慢性創傷管理のためのコアシース3Dバイオプリントスキャフォールドを使用した細胞外小胞送達の最適化

Summary

この研究では、慢性創傷治癒のためのコアシース3Dバイオプリント足場を作製するためのプロトコルを提示します。細胞外小胞は間葉系幹細胞から単離され、カルボキシメチルセルロースとアルギン酸リアーゼから作られた鞘でコア(アルギン酸)にロードされます。この設計により、足場の劣化を制御し、EVを効率的にリリースできます。

Abstract

この研究では、慢性創傷治癒を促進するように設計されたコアシース 3D バイオプリント スキャフォールドの作製に関する詳細なプロトコルを概説しています。このプロトコルには、再生および免疫調節特性で知られる間葉系幹細胞(MSC)から細胞外小胞(EV)を分離することが含まれます。これらのEVは、独自の足場構造に組み込まれます。足場は、EVを充填したアルギン酸塩で構成されたコアを特徴とし、その周囲にカルボキシメチルセルロースとアルギン酸リアーゼでできたシースが取り囲まれています。この革新的な設計により、足場の劣化を制御しながら、創傷部位でのEVの効率的かつ制御された放出を促進します。このプロトコルは、EVの準備と特性評価、3Dバイオプリンティング用のバイオインクの配合、目的のコアシースアーキテクチャを達成するためのプリンティングパラメータの最適化など、主要なステップをカバーしています。このスキャフォールドは、構造的完全性と生物活性を組み合わせることで、従来の創傷被覆材の限界に対処することを目指しており、組織再生を加速し、慢性創傷の炎症を軽減するための的を絞ったアプローチを提供します。この方法は、慢性創傷管理における潜在的な臨床応用を備えた高度な生体材料を開発するための再現性とスケーラブルな戦略を提供します。また、このプロトコルは、一貫した結果を達成し、将来の治療アプリケーションへの適応性を確保するための重要な考慮事項を強調しています。

Introduction

慢性創傷は、しばしば過度の炎症に関連しており、切断につながる可能性のある感染症や組織壊死などの重篤な合併症を防ぐためにタイムリーな管理が必要です。進歩にもかかわらず、現在の治療法は依然として高価で不便で、副作用があり、有効性が限られているため、より治癒力のあるドレッシングの必要性が浮き彫りになっています^1,2,3。これらの課題に対処するためには、慢性創傷用に特別に設計された新世代の創傷被覆材の開発が不可欠です。さらに、創傷治癒の複雑な性質には、保湿、柔軟性、接着性、生物活性、生^分解性4など、さまざまな特性を備えた被覆材が必要です。この研究は、細胞外小胞 (EV) とコアシース 3D バイオプリント スキャフォールドを統合して、制御された治療環境を提供し、慢性創傷治癒を促進するバイオエンジニアリング創傷被覆材を開発することを目的としています。

幹細胞に由来するEVは、抗炎症反応、細胞増殖、遊走、血管形成を促進することにより、慢性的な創傷治癒を助けます⁵。さらに、EVは、慢性創傷管理のための低分子医薬品、遺伝子およびタンパク質コンストラクトなどの生理活性分子を送達することができます⁶。さらに、貨物を酵素分解から保護する能力は、治療薬の安定性とバイオアベイラビリティを向上させ、in vivoで急速に分解されることが多い従来の成長因子や低分子医薬品に比べて明確な利点を提供します⁷。これらの利点にもかかわらず、標的組織へのEVの効率的かつ持続的な送達は依然として大きな課題です。

