぞれ 19 と 20 の場合、可能なスコアが 24 の場合、つまり 24 匹のうち 19 匹または 20 匹の幼虫が心膜浮腫を示している場合、パーセンテージ スコアは次のように計算できます。

補足表S1 は、慢性骨髄性白血病の治療に適応されるチロシンキナーゼ阻害剤である化合物ボスチニブの毒性試験後の4 dpfでの形態学的スコアリング結果(両方のスコアラー)を示しています¹⁵。同じ形態スコアリングが、5 dpfから7 dpfの露出魚に対して繰り返されます。この化合物は、100 μMから6.25 μMの濃度範囲を使用して試験しました。異なる時点で3回の技術的反復が行われ、7 dpfでの平均累積死亡率を使用して、幼虫の50%が生存する濃度であるLC₅₀を決定しました。LC₅₀ は、任意の露光時間時点で測定できます。ただし、これを 7 dpf で計算することをお勧めします。

7 dpf での累積平均死亡率を使用して、図 3 に示す LC₅₀ 曲線を生成しました。ボスチニブの場合、LC₅₀濃度は37.95μMと推定されました。

注:この推定LC₅₀ 濃度は、このモデルシステムに厳密に適用され、その後、さらに下流の表現型アッセイに使用できます。

図1:3-7 dpfでの幼虫における提案された薬物スクリーニングの概略図。 96ウェルテストプレートは、化合物ボスチニブの100 μMから6.25 μMまでの5つの濃度の調査用にセットアップされています。略語:dpf =受精後日数。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ゼブラフィッシュの幼生に観察された代表的な形態学的欠陥、5dpfでさまざまな化学物質濃度に曝露されたとき(曝露後2日で)。(A)対照(影響を受けない)ゼブラフィッシュ、(B)軽度の心膜浮腫を示すゼブラフィッシュの幼生、(C)重度の心膜浮腫と卵黄出血を伴うゼブラフィッシュ、(D)発達遅延、色素沈着の減少、小さな遊泳膀胱を伴うゼブラフィッシュ、(E)卵黄が腫れ、尾びれがねじれたゼブラフィッシュ、(F)尾びれがないゼブラフィッシュ、(G)湾曲した脊索を持つゼブラフィッシュ、(H)尾が切り詰められたゼブラフィッシュ、 (I)壊死したゼブラフィッシュの死骸。欠陥は赤い矢印で示されます。スケールバー = 1 mm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:死亡率に対する濃度を示すLC₅₀曲線。試験した5つの濃度は、100 μM、50 μM、25 μM、12.5 μM、および6.25 μMであり、死亡率はそれぞれ100%、100%、29.2%、12.5%、および12.5%でした。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

形態学的欠陥	形容
心膜浮腫	心臓の周囲に体液が溜まり、心臓が伸び、血液循環が機能不全になる
心拍数(分あたり)	1分あたりのビート数の削減
黄身	-心臓の欠陥と同時に発生する可能性のある卵黄浮腫または出血の有無
卵黄エクステンション	腫れている、薄い、または存在しない卵黄
湾曲した脊索	ねじれた、または起伏のある脊索、および/または湾曲した尾の存在
鰾	水泳用膀胱の存在、不在、または部分的な発達
色素沈着	メラノサイトは、同じ年齢の未処理の魚と比較して少ないか、まったくありません
壊死	-体のいずれかの部分に壊死の存在(軽度または重度)または欠如
開発の遅れ	同じ年齢の野生型コントロールと比較して、開発が遅れたり、停滞したりしました。
タッチへの反応	驚愕後の応答の遅延または応答なし(ピペットチップの使用など)
切り捨て	後部ゼブラフィッシュの体がない(つまり、尾の形成)
フィン	薄い卵黄の伸展を伴う可能性のある尾びれの有無
体軸の縮小	正常に見える魚は、測定すると体長が短くなります

表1:薬物曝露研究後に観察できる視覚形態学的欠陥のリスト。

補足表S1: 4 dpf(曝露後1日)でのボスチニブの代表的な形態学的結果。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ゼブラフィッシュは、薬物スクリーニングの重要なモデルとなっています。毒性試験を実施するための方法論を決定しようとしたとき、異なる実験室^{8,9,10,11,12,13}からいくつかの対照的な方法を見つけました。記載されている方法では、さまざまな年齢の幼虫、さまざまな実験タイムライン、さまざまな媒体の変化率、およびさまざまな形態スコアリングシステムを使用します。試行錯誤を重ねながら、記載した方法論を確立し、信頼性と再現性のある結果が得られました。

プレートサイズの選択
当初、実験は24ウェルプレートで行われ、幼虫が移動して成長するのに十分なスペースがあることを確認しました。プレートは、ウェルあたり10匹の幼虫、濃度あたり2匹のウェル、およびウェルあたり1mLの薬物溶液で配置されました。この配置では再現性のある結果が得られず、幼虫が井戸から同量の薬物を吸収していなかったという推論につながりました。その後、96ウェルプレートと48ウェルプレートを使用し、ウェルごとに1匹の幼虫を飼育して試験を行ったところ、96ウェルプレートの幼虫は成長に問題がないことが示されました。したがって、実験は、より少ないスペースと薬物量を使用して96ウェルプレートで続けられました。

