方法論記事

in vitroアッセイを用いた消化管線虫卵に対するTithonia diversifolia抽出物の抗酸化および駆虫特性の評価

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DOI：

10.3791/67760

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2025年8月1日

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1Multidisciplinary Center for Technological Research, National University of Asunción (CEMIT - UNA), 2Centre of Marine Sciences (CCMAR/CIMAR LA), University of Algarve, 3Department of Food Biochemistry, Biodiversity, Food and Health Group (BIOALSA), Faculty of Chemical Sciences, National University of Asunción (FCQ - UNA), 4Carleton College

この記事について

サマリー

この研究では、ラジカルベースの方法と in vitro 卵孵化アッセイ (EHA) を使用して Tithonia diversifolia 抽出物の生物学的活性を評価し、小型反芻動物の消化管線虫への影響を評価しました。方法論と主な発見が説明され、寄生虫を制御するためのこれらの抽出物の可能性が強調されています。

要約

胃腸線虫 (GIN) によって引き起こされる寄生虫症は、動物福祉を著しく損ない、生産コストを増加させるため、世界中の家畜生産の重要な制限要因と考えられています。何年もの間、寄生虫の駆除はもっぱら合成薬物の使用に依存してきました。市販の駆虫薬に対するGINの耐性は、世界中でますます報告されています。したがって、生理活性の可能性を持つ植物の探索など、家畜の GIN を制御するための代替アプローチが登場しました。 Tithonia diversifolia は一年中収穫でき、植物のすべての部分は、幅広い病気の民間療法で使用されています。この研究では、水と70%水溶液アセトン抽出物のin vitro 抗酸化特性を評価しました T . diversifolia 葉、枝、花を含む地上部のラジカルベースの方法を使用して、その駆虫の可能性を寄生虫モデルを通じて評価し、水抽出物を使用した卵孵化アッセイ(EHA)を採用しました。さらに、抽出物の総ポリフェノール含有量が測定されました。これらの発見は、 T. diversifolia が抗酸化化合物および駆虫化合物の有望な天然源であることを浮き彫りにしています。

概要

消化管線虫 (GIN) によって引き起こされる寄生虫症は、動物福祉を著しく損ない、生産コストを増加させるため、世界中の家畜生産の重要な制限要因と考えられています1。寄生虫と家畜の関係は、宿主に関連するいくつかの要因、すなわち動物の抵抗力と回復力の遺伝的特徴、動物の栄養状態、寄生のレベル、および関与する寄生虫集団の病原性の影響を受けます2。

何年もの間、寄生虫の駆除は合成駆虫薬のみに依存してきました。しかし、長期にわたる排他的使用は耐性の出現につながり、その有効性を低下させ、代替戦略の探索を促しています3.さまざまな駆虫薬に対する線虫の耐性は世界中でますます報告されており、特に熱帯地域で懸念されるシナリオを示しています4。さらに、消費者は、動物の肉と環境中の抗寄生虫薬の残留を減らす必要性をますます認識しています5。したがって、家畜の線虫寄生虫を制御するための代替アプローチが登場しました6。

Tithonia diversifolia は中央アメリカ原産の熱帯低木で、反芻動物の生産システムにとって価値のある独特の特徴を持っています。一年中収穫でき、植物のすべての部分は伝統的に先住民コミュニティによって民間療法でさまざまな病気を治療するために使用されてきました。局所的には腹痛、傷、皮膚病、筋肉障害の軽減に応用されており、経口投与は感染症、マラリア、発熱、肝炎、糖尿病の管理にも採用されている。これらの多様な治療用途は、その幅広い薬効の可能性を浮き彫りにしています7.