3Dバイオプリンティングの足場は、EVの治療効果を高めるためのデリバリープラットフォームとして機能します⁸。これらの足場は、自然の細胞環境を模倣し、EVの制御された放出を可能にする^9,10。また、EVを分解から保護し、マイクロRNAとタンパク質の安定性を高めます¹¹。Hanらは、3DバイオプリントされたGelMA足場からEVを効果的に放出できることを実証しました。この放出は、足場に播種されたヒト頬脂肪パッド間葉系幹細胞(hBFP-MSC)におけるメカノトランスダクション経路に関連する細胞接着の改善および遺伝子発現の増強をもたらした¹²。Bornらは、架橋剤の濃度を最適化することにより、EVの制御された放出を達成しました。このアプローチは、血管新生の促進に有効性を実証しており、EVの調節された送達に有望な方法を提供しています¹³。

コアシース 3Dバイオプリンティングは、シースに包まれたコア材料をプリントすることで、複雑なマルチマテリアル構造の作成を可能にします。コアには細胞、成長因子、または薬物が含まれる可能性がありますが、シースは機械的なサポートと保護を提供するか、バリアとして機能します。この方法は、血管ネットワークの開発、天然の組織構造の模倣、薬物送達システムの作成など、組織工学や再生医療に応用されています。これにより、材料の分布と組成を正確に制御でき、コンストラクトの機能性と生物学的関連性が向上します。他の技術と比較して、コアシース3Dバイオプリンティングは、材料の分布と組成を正確に制御し、コンストラクトの機能性と生物学的関連性を向上させます^14,15。

創傷被覆材の工学的分解は、交換中の不快感の軽減、治癒および感染制御のための湿った環境、タイムリーな治療送達、および最適な組織再生などの利点を提供する16,17,18。アルギン酸(Alg)およびカルボキシメチルセルロース(CMCh)ハイドロゲルは、生体適合性があり、創傷に細胞外小胞(EV)を送達するのに効果的であり、細胞コミュニケーションおよび炎症軽減を通じて治癒を促進する¹⁸。この研究では、EVをAlgのコアに統合し、CMChとAlgLyase(AlgLyase)のシースを使用して、迅速なドレッシング劣化とEVの送達を可能にしました。このコアシース設計により、足場の劣化に反応してEVの迅速な放出が促進され、その治療効果が向上し、既存の慢性創傷治療の限界が解消されます。この研究の主な目的は、制御された EV 放出を応答性分解性の足場と統合することにより創傷治癒を強化するバイオエンジニアリング ドレッシングを開発し、最終的に慢性創傷の治療結果を改善することです。

Protocol

動物研究は、ニズワ大学の全国生命倫理委員会と動物倫理委員会によって確立された倫理基準に完全に従って実施されました。この研究の倫理的承認は、クリアランス ID: VCGSR, AREC/01/2023 の下で付与されました。すべての動物は標準的な実験室条件下で飼育され、最適な環境管理、適切な栄養、および研究全体を通じて彼らの福祉を保護するための包括的なケアが確保されました。動物が関わるすべての手続きは、施設の方針、国際的な動物管理基準、およびARRIVEガイドラインに厳密に準拠していました。

