緑膿菌における運動表現型を観察するためのハイスループット法

Summary

このプロトコルは、緑膿菌のさまざまなタイプの運動に関与する遺伝的要因を特定するための迅速かつ効率的な方法を提供します。

Abstract

運動行動は、細菌がその環境で利用可能な資源を利用する能力に重要な役割を果たすことがよくあります。これは特に、汎用性の高い病原体 である緑膿菌に当てはまり、群れやけいれんなど、さまざまな種類の運動性を示すことができ、これらは表面のコロニー形成、バイオフィルムの形成、および宿主防御の回避に寄与する重要な病原性形質です。この原稿は、 緑膿菌の運動性挙動を研究するためのハイスループット運動性プロトコルを提示します。このプロトコルでは、例えば、ゲノムワイドな変異体ライブラリーから 緑膿菌 の複数の株を同時に試験し、その運動性に関与する遺伝的要因を特定し、分析することができます。このアプローチは、運動性を包括的に研究する可能性と、 緑膿菌 の運動性の根底にある分子メカニズムへの洞察を提供します。ここで説明するプロトコルは、さまざまなタイプの運動性アッセイや他の細菌種に対応するように変更することもできるため、さまざまな状況での細菌の挙動の理解を深めるための強力なプラットフォームを提供します。

Introduction

緑膿菌は、その顕著な代謝の多様性により、多様な環境にコロニーを形成することができる日和見病原体です^1,2。この汎用性は、プランクトン性の成長モードからバイオフィルムへの移行にとって重要であり、水から人体^3,4,5に至るまでの幅広いニッチで繁栄する能力に貢献します。これらの成長モード間の移行は、水泳、群れ、けいれんなど、さまざまな種類の運動性を使用してこれらの環境を移動する広範な能力によって助けられます^1,6。各タイプの運動性は、異なるメカニズムと細胞構造によって媒介され、緑膿菌が環境の手がかりに応答することを可能にします^7,8。遊泳運動性は、単一の極性鞭毛によって駆動され、液体媒体を介して栄養素(^{たとえば9})に向かって移動するために使用されます。群れ運動性は、べん毛およびバイオサーファクタントの生産によって促進される協調的な運動であり、コロニーが半固体表面に広がることを可能にする^10,11。最後に、けいれん運動性はべん毛に依存しません。代わりに、けいれんはIV型線毛(T4P)によって媒介され、表面^12,13の上を移動するために使用されます。けいれん運動性は、初期表面付着を提供することにより、緑膿菌のバイオフィルム形成の初期段階にも寄与します。最初の付着後、けいれんにより、細菌は表面を移動してマイクロコロニーを形成し、それが成熟したバイオフィルムに成長する可能性があります^1,4,13。

従来、細菌の運動性アッセイは、一度に1株ずつ、柔らかい寒天プレート上で、または顕微鏡法を使用して個別に実施されます^6,14,15。半固体培地は、細菌の運動性の研究において長年使用されてきました。今日でも、これらの技術は細菌の運動性表現型を特定するために使用されています。例えば、伝統的に、群れ運動性は、M9培地を含有するペトリ皿の中心に2.5μLの緑膿菌培養物を0.5%〜0.8%の寒天濃度¹⁶で接種することによって観察される。けいれん運動性は通常、培地を通じて緑膿菌を刺した後、寒天(1%)とペトリ皿の基部との間の界面での細菌の広がりを調べることによって測定されます。インキュベーションの48時間後に間質性コロニー拡大の大きなハローが得られるが、非痙攣性株はそのようなコロニー拡大ゾーンを生じさせない^1,17,18。

最近では、トランスポゾン突然変異導入アプローチにより、緑膿菌の運動性またはバイオフィルム形成に関与する新しい遺伝子が発見されました19,20,21。例えば、痙攣運動に関与する新しい遺伝子は、緑膿菌¹⁹の高密度トランスポゾン変異体ライブラリーを用いて発見された。機能ゲノミクスにおけるもう一つの有用なツールは、順序付けられた突然変異体コレクションの使用である^22,23。慶應コレクション²⁴は、大腸菌の非必須遺伝子の単一欠失を含む、おそらく最もよく知られた変異体コレクションであり、異なる培地^{での増殖25}から細胞形態²⁶など、さまざまな表現型に影響を与える遺伝子を定義するために使用されてきた。このようなコレクションは、Salmonella enterica serovar Typhimurium²⁷、Bacillus subtilis²⁸、P. aeruginosa²⁹、および他の多くの種にも利用可能です。また、これらのコレクションはゲノムワイドな運動性の研究にも適しており、緑膿菌の運動性を研究するためのハイスループット法の開発につながっています。ここでは、緑膿菌の変異体の寄与を評価することにより、この方法を、高密度プレート上の痙攣運動性と群れ運動性の両方に対して評価することによってテストしました。このハイスループット法は、さまざまな運動表現型に使用でき、他の細菌の運動性の研究にも適しています。