酸化ストレスは、宿主生物と生き残ろうと奮闘する寄生生物の両方において、寄生虫感染症の発症と進行に重要な役割を果たします8。このため、抗酸化活性の検出は、駆虫作用のある薬用植物抽出物の生物学的活性を評価するために非常に重要です。寄生虫感染により、宿主の抗酸化物質の濃度が低下し、細胞成分の酸化生成物の濃度が増加します。寄生虫の場合、宿主との相互作用を延長し、宿主生物で生成される酸化ストレスから身を守るためには、酸化バランスを維持することが不可欠です9。

駆虫薬に対する耐性の発達と急速な広がりの証拠は、一般的に使用される治療法が効果がなくなる可能性があるという懸念を引き起こしています。したがって、卵孵化アッセイ (EHA) と呼ばれる in vitro 試験を使用して、消化管線虫のベンゾイミダゾール (BZ) に対する感受性または耐性を評価します。この検査は、卵に対する植物抽出物の駆虫活性を評価し、用量の関数としてその活性を比較するために一般的に使用されます。このアッセイの主な制限の1つは、テスト間の卵の孵化のばらつきです。卵子の生存率は最大3時間に制限されており、迅速な回復と迅速な開始が必要です。それにもかかわらず、孵化率は異なる場合があります。このため、結果が有効であると見なされるには、卵の少なくとも70%が対照群で孵化する必要があることが確立されています10,11。これは、安価で、迅速で、簡単で、再現性のあるテストです12,13,14。

GIN 制御の代替手段を模索するための植物抽出物の使用は、二次代謝産物の存在とその生理活性の可能性に基づいています。この研究分野における課題の1つは、二次代謝産物の量と安定性であり、これらは生物的および非生物的要因、ならびに抽出プロセスによって誘発される化学的ストレスによるものであるため、15、16、17。

この研究では、抽出に使用される溶媒の種類に応じて生物学的活性(抗酸化作用と駆虫作用)の違いが生じる可能性があり、それがポリフェノールの組成、ひいてはそれらの生物活性に影響を与える可能性があるという仮説を立てました。この原稿の目的は、簡単に複製できる in vitro モデルを使用して抽出物の評価で取られた手順を概説することでした。

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プロトコル

CEMIT動物倫理委員会は、動物操作を含むすべての実験を承認します。卵子提供者の動物は、予防診断目的で糞便サンプルを提供することでCEMITと協力している農場に属しています。これらの動物は、性別を問わず、1歳以上の羊またはヤギ(特定の品種なし)であり、サンプル採取前の15日以内に駆虫されてはなりません。参加するすべての農場には、研究目的でのサンプルの使用について知らされ、研究に参加することに同意します。採卵については、まず近隣の施設に通知し、許可が得られたら、新鮮な糞便サンプルを採取するための現地訪問が組織され、3 時間以内に処理が確実に行われます。この研究で使用された試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. 植物材料の準備

  1. 植物種を採取するのに適した場所を選択してください。
  2. 分類学的識別と植物標本の準備のために、 Tithonia diversifolia の少なくとも2つの標本を収集します。
  3. 最低1000 gの T.diversifolia の空中部分を集めます。
  4. 回収したバイオマスを室温(約26°C、 図1参照)で乾燥させる。
  5. 乾燥したバイオマスを電動グラインダーで粉砕する。
  6. 粉砕した材料は4°Cの冷蔵庫に保管してください。

2. 抽出物の調製

  1. 水抽出物を準備します。
    1. 乾燥バイオマス10gと蒸留水100mLを100°Cで混合します。
    2. 混合物を120rpmで連続振とうしながら24時間浸軟させます。
    3. 抽出物をろ紙(Whatman no.5または同等品)でろ過します。
    4. ろ過した抽出物を凍結乾燥します。
  2. アセトン抽出物を準備します。
    1. 10 gの乾燥植物材料を70%アセトン水溶液と1:3の比率で混合します。
    2. 混合物を120rpmで連続振とうしながら24時間浸軟させます。
    3. 抽出物をろ紙(Whatman no.5または同等品)でろ過します。
    4. ろ過した抽出物を凍結乾燥します。
      注:凍結乾燥抽出物は、保存性を高めるために-20°Cで保存してください( 図2を参照)。少なくとも5 gの凍結乾燥抽出物が得られることを確認してください。