1. 細胞培養

1. 液体窒素貯蔵庫からMSCのバイアル(パッセージ#2)を取り出し、汚染を防ぐために無菌技術で取り扱います。細胞を37°Cのウォーターバスで急速に解凍し、小さな氷の破片が残ったらすぐに細胞を取り除くようにします。
2. MSC SFM 基礎培地に 1% (v/v) MSC SFM XenoFree サプリメント、1% (v/v) GlutaMAX、および 0.01% (v/v) ゲンタマイシンを添加した完全な培地を調製します。予熱した(37°C)完全培地1 mLを5秒ごとに3〜5滴の割合でバイアルに加え、穏やかに混合します。MSCバイアルの全内容物を、クラスIIバイオセーフティキャビネット内の無菌条件下で、4mLの予熱済み完全培地を含む15mLのコニカルチューブに移します。
3. 細胞を200 x g で室温で5分間遠心分離します。遠心分離機のバランスが適切であることを確認してください。
4. 上清を吸引し、細胞を予熱した完全培地1 mLに再懸濁します。次に、細胞を4 mLの完全培地を含むT25フラスコに移します。
5. フラスコをゆっくりと傾けて、細胞が均等に分布していることを確認します。フラスコを37°Cで5%CO₂とインキュベートします。
6. メディウムは2日ごとに交換し、新鮮で事前に温められた完全なメディウムと交換します。細胞の破壊を避けるために、穏やかなピペッティングを使用してください。70%〜80%の合流点に達したら、T25フラスコから使用済みの培地を吸引します。
7. 細胞を3mLの新鮮なPBSで洗浄し、残留物を取り除きます。洗浄中にフラスコが完全に覆われていることを確認してください。
8. 1 mLの0.25%トリプシン溶液をT25フラスコに加え、37°Cで3〜7分間インキュベートし、顕微鏡下で4倍の倍率で剥離を注意深く観察します。
9. 必要に応じてフラスコを軽くたたいて、細胞が完全に剥離するようにします。あらかじめ温めた完全な培地をフラスコに加え、細胞を分離するために表面を上下にピペットで動かします。次に、細胞懸濁液を15 mLの遠心チューブに移します。
10. チューブを200 x g で室温で5分間遠心分離します。細胞ペレットを新鮮で完全な培地に懸濁し、ノイバウアー血球計算盤を使用して細胞をカウントします。細胞をT75フラスコに移します。最適な増殖のために、播種密度が5,000細胞/cm² であることを確認してください。
11. 細胞を37°Cで5%_CO2とインキュベートします。細胞インキュベーションの72時間後、EV単離のために細胞からコンディショニング培地を回収します。回収後すぐに使用してください。

2. EVの絶縁

1. 回収した13 mLのコンディショニング培地を800 x g で15分間遠心分離し、細胞の破片を除去します。0.22 μmシリンジフィルターを使用して上清を穏やかにろ過し、大きな粒子を取り除きます。
2. ろ過したコンディショニング培地に5 mLの沈殿バッファーを加え、十分にボルテックスして混合します。ソリューションが均質であることを確認してください。
3. 混合物を4°Cで一晩インキュベートし、EVを沈殿させます。混合物を3,220 x g で20°Cで30分間遠心分離します。 チューブのバランスを確認してください。
4. ペレットを乱さないように上清を慎重に捨てます。ペレットをもう一度3,220 x g で5秒間遠心分離し、残留液体を除去します。
5. EVの損傷を避けるために、EVペレットを200μLのPBSに優しくピペットで移します。製造元の指示に従ってEVのタンパク質濃度を測定します(BCAタンパク質アッセイキット)。
6. ウェスタンブロッティングを実施してEV特異的マーカー(CD63、CD81、およびCD9)を検出し、EV表現型¹⁸を確認します。分析により、これらのマーカーの存在が確認され、EVの同一性^{が検証されました19}。
7. RNase汚染のリスクを最小限に抑えるために、追加の保管なしで直接使用することをお勧めします。必要な場合は、EVを-80°Cで保管して使用してください。EVの懸濁液を40μLの容量に分注して、凍結融解サイクルが繰り返されないようにします。