Protocol

注: この手順の一般的なワークフローを 図 1 に示します。

図1:実験ワークフロー (1)実験で関心のある運動性の種類に基づいて、必要な量の運動性培地を調製します。(2)手動または自動のレプリケーターシステムを使用して、変異体コレクションの 緑膿菌 トランスポゾン挿入変異体ライブラリーのソースストックプレートを適切な密度で調製し、プレートのすべてのウェルでの精度と均一な接種に重点を置いています。(3)変異体コレクションのソースプレートから運動性プレートにサンプルを移します。(4)インキュベーション後、運動表現型を観察・解析し、高画質な画像を用いて目的の運動に関与する遺伝子を同定する。(5)従来の運動性アッセイを実施して、ハイスループット運動性実験を通じて同定されたヒットを検証します。BioRenderで作成。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

スウォーミングプレート - M9 メディア	トゥイッチングプレート - LB media	ソースプレート - LB media
5x M9塩溶液200mL	NaCl 10 g	NaCl 10 g
20%グルコース10mL	トリプトン 10 g	トリプトン 10 g
カサミノ酸25mL	酵母エキス5g	酵母エキス5g
1 mL の 1M MgSO4	寒天 10g	寒天 15g
1%寒天 500mL	1LにdH2Oを追加	1LにdH2Oを追加
1LにdH2Oを追加		ゲンタマイシン(最終濃度15μg/mL)

表1:アッセイで使用されるさまざまなプレートの培地組成。

1. 培地プレートの調製

注:ストック溶液と保管条件を準備するには 、材料の表 を参照してください。プレートは平らな面に充填する必要があります。乾燥させるときは、プレートは表面が平らであるべきです(つまり、積み重ねられていない)。これにより、プレート内の培地が均一に乾燥します。一般的なフットプリントのユニウェルプレートであればどれでも機能しますが、Singer Instruments Plus PlatesやVWRシングルウェル未処理組織培養プレートなど、より大きな内寸のプレート(内壁なし)を使用すると、プレートあたりのコロニー密度が高くなる作業が容易になります。

1. 実験用の培地は、 表1のレシピに従って適切な量を準備します。寒天が固まるのを防ぐために、媒体を~45°C〜50°Cに保ちます。
   1. ソースプレートの場合、1.5% 寒天と 15 μg/mL のゲンタマイシンを含む 59 LB(リソジェニーブロス)プレートを調製します。これは、完全な PA14 ライブラリー - 59 x 25 mL =~ 1500 mL の複製に必要です。LB 1.5% 寒天と 15 μg/mL ゲンタマイシンを 15 プレートずつ調製し、384 密度フォーマット (15 x 25 mL = ~400 mL) でライブラリーをアップスケールします。
   2. トゥイッチングプレート:96密度フォーマットで作業する場合は、ツイッチングプレートを59枚(LB 1%寒天)用意します。384密度フォーマットで作業する場合は、15枚のけいれんプレートを準備します。
   3. スウォーミングプレート:15枚(384密度フォーマット)または59枚(96密度フォーマット)のスウォーミングプレート(M9-グルコース0.5%寒天培地)を準備します
2. プレートの蓋を外し、プレートごとに25mLのメディアを注ぎます。プレートの隅々まで一度に1つずつ静かに持ち上げて、メディアをプレート全体に均等に分散させます。この小刻みに動く動きを2回〜3回繰り返します。蓋を皿に戻します。
3. プレートを固化させ、室温(RT)で一晩乾燥させます。プレートをすぐに使用しない場合は、密閉袋に入れて乾燥した場所に保管してください。3週間保存できます。