3. 原液の調製

  1. 抗酸化アッセイの場合:
    1. 乾燥抽出物を対応する溶媒(蒸留水または70%アセトン水溶液)で最終濃度10 mg / mLに可溶化します。
  2. 卵孵化アッセイの場合:
    1. 凍結乾燥抽出物12 mgを5 mLの蒸留水で希釈して、2.4 mg / mLのストック溶液を取得します。
    2. 1.2 mg/mL、0.6 mg/mL、0.3 mg/mL、および0.15 mg/mLの5つの濃度を調製します( 図3を参照)。
      注:使用するウェルとプレートの数に基づいてストック溶液の容量を調整します。たとえば、12 個のウェルではなく 48 個のウェルを使用する場合は、それに応じてボリュームを減らします。5 mL に 12 mg ではなく、2.5 mL で 6 mg を調製します。

4. 植物化学組成

  1. 抽出物の総フェノール含有量(TPC)
    1. 5 μLのサンプルを、96ウェルの透明プラスチックプレートで蒸留水で10×希釈した100 μLのFolin-Ciocalteu(F-C)試薬と混合します。
    2. 室温(RT)で10分間インキュベートします。
    3. 100 μLの炭酸ナトリウム溶液(水中で75 g / L)を加えます。
    4. RTで90分間インキュベートします。
    5. 650 nmでの吸光度を測定します。
      注:TPCは没食子酸当量(GAE)として表します。少なくとも5つの濃度の没食子酸を使用して検量線を作成します。
  2. 総フラボノイド含有量(TFC)
    1. 50 μLの抽出物と50 μLの2%塩化アルミニウムをメタノール中で96ウェルの透明プラスチックプレートで混合します。
    2. RTで10分間インキュベートします。
    3. 405nmで吸光度を測定します。
      注:TFCをケルセチン当量(QE)として表現します。少なくとも5つの濃度のケルセチンを使用して検量線を作成します。
  3. 総タンニン含有量(TTC)
    1. 10 μLの抽出物を200 μLの1%DMACAメタノールおよび100 μLの37%HClと96ウェルの透明プラスチックプレートで混合します。
    2. RTで15分間インキュベートします。
    3. 640nmで吸光度を測定します。
      注:TTCはカテキンのmg / mLで表します。

5. 抗酸化アッセイ - ABTS

  1. 0.003514 gの過硫酸カリウムと0.0203 gのABTSを5 mLの蒸留水に加えます。
  2. 溶液をアルミホイルで包み、冷蔵庫で4°Cで12〜16時間インキュベートします。
  3. 734 nmで吸光度を測定し、エタノールを加えて約0.7に調整します。出発点として、5 μL の ABTS 溶液と 195 μL のエタノールを混合します。
  4. 96ウェルの透明プラスチックプレートで、10 μLの抽出物を190 μLのABTS溶液と混合します。
  5. ポジティブコントロール(C+)の場合、10 μLのトロロックス(サンプルの吸光度に基づく標準曲線を使用して濃度を決定)を190 μLのABTS溶液と混合します。
  6. ネガティブコントロール(C-)の場合、抽出物(水またはアセトン水溶液)の溶解に使用する溶媒10 μLを190 μLのABTS溶液と混合します。
  7. プレートを室温(RT)で6分間インキュベートします。
  8. 734 nmでの吸光度を測定します。
    注: 図4 は、ABTSアッセイの例を示しています。

