ナノファイバー膜を用いた上皮細胞の三次元共培養モジュールの確立

サマリー

ここでは、ナノファイバー膜ベースの2層システムで線維芽細胞を培養した上皮細胞が、膜に安定して付着して増殖する様子を示します。

要約

上皮細胞の培養における技術的なハードルには、脱分化や機能の喪失などがあります。バイオミメティック3次元(3D)細胞培養法は、細胞培養の効率を高めることができます。本研究では、3次元環境下で線維芽細胞を培養し、上皮細胞を組織様層として培養することを目的とした先進的な2層培養システムを紹介する。ポリビニルアルコール(PVA)およびポリ(ε-カプロラクトン)(PCL)ナノ繊維膜(NM)は、エレクトロスピニングによって作製され、それぞれ上皮細胞および線維芽細胞の培養に生理学的に関連する細胞外マトリックスとして利用されました。上部インサートウェルでは、肺上皮細胞をPVA NMで培養し、下部チャンバーでは、線維芽細胞をPCL NMで培養しました。この構成により、細胞間直接の接触が排除され、可溶性因子によって媒介されるパラクリンシグナル伝達の検査が容易になります。共焦点顕微鏡法を用いて、上皮細胞の閉塞帯を含む細胞内タンパク質の分布、成長パターン、および発現を解析しました。Zスタッキング技術により、詳細な3D再構成が可能になり、上皮層内のタイトジャンクションと空間構成の完全性に関する正確な洞察が得られました。走査型電子顕微鏡(SEM)は、ナノファイバー膜上の細胞タイプの形態学的特性を評価しました。SEMイメージングにより、複雑な細胞表面構造とナノファイバーとの相互作用が明らかになり、細胞構造とナノファイバー構造との細胞相互作用に関する包括的な視点が得られました。Cell Counting Kit-8(CCK-8)アッセイは、上皮細胞および線維芽細胞の増殖速度を経時的に測定するための簡単な方法です。これは、これらの細胞を共培養することによる増殖挙動と潜在的な相乗効果を提供します。これらの知見は、上皮組織の再生、内皮細胞、免疫細胞、その他の間質細胞による腫瘍微小環境、毒性アッセイ、薬物活性試験など、さまざまな生理学的および薬理学的状況で重要な、線維芽細胞と上皮細胞の同時培養のための単純なインサート共培養システムの有効性を強調しています。

概要

何十年にもわたって、古典的な二次元(2D)単層培養は、感染症、薬理学、毒物学を理解するために不可欠でした^1,2。ただし、組織微小環境の複雑さ、マルチコンポジション間の動的相互作用、および3次元(3D)アーキテクチャを考慮することが重要です。したがって、2D細胞培養は、組織様構造を模倣することに限界がある^3,4。例えば、細胞間および細胞間マトリックス(ECM)シグナル伝達が欠如しており、これは生体内微小環境における細胞分化、増殖、細胞機能に不可欠です。これらの理由から、3D細胞培養のシステムが開発されてきました⁵。3D培養中の細胞は、周囲の細胞外マトリックスと3次元で増殖し、相互作用します。さらに、単純な単一細胞タイプのin vitroモデルとin vivo^で発生する動的な細胞相互作用との間のギャップを埋めるために、複数の細胞タイプで構成される3D共培養アプローチが開発されました6。3D共培養システムは、細胞間コミュニケーションおよび細胞-細胞外マトリックス(ECM)相互作用の研究で人気を博しています7,8,9,10。現在の3D共培養システムにはいくつかの形態があり、直接共培養と間接共培養に分けることができる^8,9。直接共培養では、培養細胞のさまざまな細胞機能が、パラクリン効果ではなく直接接触によって主に影響を受ける可能性があります。これに対し、間接共培養は、バリアや層を使用して異なる細胞タイプを分離することにより、パラクリンの相互作用を研究する上でより大きな利点があります。

生体適合性および生分解性物質¹⁰を用いてECMを模倣した生体模倣スキャフォールドを作製するために、種々の材料および方法が利用されている。ナノファイバー状の足場構造は、生体組織における天然ECMの形状を模倣し、細胞培養のための3D構造を提供する^11,12。エレクトロスピニングナノファイバー膜(NM)は、異なる種類の細胞の直接的および間接的な共培養に使用されてきた13,14,15。