3. PKH-26によるEVのラベリング

1. バッファー調製
   1. 0.238 gのHEPESを滅菌容器内の約90 mLの滅菌超純水に溶解します。作りたてのHEPES溶液を使用してください。0.85 gのNaClをHEPES溶液に加えます。
   2. 必要に応じて、校正済みのpHメーターを使用して、1 M NaOHまたはHClを使用してpHを7.4に調整します。脱イオン水を加えて、総容量を100mLにします。溶液を0.22μmのフィルターでろ過し、滅菌します。
2. 4 μLのPKH-26色素を調製したバッファー1 mLで希釈します。均質性を確保するために、ピペットで十分に混合します。
3. 精製したEVを1 mLのPBSに700 μg/mLの濃度で再懸濁します。調製したPKH-26溶液1 mLにEV懸濁液1 mLを加えます。色素のみの対照群では、EVを含まない完全培地1 mLをPKH-26溶液1 mLに加えます。後続のすべてのステップは、潜在的な非特異的凝集またはミセル形成を説明するために、コントロールグループに対しても実行されます。
4. チューブを10x-15xに優しく反転させて、EVを完全に混合します。混合物を室温で3〜5分間インキュベートし、EVが色素に均一にさらされるようにします。
5. 滅菌超純水を使用して2 mLの新鮮な1% BSA溶液を調製し、得られた混合物の2 mLに加えて、標識反応を急冷します。凝集を防ぐために穏やかに混ぜます。
6. 上記のプロトコルに従って、PKH-26で標識されたEVを濃縮します(ステップ2.2-2.7)。ラベル付けしたEVを300μLのPBSに再懸濁します。PKH-26 ラベル付き EV サンプルを 30 kDa フィルターチューブにピペットで移します。
7. サンプルを3,220 x g で4°Cで30分間遠心分離します。 このステップでは、遊離PKH-26色素と小分子がメンブレンを通過して濾液に入りますが、PKH-26で標識されたEVは保持液に保持されます。
8. 最初の遠心分離後、濾液を廃棄し、300 μLのPBSを保持液に加えます。ピペッティングで上下させて、EVをPBSに静かに再懸濁します。
9. サンプルを再び3,220 x g で4°Cで30分間遠心分離し、残っている遊離色素または低分子を洗い流します。
10. 濾液中のPKH-26の欠落を蛍光顕微鏡で確認します。染料が検出された場合は、洗浄手順を繰り返します。
11. マイクロピペットで上部の溶液を採取し、フィルターを採取チューブから取り外します。フィルターを慎重に反転させます(逆さまにします)。
12. 倒立フィルターを800 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 これにより、保持されたPKH-26-EVをフィルターメンブレンから新しい収集チューブに収集できます。次のステップでは、PKH-26-EVを直接使用してください。

4. 3Dバイオプリンティング

1. バイオインクの調製
   1. 滅菌超純水を使用して、新鮮な4.5%(w / v)ナトリウムAlg溶液を調製します。60°Cで一晩攪拌し、溶液を完全に溶解させます。
   2. CMChを滅菌超純水に溶解して、3.8%(w / v)溶液を実現します。新鮮なものを準備します。60°Cで一晩撹拌して完全に溶解します。
   3. 調製したバイオインクを3,220 x g で25°Cで10分間遠心分離し、印刷プロセスを妨げる可能性のある気泡を取り除きます。
   4. 調製した3mLのAlg溶液を標識されたEVと混合するか、シリンジミキサーを使用して色素のみのコントロールと混合し、EVの0.01%(w / v)濃度を達成します。穏やかに混合することで均一な分布を確保します。
   5. シリンジミキサーを使用して、1 mLのCMChを新たに調製したAlgLyase溶液と滅菌超純水で組み合わせ、最終濃度0.5 mU/mLを達成します。
2. 図 1A に示すように、Alg/Exo バイオインクをコア部分に、CMCh/AlgLyase バイオインクをコア/シースシリンジセットアップのシース部分に同時にロードします。
3. 印刷する前に、バイオインクを15分間休ませてください。
4. 3Dバイオプリンターのセットアップ
   1. 3Dバイオプリンターソフトウェアを使用して、 斜めのインフィルパターンを持つ円筒形を選択して足場構造を作成します。このためには、シリンダーの直径と高さをそれぞれ20mmと1.1mmに設定します。細孔径を1mmに設定します。
   2. コアとシースノズルの排気速度を1 mm / sに設定し、層あたり0.25 mmの厚さで、移動速度を6 mm / sに設定します。室温で1層あたり0.25mmの厚さで4層をプリントします。
5. ポリエステルフィルムへの印刷を開始します。
6. 加湿器をエアロゾル塩化カルシウム(2.2%)と一緒に使用して、押出プロセス中に足場を架橋します。加湿器のノズルを押出ヘッドから約20cm離して配置し、足場の構造を損なうことなく効果的な架橋を確保します。さらに架橋するには、足場を塩化カルシウム溶液(2.2%)に10分間浸します。
7. 足場を滅菌済みの超純水で3回すすぎ、余分な塩化カルシウムと結合していないバイオインクを取り除きます。
8. 足場の完全性と機能を最大3か月間維持するために、足場が4°Cの無菌環境で保管されていることを確認してください。

