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方法論記事

母乳微生物叢の個別化再構成:実社会での実行可能なアプローチ

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DOI：

10.3791/67769

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2025年2月7日

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1Laboratory of Immunoregulation, iREG, Department of Microbiology, Immunology, and Parasitology, Center for Dysbiosis Control, Federal University of Santa Catarina, 2Laboratory of Applied Molecular Microbiology, MIMA, Department of Clinical Analysis, Center for Dysbiosis Control, Federal University of Santa Catarina, 3Carmela Dutra Maternity Hospital, 4Laboratory of Applied Immunology, LIA, Department of Microbiology, Immunology, and Parasitology, Center for Dysbiosis Control, Federal University of Santa Catarina, 5Laboratory of Metabolism and Nutrition, MenuLab, Department of Pediatrics, Center for Dysbiosis Control, Federal University of Santa Catarina

この記事について

サマリー

この記事では、実際の実際の環境で、母親自身のミルク微生物叢を使用して低温殺菌されたドナーミルク微生物叢を再構成するためのプロトコルについて説明します。これは、効果的な細菌増殖とマイクロバイオームの調節を示し、産科病院とそれに関連する母乳バンクの日常的なケアにおけるこの手順の実現可能な適用をサポートします。

要約

Mother's own milk(MOM)は、新生児にとって最も完全な栄養源です。母親が十分な母乳を生産できない場合、または母乳育児ができない場合、推奨される代替手段は、母乳バンクによって日常的に提供されている低温殺菌ドナー母乳(PDM)です。PDMは、市販のフォーミュラと比較して、優れた栄養成分と免疫学的要素を提供します。しかし、バイオセーフティを確保するために、PDMは低温殺菌、つまり共生微生物叢を不活性化し、特定の生理活性化合物を減少させるプロセスを受けます。この研究では、MOM を微生物源として使用して PDM の微生物叢を回復させるように設計されたプロトコルを提示し、このアプローチを実際の臨床環境に適応させます。

このプロトコルは、母親が十分な母乳を生産できない早産児にパーソナライズされたドナーミルクを提供することを目的として、産科病院とそれに関連する母乳バンクで実施された臨床試験で実施されました。この方法論では、PDMにMOMの10%を接種し、続いて37°Cで4時間インキュベートします。微生物学的分析により、インキュベーション後の接種牛乳(IM)での細菌増殖が成功したことが示され、再構成された牛乳(RM)の微生物叢プロファイルはMOMのそれと非常によく似ており、効果的な微生物叢の回復が示されました。これらの結果は、再構成プロトコルが新生児ケアでの実施に実行可能であり、PDMの栄養的および免疫学的品質を向上させる可能性があり、それによって母乳で育てられていない新生児の健康と発達をサポートすることを示唆しています。

概要

母乳は、新生児にとって最良の栄養源として広く認識されており、必須のマクロ栄養素や微量栄養素だけでなく、さまざまな代謝物や抗体、サイトカイン、細胞などの免疫系の成分を含む複雑な要素も提供します1。さらに、母乳の有益な特性は、共生微生物のコミュニティからも生じます。母乳のこれらすべての要素は、新生児の発達に重要な役割を果たします1。微生物叢として知られる微生物叢のコミュニティは、食事、母親のライフスタイル、分娩の種類、在胎週数などの要因の組み合わせによって影響を受け、その結果、各牛乳は特定の特性を持つ微生物叢を持っています2。母乳微生物叢が新生児の発達に利益をもたらすメカニズムは、共生細菌によるコロニー形成による腸内表面の保護から、腸内の免疫細胞と相互作用する代謝産物の産生による免疫系の成熟の促進まで多岐にわたります3。このため、各母乳中の微生物の個別化されたプロファイルは、それを新生児のための個別化医療の一形態にします4。

健康な微生物叢の存在は、特に病院環境にいて免疫系が未熟であるためにこれらの外部影響に対してより脆弱な未熟児にとって、生態学的ニッチを占有し、栄養をサポートすることにより、潜在的に病原性微生物によるコロニー形成から新生児を保護するのに役立ちます。さらに、早産の母親は、新生児に十分な量のミルクを生産するのが難しいことがよくあります。母乳生産量は、通常、在胎週数5歳が若いほど低くなります。これらの場合、新生児に栄養を与えるための最良の選択肢は、Human Milk Banks(HMB)6によって提供される低温殺菌ドナーミルクです。