上皮細胞は主要な器官の物理的障壁を形成しますが、線維芽細胞はECMリモデリングを媒介し、隣接する上皮を調節する主要な間質細胞です^6,16,17。上皮細胞および線維芽細胞は、細胞表面上のインテグリン受容体を介して、それぞれ基底膜のラミニンおよび間質マトリックスのフィブロネクチンと相互作用する¹⁸。直径150-250nmのポリ(ビニルアルコール)(PVA)NMと微細孔で上皮細胞を培養すると、細胞凝集体やスフェロイドの代わりに多層を形成し、その増殖パターンは上皮組織の細胞と類似している¹⁹。これに対し、直径400-1,500 nmおよび10-50 μmの微細孔を有するポリ(カプロラクトン)(PCL) NMは、培養線維芽細胞の増殖のための間質マトリックスと同様の空間的次元を提供する^13,14。PVAおよびPCLメンブレンは、その生体適合性により、組織工学で一般的に使用されるポリマーです^20,21。

本研究では、多孔質エレクトロスピニングNMを用いて、上皮細胞を組織状層として、また3次元構造内の線維芽細胞として培養する先進的な2層培養システムを紹介します。このプロトコールは、ナノファイバーの作製、ファイバーの架橋後および品質評価、膜付着培養ウェルの調製、細胞播種および3D共培養、3D培養細胞のアッセイの5つの主要な段階に分けることができます。

プロトコル

1. 水安定性PVAナノファイバーの作製

1. ポリアクリル酸(PAA)0.02gとPVA1gを秤量し、磁気バーが入ったきれいなガラス瓶に入れます。ボトルに7.8mLの蒸留水を加え、ボトルをプレートスターラーに置き、温度を84°C、速度を500rpm、時間を12時間に設定します。
2. ボトルを室温まで冷ましてから、0.2 mLのグルタルアルデヒド(GA)を加えます。ボトルをプレートスターラーに置き、速度を500rpm、時間を30分、温度を室温に設定します。
3. エレクトロスピニングには5mLのシリンジを使用し、プランジャーをバレルから分離し、バレル内とプランジャーの先端の小さなプラスチックの破片を清掃します。
4. 針を使用して液体の流れを遮断し、PVA溶液を各バレルに注ぎます(容量:各2.5〜3 mL)。プランジャーを組み立ててから、針を取り外します。
   注:溶液に気泡がある可能性があるため、気泡が消えるまで待ちます。これには10〜30分かかります。
5. 新しい27Gの金属針を組み立て、エレクトロスピニングマシンに入れます。
6. コレクターをホイルでしっかりと包みます。
7. インジェクターパネルを元の位置に戻します。機械には次の設定を使用します:(各ポンプ)注入量:2 mL、注入速度:6 μL / min、ローラー速度:100 rpm、チップからコレクターまでの距離:14 cm。各ポンプの液体の流れを確認してください。
8. 約12kVの電位で機械を運転します。
9. プロセスの最初に湿度が40〜50%、プロセスの終了時に25〜30%であることを確認してください。湿度が下がるときに加湿器を使用し、エレクトロスピニングの前日に蒸留水が入った皿を機械の中に入れて湿度を上げます。
   注:これは、PVAナノファイバーの作製を成功させるための重要な要素です。
10. フローを定期的に確認してください。針が詰まっている場合は、機械を一時的に停止してください。実験室のワイプを使用してドロップを取り除き、新しいドロップが表示されるまで待ちます。そうでない場合は、針を交換してから、マシンの実行を続けます。
11. PVAナノファイバーの製造プロセスは、完了するまでに~6時間かかります。エレクトロスピニングプロセスが終了したら、ファイバーマットを含むホイルをコレクターから取り外し、ナノファイバーマットを真空下で乾燥剤で保管します。

2. 塩酸(HCl)蒸気によるPVAナノファイバー膜の処理と繊維品質評価

注:PVA NMsの水安定性は、HCl蒸気による架橋後反応後も良好に維持されます。PVAは非常に親水性のポリマーであり、エレクトロスピニングPVAナノファイバーは水との接触や湿度の高い条件下では不安定です。PVA NMは、PVAポリマーの製造直後にHCl蒸気で処理する必要があります。