5. EVの発売追跡

1. 円形皮膚創傷モデルの作成
   1. 秋田県の雄のヘテロ接合型糖尿病マウス (8 週間) に、ケタミン (70 mg/kg) とキシラジン (10 mg/kg) の腹腔内注射を投与して麻酔します。反射反応(つま先のつま先つまみなど)がないかどうかを評価し、適切な麻酔を確認し、呼吸数を監視します。麻酔中の角膜の乾燥を防ぐために、滅菌済みの獣医用眼科用軟膏を目に塗布します。.
   2. まず電動バリカンで皮の背側を削り、肌の部分を整えます。皮膚の炎症や怪我を避けてください。剃った部分をポビドンヨード溶液を使用して滅菌します。
   3. 滅菌シーザーを使用して、各マウスの背側表面に6mmの円形の全層皮膚創傷を作成します。
   4. PKH標識EVを含む3Dバイオプリントされた足場を創傷床に直接そっと置きます。足場が傷口の表面を完全に覆い、最小限のエアポケットで、滅菌鉗子を使用して軽く押します。処置後、動物が綿密に観察され、完全に意識を取り戻し、胸骨の横臥を維持できるようになるまで、動物が付き添い続けられることを確認してください。
2. 蛍光イメージング
   1. 移植後2時間、4時間、8時間、24時間で、イソフルランを使用してマウスに麻酔をかけます。麻酔の導入のために、マウスを in vivo イメージングシステム(IVIS)のチャンバーに入れ、酸素中の2%〜3%イソフルランに曝露します。マウスの目に眼軟膏を塗布し、乾燥を防ぎます。麻酔をかけたら、マウスをIVISシステムに移し、鼻チャネルを介して送達される酸素中の1%〜2%イソフルランでマウスを維持します。.イメージングに進む前に、動物が完全に麻酔され、安定していることを確認してください。
   2. IVISシステムを使用して、スキャフォールドから放出されたPKH標識EVからの蛍光シグナルを捕捉します。イメージングウィザードで、[ 蛍光イメージング ]オプションを選択し、PKH色素の励起フィルターと蛍光フィルターをアクティブにします。視野や被写体の高さなどのカメラ設定を調整して、信号検出を最適化します。すべてのイメージング時間ポイントで一貫した位置決めを確保し、正確な比較を可能にします。画像の取得を開始し、結果のデータを保存します。
   3. IVISソフトウェアを使用して蛍光シグナル強度を定量化します。これにより、EVのリリースを経時的に追跡できるようになります。

Results

Alg-EV/CMChおよびAlg-EVs/CMCh-AlgLyaseスキャフォールドの両方からのEVのin vivo放出を図1B,Cに示します。予想通り、Alg-EV/CMCh-AlgLyase足場は、特に2時間および4時間の時点で、Alg-EV/CMChと比較してより迅速な放出プロファイルを示しました。ハイドロゲルからのEVの放出は、拡散、膨潤、侵食、および分解を含む物理化学的メカニズムの組み合わせによって支配される²⁰。Alglyaseを活用することで、足場はAlgの分解を促進し、EVの放出を加速して、創傷治癒の初期段階で慢性炎症を効率的に制御します。EVの早期放出は、治癒を遅らせる可能性のある過度の炎症を軽減するために重要です21,22,23。潜在的な非特異的凝集またはミセル形成を説明す...