ブラジルは、世界で最大かつ最も広範なHMBネットワークを持っています7。このネットワークは、保健省が管理する全国統一保健システム(Sistema Único de Saúde)を通じて、親に無料で160,000リットル以上の低温殺菌ドナー母乳(PDM)を収集、準備、配布しています7。低温殺菌は、新生児を対象とした寄付された牛乳のバイオセーフティを確保するために不可欠です。このプロセスは通常、生のドナー母乳の容器を62.5°Cの水浴に30分間浸すことを含むホルダー法を使用して実行されます6,8。得られたPDMは、消費の準備が整うまで冷蔵下で保管されます。しかし、低温殺菌は、牛乳の共生微生物叢の生存率を低下させ、さまざまな生理活性成分のバイオアベイラビリティを低下させます。これは、新生児への病原性微生物の感染を防ぐために、低温殺菌プロセスが標準化されているためです。これに関連して、Cacho氏らは2017年に、母親自身の母乳をさまざまな割合でPDM9に接種することにより、母親自身の母乳の共生微生物叢を再構成する可能性について説明しました。その結果、10%の濃度の母乳(MOM)を使用することが、MOMマイクロバイオームプロファイルの元の組成を維持するために最適な濃度であることが実証されました。このアプローチは、特定の細菌の異常増殖のリスクを軽減します。これは、通常は共生しますが、再構成された牛乳に不均衡に存在すると有害になる可能性があります。具体的には、1:10の希釈(10%MOM+90%PDM)を4時間インキュベートすると、バランスの取れた細菌量(希釈されていないMOMの約60%)が得られ、より安全で効果的なアプローチが示されました。対照的に、3:10などの高希釈は過剰な細菌増殖につながり、安全性を確保するための制御された濃度と条件が重要であることが浮き彫りになりました。

この記事では、PDMで母乳微生物叢を再構成するこの手順が、産科病院とそれに関連する母乳バンクの日常的なケア内の実際の状況で達成できることを示します。

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プロトコル

このプロトコルは、私たちの研究グループ(Brazilian Registry of Clinical Trials、ReBEC RBR-729kr8x)が実施した臨床試験の手順の一部として実施され、倫理委員会の承認を受けました(プロセスCAAE nº 41063520.4.0 000.0121)そして、無作為化とサンプル収集の前にすべての参加者からインフォームドコンセントが得られました。

牛乳微生物叢を再構成する手順は、次の3つのステップで行われます。

1.母乳の入手

注:牛乳を入手する手順は、他の場所10,11にあります。

  1. 手続きの前に、倫理委員会に従って母親からインフォームドコンセントを取得し、母親がリラックスできるように、手続きに関する疑問、懸念、恐れ、不安に対処して、母親に対して行われるすべてのことを必ず説明してください。
  2. 各産科病棟の地域衛生基準に則り、担当看護師の監督のもと、電動搾乳器で母乳を滅菌容器に入れて搾乳してもらいます。
  3. 収集後、母乳を入れている容器に母親の情報、収集日、収集時間を記載したラベルを付けます。母乳(MOM)を-4°C以下の温度で最大12時間保管します。

2.低温殺菌されたドナーミルク(PDM)の解凍

注:HMBは、-4°C未満の温度で最大6ヶ月間凍結されたPDMの独自のストックを持っており、その手順は他の文献12,13,14で詳しく説明されています。

  1. プラスチック蓋付きの滅菌済みガラス容器に保存された生乳またはPDMを40°Cの水浴で解凍し、温度の維持と処理時間の短縮を確保します。
    注意: PDMを室温または冷蔵温度(冷蔵庫内)で解凍しないでください。これらの場合、解凍時間が長くなり、微生物への曝露と成長が促進されます。
  2. ボトル内のミルクが5°Cを超える温度に達する前に、母乳瓶をウォーターバスから取り出します。