1. ナノファイバーマットをトランスウェルインサートに必要なサイズにカットします。
2. 純粋なHCl1.5mLが入った小さな皿を用意し、HClを含む皿とナノファイバー片を真空チャンバーに入れ、蓋を閉めます。
   注:HCl蒸気は、ナノファイバーを水に安定させるための架橋後剤として使用されます。
3. 真空ポンプに接続されているバルブを開き、HClヒュームが上昇するまで10秒待ってから、バルブを閉じます。メンブレンをHClヒュームで2分間処理します。
4. HCl蒸気で処理した後、メンブレンに蒸留水(DW)を数滴加え、スライドガラスに載せて、メンブレンをホイルから取り除きます。20分間風乾した後、メンブレンは自然にスライドにくっつきます。
5. カーボンテープにオートスパッタコーターを使用して、メンブレンを金の薄層でコーティングします。走査型電子顕微鏡(SEM)画像を取得します。
6. PVA NMをHClと架橋した後、1x PBSで3回洗浄し、培地に浸した後でpHをチェックしてHClが残っていないことを確認します。

3. PCLナノファイバーの作製とナノファイバー品質評価

1. PCL1.5gを秤量し、きれいなガラス瓶に加えます。ボトルに8.5mLのクロロホルムを加え、プレートスターラーにボトルを載せ、PCLをクロロホルムに室温で12時間溶解します。
2. 手順1.7と1.8を除き、手順1.3から1.9を繰り返し、注入速度を8μL/min、電圧を17.5kVに設定します。
   注:PCLの作製には、完成までに~3.5時間かかります。
3. メンブレンの小片をカットし、自動スパッタリングプロセスで5分間コーティングします。SEM画像を取得します。

4. トランスウェル内での2層のメンブレンの組み立て

注:このプロトコルでは、24ウェルプレートとそれに対応するインサートウェルを使用します。PVA NMはインサートウェルに取り付けられ、PCL NMはボトムウェルに取り付けられています。

1. ナノファイバーマットを丸くカットし、PVAとPCL NMにそれぞれ直径10mmと13mmの直径にします。
2. ポリジメチルシロキサン(PDMS)シルガード184を接着剤として使用して、メンブレンをインサートとチャンバーウェルに接着します。使用する前に、Sylgard 184ベース(パートA)と硬化剤(パートB)をプラスチックカップに10:1の質量比で混合します。きれいなスライドガラスを使用して、混合物全体が気泡で満たされるまで、PDMS溶液を2〜3分間激しく混合します。泡が形成されて10分間消えてから使用してください。その間、滑り台を100°Cまで温めます。
3. PDMSをスライドガラス上に広げ、インサートの下端をPDMSに少し浸します。スライドウォーマーでインサートを逆さまにして、PDMSが硬化します(10~15分)。200 μLのチップでPDMSがべたつかないか注意深く確認してください。
4. PVA NMピースは、手順2.2から2.4の説明に従って取り扱います。
5. インサートの底がメンブレンピースのナノファイバー側によく向くように、インサートをPVA NMピースにしっかりと押し付けます。井戸の中央に蒸留水を一滴加え、鉗子を使用してホイルを取り除きます。インサートを新しい24ウェルプレートにしっかりと入れ、メンブレンを乾かします。
6. PCL NMピースをボトムウェルに取り付けるときは、必ず200 μLのチップをPDMS混合物に浸し、四隅と中央に正確に点在させてください。
7. プレートをスライドウォーマーに置き、PDMSを5〜7分間硬化させて、アセンブリの品質を確保します。
8. PCL NMピースをPDMS含有ウェルに入れ、メンブレンのナノファイバー側をPDMSに接着します。小さなきれいなブラシを使用して、メンブレンピースのホイル側を少し押して、完全に取り付けます。0.2 mLの70%エタノールをウェルに加えると、ホイルを簡単に取り除きます。
9. トランスウェルセットアップのインサートとボトムウェルをUVライトで一晩滅菌します。
   注:混合PDMSは、さらに使用するために-20°Cで保存できます。注意:PCLナノファイバー膜付属プレートは乾燥して保管できますが、使用前に70%エタノールで濡らす必要があります。
10. 翌日、1x リン酸緩衝生理食塩水(PBS)をそれぞれ200 μLと500 μLを加えて、インサートと底をよく洗浄します。インサートとボトムウェルはすぐに使用できます。

5. 共培養モデルのための細胞播種と2層の組み立て

注:MLE-12細胞は、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質を含む1x Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)/F12で培養しました。NIH3T3細胞を、10%FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシン系抗生物質を含む1x DMEM高グルコースで培養しました。