6.寄生虫学的処置

  1. 自然に感染したヤギの直腸から直接糞便サンプルを採取します。
    注:鮮度を確保し、環境汚染を避けるために、自然に感染したヤギやヒツジの直腸から直接糞便サンプルを採取してください。ストレスを最小限に抑えるために、訓練を受けた担当者を使用して動物を優しく拘束します。清潔な使い捨て手袋を使用して、潤滑剤を塗布した手袋をはめた指を直腸に挿入し、約5〜10 gの糞便を回収します。サンプルを清潔なラベルの付いたプラスチック容器に入れ、4〜8°Cで保存します。 蠕虫の卵の生存率を維持するために、収集から3時間以内にすべてのサンプルを処理します。施設の動物福祉ガイドラインに従い、農場主からインフォームドコンセントを取得します。
  2. 各サンプルに関連する動物種を特定します。
  3. 各糞便サンプル30 gを50 mLの飽和塩溶液(密度= 1.2)と混合して、コプロロジーアッセイの準備をします。
  4. マクマスタースライドを使用して卵を数えます。
    1. 50 mLの飽和NaCl溶液で3 gの糞便サンプルを均質化します。混合物をチーズクロスでろ過し、スライドの両方のチャンバーを満たし、5分間放置します。
    2. スライドを10×倍率の顕微鏡で調べ、ストロンギル型卵を数えます。次の式を使用して、グラムあたりの卵数 (EPG) を計算します: EPG = (卵数) × 50。この方法は、小さな反芻動物における消化管線虫の定量化を標準化します。
  5. 卵数をグラムあたりの卵数 (EPG) で表します。
  6. 糞便培養の調製のために、EPGが少なくとも800の糞便サンプルを選択します。
  7. 糞便培養からL3幼虫を取得し、それらの属または種を同定します。
    注:消化管線虫の卵は、ライフサイクル中に草に沈着します( 図5を参照)。家畜の小型反芻動物は一般的に多寄生を示します。 図6 は、共生学的分析を実行するための手順を示しています。

7. in vitro 試験 - 卵孵化アッセイ(EHA)

  1. 新鮮な糞便サンプルを採取します。
  2. 滅菌ガーゼを使用して糞便を2回ろ過します。
  3. 得られた懸濁液をろ過し、ふるいに移します。
  4. ふるいの上の材料を蒸留水で洗います。
  5. 洗浄した懸濁液を15mLチューブに集めます。
  6. スイングバケットローターを備えた卓上遠心分離機を使用して、サンプルを~4800 × g で室温で5分間遠心分離します。蒸留水で2回、飽和生理食塩水で1回遠心分離して、卵を底に濃縮します(卵の形態については 図7 を参照)。
  7. 卵をPBSに再懸濁します。
  8. アッセイのセットアップのために、卵の濃度を100卵/ mLに調整します。
  9. チアベンダゾール(TBZ)をPBSに0.025 mg/mLで溶解することにより、ポジティブコントロールを調製します。
  10. PBS中の卵懸濁液を使用してネガティブコントロールを調製します。
  11. アッセイには48ウェルマルチウェルプレートを使用します。
  12. 抽出物と卵懸濁液の50/50(v/v)混合物を使用して、各ウェルで250 μLの最終容量を調製します。
  13. 各ウェルに約100卵/ mLを追加します。
  14. 各濃度を4倍(4回繰り返し)でテストします。
  15. 40×倍率の倒立顕微鏡で卵を数えます。
  16. ハッチ率が≥70%のプレートのみを使用してください。
  17. 各濃度の幼虫(L1)、未孵化卵(UnE)、幼虫を含む卵(LFE)、およびモルレーション卵(ME)を数えます。
    注:卵孵化アッセイプロトコルの代表的な要約を 図8に示します。

8.統計的分析

  1. Excelを使用して記述統計分析を実行します。
  2. 一元配置分散分析(ANOVA)と t検定 を使用して、有意水準0.05で濃度間の差を評価します。
  3. 対数10 変換された濃度データに基づくプロビット分析を使用して、50% 実効濃度(EC50)を計算します( 補足ファイル 1 を参照)。