3. マイクロバイオーム再構成のためのPDMのMOM接種

注:PDMにMOMを接種するプロセスの標準的な体積比は90%:10%(v / v)です。手順のステップは次のとおりです。

  1. 技術者に、白衣、マスク、帽子、手袋を着用するように指示します。
  2. 作業面は、現地の施設のプロトコルに従って表面洗浄液で清掃します。
  3. 使用する材料を手配し、機器を準備します。インキュベーター(ウォーターバス)を水で37°Cに予熱します。
  4. 使用する接種済み牛乳の最終的な量を計画し、適切なサイズの容器を選択します。新鮮な生のMOMと液体のPDMが入った容器を作業台に置きます。
  5. 滅菌装置を使用して最大1mLのMOMのアリコートを収集し、その後の16Sシーケンシングと細菌数測定を行います。アリコートをDNase/RNaseフリーのクライオチューブに-80°Cで保存します。
  6. 無菌容量測定器具(シリンジ、ピペットなど)を使用して、最終的な希望量の10%に相当する残りの容量を食品安全容器に移し、37°Cの水浴に浸します。
  7. 滅菌装置を使用してPDMの1 mLアリコートを採取し、その後の16Sシーケンシングおよび細菌数測定を行います。アリコートをDNase/RNaseフリーのクライオチューブに-80°Cで保存します。
  8. 滅菌容量測定器具(シリンジ、ピペットなど)を使用して、最終的な所望量の牛乳の90%に相当する量のPDMを、前のステップのMOMで容器に移し、接種された母乳(IM)を形成します。
  9. ボトル内部が外部液に混入しないように蓋をして容器を密封し、37°Cのウォーターバスに4時間浸して、ミルクに接種した微生物が増殖できるようにします。
  10. 4時間後、発酵IMの入った容器を、再構成牛乳(RM)と呼ばれる水浴から取り出します。
  11. その後の16Sシーケンシングと細菌数のために、滅菌装置を使用して最大1mLのアリコートを予約します。アリコートストアは、DNase/RNaseフリーのクライオチューブに-80°Cで保存します。
  12. 残りの容量を新生児に授乳するための消毒された容器に移します。

4. プレート上での細菌培養による方法の検証

注:すべての手順は、汚染を防ぎ、希釈の精度を確保するために、滅菌条件下で実行する必要があります。細菌の増殖は、他の場所で述べられている方法を用いて推定することができる9,15。

  1. 各ミルクサンプル(PDM、MOM、IM、RM)を滅菌生理食塩水で10-1、10-2、10-3、および10-4濃度で段階希釈液を調製します。各希釈液を完全に混合して、細菌の分布が均一になるようにします。
  2. 希釈した各サンプル100 μLを、滅菌済みのDrigalskiループまたはガラススプレッダーを使用して、Man-Rogosa-Sharpe(MRS)プレートおよびMannitol Salt Agar(MSA)プレートに3回に分けて広げます。ボリュームが寒天プレート上に均一に広がっていることを確認してください。
  3. MRS寒天プレートを嫌気性ジャーに入れてインキュベートし、乳酸菌の増殖のための低酸素環境を作り出します。
  4. マンニトール塩寒天培地(MSA)プレートを好気的にインキュベートして、ブドウ球菌種の成長をサポートします。
  5. プレートを37°C±2°Cで48〜72時間インキュベートします。
  6. 寒天の種類ごとに可算数の細菌コロニー(25〜250コロニー)で希釈を選択します
  7. 選択した希釈について、3つの反復プレートのそれぞれに見えるコロニーをカウントします。
  8. MRSおよびMSA培地の両方で、選択した希釈液のトリプリケートプレートから平均コロニー数を計算します。
  9. 次の式を使用して、各サンプルの mL あたりのコロニー形成単位(CFU)の数を決定し、解釈を容易にするために 10 進数対数スケール(log10)に変換します。結果の統計分析を進めます。
    CFU/mL = コロニー数×総希釈係数/mL メッキ容量

5. 牛乳マイクロバイオーム解析

注:ミルクマイクロバイオーム分析は、他の場所で説明されている方法とパイプラインに従って実行できます16。この分析で使用した R スクリプトのスクリーンショットを 補足図 S1 に示します。

  1. サンプル500μLを180 × g で15秒間遠心分離し、細胞および微粒子を沈殿させます。
  2. 上清を350μL採取し、DNA抽出に用います。
  3. 分光光度計を使用して抽出したDNAを定量します。
  4. 20 ngのDNAおよびプライマー357F/805Rを用いて、16SリボソームRNAのV3およびV4領域を増幅する( 材料表参照)17。
  5. 磁気ビーズを使用して、得られたアンプリコンを精製し、DNA蛍光計を使用してバーコード付きアンプリコンを定量します。
  6. ペアエンドの 250 bp モードでアンプリコンをシーケンシングします。
  7. 高品質のトリミングおよびアダプタの取り外し18を実行することにより、得られたシーケンスを処理する。ペアエンドモード(PE)とPhred33スコアリングを使用し、最小読み取り長を200bpに設定して、高品質の読み取りを確保します。
  8. ペアエンド配列データを QIIME 219 にインポートするには、マニフェスト ファイル形式とコマンド qiime tools import を使用します。
  9. インポートした配列を DADA2 で処理し、ノイズ除去、レプリケーション解除、キメラ除去を行うには、qiime dada2 denoise-paired コマンドを使用します。このステップにより、高品質の代表配列と特徴テーブルが生成されます。
  10. 特徴と配列をフィルタリングして、十分な表現を持つものだけを保持するには、qiime feature-table filter-features と qiime feature-table filter-seqs コマンドを使用します。
  11. プライマー(V3-V4)によって増幅された領域を抽出し、参照データベースを準備します。 qiime feature-classifier extract-reads。
  12. 次のコマンドを実行して、Silva参照データベースを97%のアイデンティティしきい値で分類学的分類にVSEARCHアルゴリズムを使用します。
    qiime feature-classifier classify-consensus-vsearch
  13. BIOM ツールを使用して、分類学の割り当てを特徴テーブルと統合します: biom add-metadata。
  14. 他の場所で説明したように統計分析を実行します20,21。