1. 細胞を150 mmの培養皿に保持します。70〜80%がコンフルエントになったら、1x PBS10 mLで細胞を洗浄し、予熱した0.05%トリプシン/EDTA溶液2 mLで37°Cで3分間トリプシン化します。
2. 皿を軽くたたいて細胞を底から取り除き、各タイプの細胞に8 mLの完全培地を加えてトリプシン酵素を中和します。細胞懸濁液を50mLの遠心チューブに移し、400 × g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。Cell-Trackerで細胞を染色し、NM上の播種細胞の分布を観察します(詳細についてはセクション6を参照)。
3. 細胞ペレットを5 mLの完全DMEM/F12培地に再懸濁します。細胞番号を決定し、6 × 10⁶ MLE-12 細胞/mL および 8 × 10⁵ NIH3T3 細胞/mL に調整します。
   注:完全なDMEM/F12培地は、MLE-12およびNIH3T3細胞との共培養に使用されます。
4. ボトムウェルに500 μLの完全DMEM/F12培地(PCLを含まないウェル)を充填します。PVAナノファイバー膜付着インサートをトランスウェルに移し、MLE-12細胞懸濁液50μLを添加します。細胞を37°Cおよび5%CO₂でインキュベートします。
5. 同時に、PCLナノファイバー膜接着ボトムウェルに500μLのNIH3T3細胞懸濁液を充填し、細胞を37°Cおよび5%_CO2でインキュベートします。
6. 2時間後、トランスウェルセットアップでMLE-12細胞含有インサートとNIH3T3細胞含有ボトムウェルを組み立てます。これは、MLE-12細胞を上層、NIH3T3細胞を下層とする共培養モデルです。2層構造のメンブレンで細胞を所望の時間共培養します。

6. 細胞分布アッセイ

1. 5 μMのCell-Tracker赤および緑溶液を、合計2 mLの完全DMEM/F12培地に調製します。
2. トリプシン処理後、MLE-12細胞をあらかじめ調製したCell-Tracker赤色溶液と混合し、NIH3T3細胞をCell-Tracker緑色溶液と混合します。細胞を37°Cおよび5%CO₂ で30分間インキュベートし、最適な細胞標識を確保します。8 mLの完全DMEM/F12培地をサンプルに加え、400 × g で5分間遠心分離します。
   注:Cell Trackerは、細胞の生存率と増殖に影響を与えることはできません。したがって、Cell-Trackerで染色された細胞は、コンフルエントするまで培養することができます。染色した細胞の蛍光強度は、培養後4〜5日で減少する可能性があります。
3. 手順5.3から5.6を繰り返します。
4. 共焦点顕微鏡で観察しながら、インサートウェルを24ウェルプレートから12ウェルプレートに移します。
   注:これにより、対物レンズと細胞の間の距離が最小限に抑えられ、細胞の形態を観察することが可能になります。

7. 3D共培養細胞の共焦点観察

注:PVA NMへの上皮細胞の接着は、PCL NMへの線維芽細胞のそれに比べて弱いです。ピペット吸引で古い培地を手動で廃棄し、新しい培地または溶液をウェルの壁にそっと加えます。染色中は、メンブレンを乾燥させないようにしてください。

注:細胞接着は、ラミニンをコーティングするか、またはインテグリン結合モチーフのペプチドをPVAナノファイバーに組み込むことによって改善することができる¹⁹。

1. インサートを新しい24ウェルプレートに移します。古い培地を捨て、4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液150μLを加えます。室温で15分間インキュベートします。
2. 4% PFA溶液を取り出し、付着した細胞を1x PBS150 μLで洗浄します。
3. ブロッキングおよび透過処理のために、150 μLの5%正常ヤギ血清と1x PBSで希釈した0.2% Triton X-100を加え、室温で30分間インキュベートします。
4. Alexa Fluor 594-conjugated anti-zona occludens Ab (1:400) と Phalloidin-iFlour 488 (1:1,000) を抗体希釈試薬で希釈して調製します。ブロッキング溶液を取り出し、1ウェルあたり150 μLの蛍光色素溶液を加え、室温で1時間インキュベートします。
   注:抗体溶液は結果の品質に直接影響するため、最高の精度で調製してください。光にさらされないようにしてください。
5. 抗体溶液を廃棄し、1x PBS150 μLで細胞を10分間洗浄します。
6. 1x PBS(1:1,000)で希釈したHoechst 33342 150 μLを加え、10分間インキュベートします。光にさらさないでください。
7. Hoechst 33342溶液を取り出し、接着した細胞を1x PBS150 μLで10分間洗浄します。
8. きれいなスライドガラスを準備し、正確な量の水性マウントゲルを追加します。先端が尖った鉗子を使用して、膜を周囲の端から繊細に剥がします。メンブレンを埋込ゲルに置き、細胞を含む側が上を向いていることを確認します。正確な量のマウンティングジェルを加え、カバースライドで覆います。スライドをマニキュアで密封し、正確で完全な密封を確保します。
9. 次のイメージング設定を使用して、共焦点顕微鏡下で細胞を観察します: レーザー出力制御:405強度10;レーザー出力制御:488強度10;レーザーパワーコントロール:561強度10;検出器感度:420LP(600値);検出器感度:525/50(700値);検出器感度:561LP(750値)。