2. 緑膿菌トランスポゾン変異体ライブラリーのソースプレートの調製

注:ソースプレートとは、後で運動性プレートを接種するために使用されるPA14ライブラリのコピーを含むLBA-ゲンタマイシンプレートを指します。 緑膿菌トランス ポゾン変異体ライブラリー(PA14ライブラリー)は、59枚の凍結96ウェルプレート²⁹のセットである。以下、各フォーマットのソースプレートを調製する手順について説明します。このプロトコルは、Rotor+ リプリケーターにアクセスできないラボにも適応できます。研究者は、1日目にPA14ライブラリの凍結プレートを複製するためにここで使用したバネ式96ピンリプリケータ( 材料表を参照)やその他の96ピンリプリケータなどの手動リプリケータを使用して、同じ実験手順を正常に実行できます。手動レプリケーターは、使用するたびに滅菌し、冷却する必要があります。

1. 1日目:59枚の凍結96ウェルプレートからソースプレートへのPA14ライブラリの複製
   1. バネ仕掛けの96ピンリプリケーターを最高温度のホットプレートに8分間置いて滅菌します。滅菌後、バクテリアが死滅しないように、リプリケーターを十分に(~10分)冷まします。
   2. ソースプレートを1つつかみます。滅菌済みの96ピンリプリケーターを使用して、リプリケーターピンを1つの96ウェルプレートに慎重に浸し、細胞をソースプレートの表面に直接移します。PA14ライブラリーの59枚の凍結96ウェルプレートすべてがソースプレートに複製されるまで繰り返します。
   3. 96密度のソースプレートを37°Cで16〜18時間インキュベートします。
      注:96密度フォーマットの方法を使用する場合、これらのソースプレートを使用して運動性プレートを接種することができます。
2. 2日目:96密度形式から384密度形式へのアップスケーリング
   注:96密度で作業する場合は、2日目をスキップできます。
   1. インキュベーション後、プレートを室温(~1時間)で(表面に平らにし、積み重ねずに)放置して冷却します。蓋に結露がある場合は、繊細なタスクワイプを使用して結露を取り除き、水滴がプレートに落ちてコロニー間の相互汚染を引き起こすのを防ぎます。
   2. 以下のパラメータでリプリケーターを設定し、コロニーの正確な転写を確保します。レプリケータ をONにします 。[操作モードの選択] セクションで、[ ストアド プログラムの選択と実行] を選択します。
   3. [Select source plates] セクションで、[ PlusPlate 96 Agar] を選択します。「Select target plates」セクションで、「 PlusPlate 384 Agar」を選択します。[Select pads] セクションで、[ Short Pin 96] を選択します。
   4. [レプリケート プログラム オプション]セクションで、[ 一般 ]を選択し、[ リサイクル]>[なし]をクリックします。
   5. [Source] セクションで [Offset ] を選択し、[ Random > Default Radius] をクリックします。[ターゲット]セクションで、[ ピン留め ]を選択し、圧力を20%に調整します。他のすべての設定はデフォルトのままにします。
   6. ショートピンRePads96を適切なコンパートメントに挿入します。
   7. ソースプレートとターゲットプレートをリプリケーターの指定されたプラットフォームに配置します。密度96のソースプレート(プレート1、2、3、4)と新しい空のソースプレート(LBAプレート)をプラットフォームに置きます。選択したパラメータを使用して、微生物アレイピン留めロボットは、96密度プレートから新しい384密度プレートにコロニーを移します。 実行を押します。
   8. プラットフォーム上のすべてのプレート(次の4つの96密度ソースプレートと新しい空のソースプレート)を交換し、すべてのプレートがアップスケールされるまで繰り返します。プレートの最後のセットには、プレート57、58、59、および1を使用します。各384密度プレートは、4つの96密度プレートからの交互のコロニーで構成されます( 図2を参照)。384密度LBAプレートを37°Cで16〜18時間インキュベートします。
      注:これらの384密度のソースプレートは、運動性プレートを接種して384密度でプロトコルを実行するために使用できます。インキュベーション後のどのステップでも、プレートは4°Cで最大3週間保存できます。

図2:96密度プレートから384密度プレートへのアップスケーリング。 4つの96密度ソースプレートからのコロニーは、1つの384密度プレートに移され、マージされます。384密度プレートの各象限は、元の96ウェルプレート(赤、青、黄、緑)の1つに対応し、各変異体の位置を保持します。BioRenderで作成。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. ハイスループット運動性実験

