FLICKアッセイを用いた薬物反応の包括的解析

サマリー

このプロトコルでは、薬物反応を評価するためにFLICKアッセイを使用する方法について説明しており、このアッセイを使用して薬物誘発増殖率と死亡率を計算し、薬物誘発性細胞死のメカニズムを評価するための詳細な手順が含まれています。

要約

薬効を理解するためには、薬物による細胞死の程度を特徴づけることが非常に重要です。薬物誘発性細胞死のレベルを定量化する取り組みは、それぞれが独自の活性化タイミングと生化学的特徴を持つ、分子的に異なる12種類以上の制御死の存在によって課題となっています。さらに、一部の壊死性死サブタイプでは、特徴的な特徴は一過性にしか観察されず、細胞の破裂により急速に失われます。したがって、死経路特異的アッセイを組み合わせて使用する場合でも、細胞死の総量や各死サブタイプの相対的な寄与を正確に定量することは困難です。もう一つの問題は、多くの死亡特異的アッセイが薬物が細胞増殖にどのように影響するかを無視しているため、薬物治療を受けた集団が拡大しているのか縮小しているのかを解釈するのが難しいことです。FLICKアッセイは、刺激後の細胞死の総レベルを、死に特異的でありながら、活性化された死の種類に大きく依存しない方法で定量化することができます。さらに、FLICKアッセイは、総集団サイズと細胞増殖速度に関する情報を保持します。この原稿では、FLICKアッセイの基本的な使用法、異なるタイプの生物学的材料を使用する場合のこのアッセイのトラブルシューティング方法、および観察された薬物応答に対する各タイプの細胞死の寄与を定量化するためのFLICKアッセイの使用方法について説明します。

概要

抗がん剤の場合、薬剤感受性の前臨床評価には、一般に、薬物が培養中の細胞の生存率にどのように影響するかを調べる^{ことが含まれます1}。薬物曝露後の細胞生存率は、薬物による細胞増殖の阻害と細胞死^{の活性化という}、少なくとも2つの別々の効果の産物です2。残念ながら、細胞死は持続的な薬物応答に必要な重要な特徴ですが、標準的なアプローチでは、薬物が細胞死を活性化する程度を明確にすることはできません³。

一般的な薬物反応アッセイには、細胞を直接カウントするアッセイ(コールターカウンター、フローサイトメトリーや顕微鏡法の一部の使用)、細胞の増殖能力を定量化するアッセイ(コロニー形成アッセイなど)、代謝活性を定量化するアッセイ(CellTiter-Glo、テトラゾリウムベースのMTTまたはMTSアッセイなど)などがあります。これらのアッセイに共通する特徴は、生成されるデータが生細胞の数に比例することです。薬物は増殖阻害と細胞死をどのように調整するかによって大きく異なるため、薬物曝露後の生細胞の数は、薬物誘発性細胞死のレベルについて信頼性の低い洞察を提供します³。さらに、がん細胞は一般に細胞培養で急速に増殖するため、

プロトコル

1. 目的細胞株ごとの透過化時間の最適化

注:記載されている容量と量は、1つの細胞株を最適化するためのものです。これらの値は、試験する細胞株の数に基づいてスケールアップする必要があります。

1. 96ウェルの光学底部黒壁プレートの各ウェルに所望の細胞数をプレート化します。100 μLの完全培地を加え、細胞をプレートに一晩接着させます。
   注:播種した細胞数は、細胞の増殖速度、最適な密度、およびアッセイの長さを考慮して最適化する必要があります。72時間にわたって測定された接着がん細胞株の典型的な開始細胞数は、ウェルあたり1500〜5000細胞です。例えば、U2OS細胞は、10% FBS、2 mMグルタミン、および1%Pen-Strepを添加したDMEMでウェルあたり2000細胞でプレーティングし、標準条件(5% CO₂、37°C、湿度)で一晩培養することができます。
2. 15 mLの円錐形遠心チューブで、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解したTriton-Xの1.5%溶液1.5 mLを調製します。1.5% Triton-X 溶液を最高速度で 5 秒間ボルテックスします。37°Cのウォーターバスに30分以上入れます。
3. 溶液を目視検査し、Triton-Xが数秒間ボルテックスして完全に溶解したことを確認します。ソリューションが均一であることを確認します。
<....

結果

このプロトコルを使用して、HDAC阻害剤Belinostatに対するU2OS細胞の感受性を調査しました。これらの実験は、2 μM SYTOX Greenを使用して死細胞を標識するために行いました(図1A)。キネティック読み取りは、130ゲイン設定の蛍光プレートリーダーを使用して行われました(図1B)。アッセイの終了時に、PBS中の1.5% Triton-X溶液に細胞を2時間溶解しました(図1C-D)。

FLICKプロトコルは、集団増加率と薬物誘発性細胞死率に関する洞察をもたらします。これらの洞察は、個別に表示することも、ドラッグGRADEの視覚化および分析フレームワークを使用してまとめて表示することもできます(図1E)。GR値を使用してBelinostat感度を評価すると、1μMのBelinostatのGR値が約.......

ディスカッション

FLICKアッセイは、細胞集団の成長と死に対する薬物の影響を包括的に評価するための堅牢な方法です。この方法では細胞を直接カウントしないため、プロトコルの重要なステップは、トリトン透過化ステップ中にアッセイの直線性と完全な溶解を確保することです。正しい透過化時間は、このプロトコルで強調されているように視覚的に識別することも、プレートの蛍光を経時的に読み取り、シグナルがプラトー化するタイミングを特定することで定量的に識別することもできます。しかし、私たちの経験では、疑わしい場合、より長く待つことによるコストはないように思われます:FLICKアッセイで使用したDNA色素の場合、シグナル強度は溶解後数日間安定したままです。私たちは定期的にSYTOX Green核酸染色試薬を使用しており、表1で参照されている各蛍光色素はバリデーションしていませんが、他のいくつかのプロトコルはそれらの効果的な使用を示しています13,15,16。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Belinostat	ApexBio	A4612
カンプトテシン	ApexBio	A2877
円錐形遠心分離管、15mL	Fisher Scientific	12-565-269
DMEM	Corning	10017CV	細胞の播種および投薬用
DMSO	Fisher Scientific	MT-25950CQC	細胞
の播種および投薬用Fisherbrand 96ウェル、細胞培養処理、U字型底マイクロプレート	Fisher Scientific	FB012932	細胞の播種および投薬用(ピンプレート)
Greiner Bio-One セルスター&ミュー;透明な96ウェル、細胞培養処理済み、平底マイクロプレート	Greiner	655090	細胞の播種と投薬用
IncuCyte S3	Essen Biosciences		どの位相顕微鏡でも動作します
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	MATLAB バージョン R2023b、ライセンスが必要です
プレート蛍光リーダー	Tecan	Spark	死細胞蛍光測定用
Palbociclib	ApexBio	A8316
PBS	Corning	21-040-CM	任意のPBS作品
Spark Multimode Microplate Reader	Tecan	https://www.tecan.com/spark-overview	SparkControlソフトウェアバージョン2.2
滅菌リザーバー、25 mL	Fisher Scientific	13-681-508	細胞の播種および投薬用
Sytox Green 核酸染色	Thermo Fisher Scientific	S7020	死細胞蛍光測定用 DNA 染色
Triton-X 100	Thermo Fisher Scientific	J66624-AP	性細胞用
U2OS	ATCC	HTB-96	このプロトコルで使用される細胞株の例
Z-VAD-FMK	ApexBio	A1902

マイクロ 透過