毎日、媒体が変わる
ゼブラフィッシュは培地から薬剤を吸収しているため、培地中の薬剤の濃度を一定に保つためには、ある程度の培地交換が必要であることを確認しました。さらに、媒体交換により、井戸に蓄積された潜在的な廃棄物が除去されるため、有毒な環境を提供し、偏った結果につながる可能性があります。ボスチニブを用いた試験では、同じ薬剤に対して3つのプレートを設置し、1つは毎日培地を半額交換、もう1つは毎日半量を交換、もう1つは毎日完全に培地を交換したもので行われました。中程度の変化がなかったプレートは死亡率の増加を示しましたが、中程度の変化が半分と完全に行われたプレートは、7 dpf で同じ結果をもたらしました。したがって、毎日半媒介を選択することになりました。この選択により、さらなる下流実験で必要となる可能性のある高価で限られた試験材料の消費量が削減されます。

曝露時間
このプロトコルで選択された試験幼虫の年齢と薬物曝露期間は、骨の石灰化である関心のある表現型によって駆動されました。骨形成は~4 dpfで始まるため、試験化学物質が骨の発達の開始に影響を与えるかどうかを判断するために、ゼブラフィッシュを3 dpfで開始することを選択しました。その後、8 dpf以降で高い死亡率が観察されたため、結果を偏らせる可能性のある摂食不足を考慮して、薬物曝露研究を7 dpfで終了しました。それにもかかわらず、時間枠は、研究の性質と関心のある表現型に応じて調整される場合があります。

制限
この方法論にはいくつかの制限があります。3 dpfのゼブラフィッシュをマルチウェルテストプレートに移すには時間がかかります。幼虫を拾わずに井戸から培地を取り出すことも同様に面倒です。培地は、シングルチャンネルピペットを使用して各ウェルからゆっくりと取り出す必要があり、その過程で幼虫が損傷を受けないようにする必要があります。さらに、毎日半量交換することで試験化合物が補充され、ウェルからの老廃物の除去が保証されますが、曝露の5日間を通じてウェル内の安定した薬物濃度を維持できることを保証するものではありません。高速液体クロマトグラフィー分析により、各幼虫が実際に吸収される薬物量についてさらに洞察を得ることができますが、この検査はもはやハイスループットスクリーニング法とは見なされません。

結論として、この方法論は、ゼブラフィッシュを用いた毒性試験のギャップを4dpf以上で埋めることを目的としており、野生型、変異型、トランスジェニックゼブラフィッシュの系統に適用可能な標準化されたプロトコルに向けた一歩を踏み出すことを目的としており、これは胚期のFETと同等です。これにより、初期の段階では不可能だった他のダウンストリーム表現型アッセイへの道が開かれます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mL微量遠心チューブ	Starlab	E1415-1510
10 µLマイクロピペット (P10)	ギルソン	F144802
10月20日 & マイクロ;Lピペットチップ	Starlab	S1110-3810
1000 & マイクロ;Lマイクロピペット(P1000)	ギルソン	F123602
1000 &マイクロ;Lピペットチップ	Starlab	S1111-6001
12ウェルプレート	Starlab	CC7672-7512	滅菌済み、シングルラップ、未処理、蓋付き
20 µLマイクロピペット (P20)	ギルソン	F123600
200 µLマイクロピペット(P200)	ギルソン	F123601
200 µLマルチチャンネルピペット	ギルソン	F81024
200 & マイクロ;Lピペットチップ	Starlab	S1113-1006
96ウェルプレート	Starlab	CC7672-7596	滅菌、シングルラップ、平底、未処理、蓋付き
内側グリッド傾斜底、タンク仕切り、蓋付き	Tecniplast	ZB17BTISLOP、ZB17BTE、 ZB17BTL、	ZB17BTD傾斜インナータンク
メッシュストレーナー	/	/
ニトリル手袋	メルカトル	/	/
ペトリ皿	Starlab	CC7672-3394/CC7672-3359	100 x 20 mm or 60 x 15 mm
ライカ M205 FCA 蛍光実体顕微鏡	ライカ	10450826
ペルチェ冷却インキュベーター(ライトモジュール付き棚2個付き) コールドホワイト	Memmert	IPP110ecoplus, T8	デイ/ナイトサイクル
メチルスルホキシド	Biochem Chemopharma	504341000	に1%溶液を調製する
	Biochem Chemopharma	303080500	E3
硫酸マグネシウム七水和物	Biochem Chemopharma	313060500	E3
塩化カリウム	Biochem Chemopharma	316030500	E3
SCREEN-WELL Wnt Pathway library (Bosutinib)	Enzo	BML-2838-0500
塩化ナトリウム	Fisher Scientific	S/3161/53	E3 を調製する