注:このプロトコルは、ここでは384密度フォーマットで実施されましたが、384の代わりに96選択を使用してソースプレートから運動性プレートに転送するようにリプリケータ上のパラメータを変更することにより、同じプロトコルを96密度フォーマットに適合させることができます。

1. インキュベーション後、プレートを室温(~1時間)で(表面に平らにし、積み重ねずに)放置して冷却します。蓋に結露が発生した場合は、デリケートなタスクワイプを使用して取り除き、水滴がプレートに落ちてコロニー間の相互汚染を引き起こすのを防ぎます。
2. 目的のアッセイに適した数のプレート(96密度フォーマットの場合は59枚、384密度フォーマットの場合は15枚)をつかみます:スウォーミング用のM9-グルコース0.5%寒天プレート、LB、およびけいれん用の1%寒天プレート。
3. 以下のパラメータでリプリケーターを設定し、コロニーの正確な転写を確保します。
   1. レプリケータ をONにします 。[操作モードの選択] セクションで、[ ストアド プログラムの選択と実行] を選択します。[Select source plates] セクションで、[ PlusPlate 384 Agar] を選択します。
   2. 「Select target plates」セクションで、「 PlusPlate 384 Agar」を選択します。[パッドの選択]セクションで、[ ショートピン384]を選択します。[レプリケート プログラム オプション] セクションで、[ 一般] > [リサイクル] > [なし] を選択します。
   3. 「Singer Programs」で、「Replicate Many」を選択します。
   4. [ソース]セクションで、[ オフセット]>[ランダム]>[デフォルト半径]を選択します。[ターゲット]セクションで、[ ピン留め ]を選択し、圧力を2%に調整します。他のすべての設定はデフォルトのままにします。
4. ショートピンRePads384を適切なコンパートメントに挿入します。
5. ソースプレートとターゲットプレートをリプリケーターの指定されたプラットフォームに配置します。384密度のソースプレートと空の運動プレートをプラットフォームに置きます。 選択したパラメータを使用して実行を押すと、微生物アレイピンロボットは384密度のソースプレートから運動プレートにコロニーを転送します。各 384 密度プレートは、1 つの 384 密度ソース プレートからのコピーで構成されます。
6. 転写が均一であり、すべてのコロニーが運動性プレートの寒天表面に適切に固定されていることを確認してください。接種した運動プレートをビニール袋に入れます。プレートの入った袋を、37°Cにセットしたインキュベーターに18時間慎重に入れます。
   注意: プレートは、湿度を維持し、不均一な乾燥を防ぐために袋に入れられます。蓋を上にしてプレートをインキュベーターに置きます。
7. インキュベーション後、運動性プレートが均一に成長し、汚染がないことを確認します。
8. 3日目:運動性プレートのイメージング
   注:Singer Instruments PhenoBoothは、運動プレートの高解像度画像をキャプチャするために使用されます。科学グレードのカメラを使用し、23メガピクセルの画像を生成します。ペトリ皿や長方形のプレートからコロニーの高解像度画像をキャプチャするための5つの照明チャンネルが含まれています。他の高品質のイメージャーも機能します。
   1. インキュベーション期間の後、運動性プレートはイメージングプロセスの準備が整います。Phenobooth の電源を入れ、 Phenoboothソフトウェアに対応する アイコンをクリックします 。
   2. 「プロジェクトの選択」ページが開きます。 「New Project > Colony Counting」をクリックします。[Location (場所)] フィールドに画像を保存するための [ Desired File Path (目的のファイルパス )] を選択します。[解像度] フィールドで [5626 x 4220] を選択します。 [OK]をクリックすると、デバイスで写真を撮る準備が整いました。
   3. 蓋を取り外した後、中面を上にしてプレートをリーダーに挿入します。プレートが詰まらないように、リーダーを閉じる前にプレートが適切に配置されていることを確認してください。
   4. [照明] タブでパラメーターを白色光に設定します。 [プレビュー]をクリックします。PhenoBooth設定タブで露光設定を調整し、運動表現型を観察するための最適なパラメータを取得します。
   5. [取得]をクリックします。キャプチャした画像が画面の左側に表示されます。終了したら、ソフトウェアを閉じます(キャプチャされたすべての画像は、[場所]タブで以前に選択したファイルに保存されます)。
      注:Phenoboothは画像をJPEG形式で保存しますが、ダウンストリーム分析ステップでは、画像はTIFF、JPEG、またはPNG形式にすることができます。