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結果

プレート培養による細菌増殖解析
Cacho et al.9 が提案したように、PDM に MOM を接種する方法を検証するために実施された微生物学的試験では、CFU/mL 数に基づいて、4 時間のインキュベーション前後で接種した牛乳サンプル間に有意差がないことが示されました。しかし、これら2つの時点でコロニー数の違いが観察され、 ブドウ球菌 属のMSA(図1A)と乳酸菌(LAB)のMRS培地(図1B)でのインキュベーション中に細菌が増殖したことが示されました。予想通り、PDMサンプルは細菌の増殖を示さず、低温殺菌プロセスの有効性を確認しました。

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ディスカッション

ここでは、さまざまな理由で新生児に十分な母乳を提供できない特定の母親からの母乳微生物叢の再構成をPDMに提供することを目的とした、母乳バンクに関連する産科病院に適用されるプロトコルを紹介します。このプロトコルはシンプルで、基本的には2つのステップに基づいています。1つ目は、ドナーミルクの適切な収集とその後の低温殺菌、および微生物叢が拡大する母親自身のミルクの収集のために、母乳バンクで日常的に行われる手順の適用を含む6,7,8。2番目のステップは、2017年にCachoと共同研究者によってin vitroで記述された手順に基づいています9。このプロトコルは現在、私たちが開発している臨床研究(ReBEC RBR-729kr8x)に適用されており、母親自身の母乳微生物叢でパーソナライズされたPDMを投与されている新生児の利点を...

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開示事項

著者は、競合する利益がないことを宣言します。

謝辞

著者は、Programa de Pesquisas para o SUS、PPSUS / 2020、MinistériodaSaúdedoBrasilからの資金提供に感謝します。Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Estado de Santa Catarina, 助成金番号: 2021TR000506;Programa de Pesquisa Universal, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) do Ministério de Ciência e Tecnologia do Brasil, グラント番号: 420996/2023-0;Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica 2022 - 2024, グラント番号: 120815/2023-0.また、サンプルを提供してくださったボランティアの方々にも感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
電動母乳ポンプホリゲンXN-2219M2ソフトポンプ デュアルプラス
パイレックス メディアボトルコーニング CLS1395100プラスチック蓋付きガラス容器 
1000 &マイクロ;Lピペット Labmate proCorning HTL SA  5666可変容量ピペッター 
極低温バイアル コーニング CLS431417DNase/RNaseフリー2 mLバイアル 
15 mL遠心チューブCorning CLS431470DNase/RNaseフリー15mLチューブ 
ウォーターバスEcoSonicsQ3.0 / 40A
マン–ロゴサ–シャープ(MRS) Difco288210乳酸菌増殖培
マンニトール塩寒天培地 (MSA)HimediaMH118ブドウ球菌  増殖培地
嫌気性ジャー置換乳酸菌増殖のための低酸素環境を作り出す
抽出物 キット–DNA e RNALoccusMPTA-PV16-B YDNA抽出キット
NanodropPromegaE6150Quantus DNA
GoTaqG2PromegaM7841PCR増幅システム
Quantus FluorometerPromegaE5150DNA/RNA定量キット
MiSeq SystemIllumina Inc.M-GL-00006 v4.0シーケンシング装置
MiSeq Reagent Kit v2 (300サイクル)株式会社イルミナMS-102-2002シーケンシングキットおよび試薬
ソフトウェア名 
Trimmomatichttp://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomaticIllumina NGSデータ用読み取りトリミングツール
QIIME 2 https://docs.qiime2.org/2024.10/マイクロバイオーム解析パッケージ 
Primer namePrimer sequence
16S_357F TCGTCGGCAGCGTCAGA
TGTGTATAAGAGACAGC
CTACGGGNGGCWGCAG
16S_805RGTCTCGTGGGCTCGGAG
ATGTGTATAAGAGACAGG
ACTACHVGGGTATCTAATC
地

参考文献

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