Discussion

このプロトコルの重要な側面は、効率的なEV供給を実現するために不可欠なコアシース足場の設計です。この設計には、コア材料としてAlgを組み込み、シースとしてCMChとAlglyaseの組み合わせを組み込んでいます。このセットアップにより、EVの制御された迅速なリリースが容易になります。コアマテリアルであるAlgは、EVをカプセル化し、EVの保護とローカライズされた配送を保証します。CMChとAlglyaseで構成されるシースは、EVのタイムリーなリリースに不可欠なAlgコアの劣化を加速します。前回の論文¹⁸では、同様のスキャフォールドシステムからのEVの in vitro 放出速度を評価し、長期間にわたる制御された放出プロファイルを実証し、このアプローチが持続的な治療効果をもたらす可能性を強調しました。この制御された分解と放出は、精密な配合とカプセル化技術によって達成されます。これらのデータにより、EVの放出ダイナミクスと創傷治癒の進行との相関関係が可能になり、スキャフォールドの臨床的可能性についてより深い...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
23 G パープル精密コニカルノズル	Cellink	KT0000002000	詰まりを最小限に抑えたバイオインクの正確な押出
ギン酸リアーゼ (AlgLyase)Sigma	Aldrich	A1603-100MG	アルギアーゼは、アルギン酸を分解する酵素です。
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 30 kDa MWCO	Merck	UFC9030	PKH-26 標識 EV の洗浄に使用
BCA アッセイキット	Thermo Scientific	10678484	タンパク質/EV 濃度を決定するには
Bioprinting System	Regemat	V1	コアシース足場を製造するには
ウシ血清アルブミン (BSA)	sigma-aldrich	05470-5G	PKH 26 反応を止めるには
塩化カルシウム	シグマ アルドリッチ	C3306-100G	組織工学におけるバイオインクの架橋と安定
心分離機	シグマ	2-16P	EV 分離に使用 遠
心分離機 5810 R	エッペンドルフ	22625101	細胞培養に使用
クラス II 生物学的安全キャビネット	Telstar	Bio II アドバンス	細胞培養
CryoCube F570シリーズ - ULTフリーザー	エッペンドルフ	F571240035	EVの保存用
光顕微鏡	OLYMPUS	IX73P1F	濾液中の残留PKH-26をチェックするために使用されます
ゲンタマイシン (50 mg/mL)	Thermofisher	15750	細胞培養培地用抗生物質
GlutaMAX-I CTS、(100X)、液体	Thermofisher	A12860	細胞培地サプリメント
HCl	Sigma Aldrich	7647-01-0	バッファー調製
HEPESカー	ルロス	アート。いいえ 6763.3	バッファーの調製
高粘度カルボキシメチルセルロース (CMCh)	BDH	27929 4T	CMCh は、水溶性セルロース誘導体です。
インキュベーター	ニューブランズウィック	NB-170R	細胞培養
Invivo イメージング	PerkinElmer	IVIS Lumina XRMS シリーズ III	EVのリリースを追跡するには、in vivo
マグネットスターラー	SalvisLAB	MC35	バイオインク調製用
miRCURY エクソソーム単離用エクソソームキット	Qiagen	76743	Evs 単離
NaOh	Daejung	1310-73-2	バッファー調製
酸緩衝生理食塩水(PBS)	Thermo Scientific	J61196。AP	細胞培養
PKH 26	MCE	154214-55-8	EV アル
ギン酸ナトリウム (Alg)	グマ アルドリッチ	A0682-100G	褐藻由来の天然多糖類。
塩化ナトリウム(NaCl)	Carl Roth	Art-Nr-P029.1	バッファー調製
StemPro BM 間葉系幹細胞	サーモフィッシャー	A1382901	葉系幹細胞
StemPro MSC SFM XenoFree	サーモフィッシャー	A1067501	細胞培養培地
トリプシン 0.25%	サーモフィッシャー	25050014	細胞解離
ボルテックスミキサー	ハンサイエンティフィ	VM-10	殿バッファーとコンディショニング培地の混合に使用