4. 運動表現型の解析

注:画像解析は、French et ^al.30,31によって詳細に説明されているように行われます。データ解析を行うスクリプトは^、31(ImageJ Macro)から入手できます。

1. 簡単に説明すると、画像はImageJ³²で処理され、運動性プレート上の各コロニーの値が生成されます。まず、画像を8ビット形式に変換し、thresholdコマンドを使用してコロニーとそれに関連する運動領域を背景からセグメント化します。すべてのコロニーの周囲に関心領域(ROI)を描画し、運動領域を測定します。これにより、各ウェルの統合密度値を含むテーブルが生成され、行ごとに整理されます。このテーブルは、さらに分析するためにCSVファイルとして保存できます。
   1. ImageJ でマクロを実行し、画像を含むフォルダーを開きます。
   2. プロンプトが表示されたら、[プレビュー]オプションを使用してプレートの角度を変更し、プレートがまっすぐになるようにプレートの回転を調整します。問題がなければ、[ OK ]ボタンをクリックします。
   3. 次に、コロニーの周りの長方形を移動し、それを使用してコロニーを含むプレートの部分を切り抜きます。準備ができたら、[OK ]ボタンをクリックします。
   4. 次のプロンプトでは、各コロニーの周囲にROIを描画し、運動領域を測定するために使用されるグリッドを定義します。適切なコロニー密度を選択します。必要に応じてさまざまなパラメータを調整し、各円がコロニーの周りにくるようにします。準備ができたら、Okay?ボックスをクリックし、[ OK ]ボタンをクリックします。これにより、各コロニーの運動領域が測定され、データを含むフォルダにCSVファイルが保存されます。
2. このCSVファイルを、同じく行ごとに整理されたプレートの凡例と組み合わせて、対応する変異体を持つ各運動領域を特定します。積分密度の値が低いほど、非運動性であった変異体または運動性の低下を示した変異体に対応する。

5. ヒットの検証のための従来の運動性アッセイ

注:ハイスループット運動性プロトコルで運動性が影響を受けた変異体を観察した後、得られたヒットを個別に検証することが重要です。個々の運動プロトコルは、ハイスループットテストで使用されるものとは異なりますが、使用されるメディアは同じです。

1. スウォーミング運動性アッセイ
   注:群れ運動性は、Ha et ^al.16によって詳細に説明されているように実行されます。
   1. 簡単に言うと、M9(0.5%寒天)、グルコース、カサミノ酸、およびMgSO4を含む寒天溶液をオートクレーブします。冷やして混合した寒天をペトリプレート(プレートあたり25mL)に注ぎます。
   2. 2.5μLの一晩の細菌培養液を接種します。37°Cで18時間インキュベートし、蓋を上にして運動表現型を観察します。
2. けいれん運動性アッセイ
   注:けいれん運動性は、Haleyら^33,34によって詳細に説明されているように実行されます。
   1. 簡単に言うと、LB 1%寒天培地をオートクレーブ処理します( 表1を参照ください)。冷却して混合したLB 1%寒天をペトリプレート(プレートあたり25mL)に注ぎます。
   2. けいれんするプレートの底に細菌を刺し、接種します(1%寒天)。プレートを37°Cで48時間インキュベートし、次に室温でさらに48時間インキュベートします。プレートから寒天を取り除き、ペトリ皿を1%クリスタルバイオレットで染色することにより、けいれんゾーンを視覚化します。
   3. PhenoBoothを使用して、手順3で説明したのと同じパラメーターでシャーレを撮影します。

Results

このプロトコルを使用して、遺伝子の不活性化が 緑膿菌の 運動性に及ぼす影響をハイスループットで特徴付けました。ここでは、 Pのゲノム全体の欠失コレクションにおける群れとけいれん運動性を研究するためのその使用について詳しく説明します。 緑膿菌 PA14株(PA14ライブラリー)。このプロトコルは、優れた汎用性と使いやすさを提供し、異なる培地や変異体コレクションの使用など、プロトコルのさまざまなステップに変更を加えることができます。

変異体は、その運動性領域に基づいて採点されました。プレート上のほとんどの変異体は、 緑膿菌の 運動性に影響を与えないため、プレート上のすべての変異体の運動性平均はWTと見なされます。試験した変異体をランク付けし、下位15%を厳格に選択しました。その後、これらの変異体の一部を従来のアッセイを用いて確認しました。平均よりも大きい運動表現型を示す変異体は、この解析では同定されなかった。この方法論は、運動性の表現型が低下した変...