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結果

総フェノール含有量(TPC)、総フラボノイド含有量(TFC)、および総タンニン含有量(TTC)
Tithonia diversifoliaに対するTPC、TTC、TFC、およびABTSの結果を表1に示します。値は、TPCの場合は乾物1グラムあたり没食子酸当量(mg GAE/g DM)、TFCの場合は乾物1グラムあたりのケルセチン当量(mg QE/g DM)、TTCの場合は乾物1グラムあたりのカテキン当量mg(mg CE/g DM)として表されます。抗酸化能は、ABTSアッセイにおける半分最大阻害濃度(IC50、μg/mL)として表されます。

駆虫作用
卵に対する駆虫効果(AH)はGIN種によって異なり、一部の抽出物は幼虫の発育を阻止しました(殺卵効果:より高い%OE / ME)、他の抽出物はL1幼虫の出現を阻害しました(幼虫の排出失敗:より高い%LFE)。結果は、...

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ディスカッション

この記事では、薬用植物の研究を進めるためのいくつかの重要な手順について概説します。卵孵化アッセイ (EHA) などの in vitro 試験は、管理された実験室条件下で実施できるため、特に魅力的です。EHA は、線虫の卵に対するさまざまな濃度の植物抽出物の活性を評価し、結果を陽性対照と陰性対照の両方と比較するように設計されています。得られた結果は、特に胃腸線虫(GIN)18,19,20の間で従来の薬剤に対する耐性が増加していることに照らして、新しい駆虫治療法を開発するための植物由来化合物の可能性についての貴重な洞察を提供します。EHAは、特に適切な対照に対してベンチマークした場合に、さまざまな濃度にわたる化合物活性を評価する効率により、駆虫スクリーニングに広く使用されています21。

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開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

動物と一緒にサンプリングを行うことを信頼してくださるすべての生産者に。ルイサ・クストディオは、プロジェクトUIDB/04326/2020(D O I: 1 0 . 5 4 4 9 9 / U I D B / 0 4 3 2 6 / 2 0 2 0 )、U I D P / 0 4 3 2 6 / 2 0 2 0 (DOI:10.54499/UIDP/04326/2020)を通じて、科学技術財団(FCT)からポルトガルの国家資金を受け取りました。 LA/P/0101/2020(DOI:10.54499/LA/P/0101/2020)およびCEECIND/00425/2017。ロシオ・アビラは、私に経済的支援を提供し、カールトン・キャリア・センターに専門的な指導とサポートを提供して、このプロジェクトを可能にしたことで、ニーニの寄付インターンシップ基金を受け取りました。Griselda Meza は、ポルトガルに旅行し、植物化学アッセイを行うために Beca de Investigacion BINV02 -52 CONACYT -2 nd convocatoria を受け取りました。Ismael Llanoは、ブラジルで卵孵化アッセイを実行するために、BECA MovilityフォームPINV01-306、CONACYTを受け取りました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15 mLチューブ現地での活動
48穴プレート現地での活動
96個のウェルプレートVWR 734-0126
ABTS酵素的A1088.0005現地での活動
学術光学顕微鏡および逆立顕微鏡現地での活動
アセトン酵素的A/0600/17
塩化アルミニウム シグマ・オルドリッチ6911
DMACA試薬シグマ・オルドリッチ49825
エタノール 96%酵素的VR11202
動物の糞便大学近くの農場で採取
フォラン・チョカルトーシグマ・オルドリッチF9252
ガリック酸シグマ・オルドリッチ91215
塩酸塩シグマ・オルドリッチ258148
マクマスターカメラ現地での活動
メタノール酵素的M/4000/17
PBS現地での活動
植物抽出物現地での活動
過硫酸カリウム シグマ・オルドリッチ216224
ケルセチンシグマ・オルドリッチQ4951
塩現地での活動
炭酸ナトリウム シグマ・オルドリッチ1063920500
チアベンダゾール現地での活動
トロロックスシグマ・オルドリッチ648471現地での活動
水現地での活動
ワットマン第5号VWR WHAT97039654

参考文献

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