Discussion

ここで説明するハイスループット運動性プロトコルにより、多くのコロニーの運動性表現型を精度と再現性で処理および分析できます。従来の手動法と比較して、この半自動アプローチにより、運動性アッセイのスケーラビリティとスループットが向上し、細菌の運動性をゲノム全体で評価できるようになります。このプロトコールはPA14ライブラリーと併用するように最適化されていますが、このアッセイは、大 腸菌²⁴ の慶應コレクションや サルモネラ菌 血清型チフィムリウム²⁷のSGDコレクションなど、任意の変異体ライブラリーと併用できます。さらに、このプロトコルは、変異体のライブラリではなく、株のライブラリで動作するように最適化することもできます。例えば、このプロトコルは、嚢胞性線維症患者から単離された 緑膿菌 株のライブラリーの運動性表現型を決定するのに役立ちます。特定の菌株または実験条件に対してプロトコールを最適化するために、分析法...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96枚のウェルプレート	コーニング	3701
アガー	フィッシャー・サイエンティフィック	BP1423-2	群れ運動率はそれぞれ0.5%、痙攣運動率1%の最終濃度です。
カサミノ酸とnbsp;	フィッシャー・サイエンティフィック	223050	20%のストックを水に浸して準備します。フィルターは0.22 & muで滅菌します。mをろ過し、4 & Cで保存。最終濃度は M9 最低培地中 0.5%。
クリスタルバイオレット	バイオベーシック	CB0331	1%の溶液を水に淹れて準備します。
D-グルコース	バイオベーシック	GB0219	20%(1.1 M)のストックを水に浸して自滅菌します。最終濃度はM9最小培地中0.2%。nbsp;
フィルトロプル S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
ゲンタマイシン硫酸塩	バイオベーシック	GB0217	30 mg/mlのストックを水に淹れて準備します。フィルターは0.22 & muで滅菌します。Mフィルターを使い、4度で保存します。C & ndash;最終濃度はプレート15および微量で、g/mL...
接種ループと針の導入など;	フィッシャー・サイエンティフィック	22363597
M9 ミニマルソルト、5X	フィッシャー・サイエンティフィック	248510	100万杯のストックを水に浸して、オートクレーブで滅菌します。最終濃度はM9最小培地中の1 mM。および注::
硫酸マグネシウム(MgSO4)およびnbsp;	フィッシャー・サイエンティフィック	M63-500	1 M mgSO4のストックを水に淹れて準備します。フィルターは0.22 & muで滅菌します。Mフィルターをして常温で保存します。最終濃度
PA14 トランスポゾン挿入変異体ライブラリ		Liberatiら、2006年(参考文献29参照)	全コレクションに59枚の96ウェル版が収蔵されています。各井戸にはLBに25%グリセロールを含む単一の変異体が含まれています。
ペトリ皿 92×16mm	Sarstedt	82.1473.001
フェノブース+	シンガー・インストゥルメンツ	https://www.singerinstruments.com/solution/phenobooth/specification/	11.3gの粉末を200mLの精製水に溶かします。オートクレーブ温度121度&デグ;Cは15分、nbsp;
プラスチック製注射器 10 mL	フィッシャー・サイエンティフィック	14955459
ローター+	シンガー・インストゥルメンツ	https://www.singerinstruments.com/resource/rotor-had/
短いピンリパッド 384密度	シンガー・インストゥルメンツ	REP-004
ショートピンリパッド 96密度	シンガー・インストゥルメンツ	REP-002
塩化ナトリウム(NaCl)	フィッシャー・サイエンティフィック	BP358-212
スプリング式96ピンレプリケーター	EnzyScreen	CR1000
手術用ブレード ステンレス No. 25	フィッシャー・サイエンティフィック	08-918-5F
トリプトン	オキソイド	LP0042B
ユニウェルプレート	シンガー・インストゥルメンツ	プラスプレート:PLU-003	プレート寸法:54 &34時間以上;38 cm - 内壁がなく、内部寸法が大きくなっています。nbsp;
ユニウェルプレート	VWR	単一ウェル組織培養プレート:75780-348	プラスプレートと同じ寸法です。
酵母抽出物など;	フィッシャー・サイエンティフィック	248510