8. ナノファイバーへの細胞接着のアッセイ

1. 古い培地を捨て、1x PBSの150μLで細胞を洗浄します。
2. 150 μLの3% GAを1x PBSで希釈し、室温で1時間細胞を固定します。
3. 150 μLの1x PBSで細胞を10分間で洗浄します。
4. 1x PBSで希釈した1%四酸化オスミウム(OsO₄)150 μLを1時間加えて、細胞を二次的に固定します。
   注意: OsO₄ とその蒸気は有害です。ヒュームフードで使用する必要があります。
5. 溶液を廃棄し、細胞を1x PBS300 μLで10 x 2分間洗浄します。
6. 50%、70%、90%、95%から100%までの等級付けされたエタノールで、各ステップで10分間、細胞を脱水します。最後の脱水ステップを実行するには、新鮮な100%エタノールを10分間加えます。
7. 細胞と膜を完全に風乾します。先端が尖った鉗子を使用してメンブレンを取り外し、両面タップを使用してメンブレンを試料ホルダーに置きます。イオンスパッタリングを5分間行い、SEMで細胞を2,000倍の倍率で観察します。

9. 細胞増殖アッセイ

注:このプロトコルでは、CCK-8アッセイを使用して、製造元の指示に従って細胞増殖速度を定量化します。

1. 予熱したDMEM/F12 9部(容量比)とCCK-8試薬1部を混合して、CCK-8混合物を調製します。古い培地を取り除いた後、150 μLのCCK-8混合物を細胞含有ウェルに加えます。
2. インサートを新しい24ウェルプレートに移し、細胞を含むボトムウェルから分離します。細胞を37°Cおよび5%CO₂で45分間インキュベートします。
3. 上清を採取し、1.5mLのチューブに移します。1,800 × g で3分間遠心分離します。
4. 微量遠心チューブから上清100μLを96ウェルプレートに加えます。450nmでの読み取り光学密度(OD)。

結果

このプロトコルは、ナノファイバー膜ベースの2層モデルを構築することにより、MLE-12肺上皮細胞とNIH3T3線維芽細胞を共培養するための重要なステップを概説しています(図1)。このモデルは、共培養細胞の生細胞イメージング、免疫組織化学、およびエンドポイント定量分析に適しています。他の細胞型も、細胞密度および増殖条件を最適化することによって利用することができる。

SEMは、ビード形成なしで作製されたPVAナノファイバーの均一な分布を示しています(図2A)。PVAナノファイバーの直径は、150nm〜230nm(180nm±25nm、平均±標準偏差(SD))の範囲でした。エレクトロスピニングPCL NM中のナノファイバーはランダムに配向しており、構造的にはコラーゲンに類似していました(図2B)。PCL NMのほとんどのファイバーの直径は300 nm〜7 μm(3.8 μ ± 2.5 μm)でした。したがって、PVAナノファイバーメンブレンは、PCLナノファイバーメンブレンよりも細孔サイズが小さかった。

播種前に、MLE-12細胞とNIH3T3細胞をそれぞれ赤と緑で染色し、共培養プロセス全体を通してモニターしました。 図3に示すように、インサートチャンバー内のMLE-12細胞と下部チャンバー内のNIH3T3細胞の空間分布がはっきりと観察できました。フォーカススタッキング解析により、NIH3T3細胞はさまざまな深さ(102±20μm)に分散して検出され、MLE-12細胞は80±10μmの厚さの層を形成したことが明らかになりました。NIH3T3細胞はPCLナノファイバー膜に浸潤してナノファイバー軸に沿って伸び、MLE-12細胞はPVAナノファイバー膜の表面に付着して凝集を示しました(図4)。次に、NIH3T3細胞とMLE-12細胞の細胞骨格組織をアクチン染色により調べました。PCLナノファイバーメンブレン上で培養したNIH3T3細胞は、組織中の細胞に似たアクチンフィラメントの飛翔体分布を示し、PVAナノファイバーメンブレン上で培養したMLE-12細胞のアクチン染色は、細胞の広がりのない丸い凝集体を示します(図5)。

単一培養と共培養におけるMLE-12細胞の分布と増殖パターンを比較しました。PVA NM上での単一培養でCell-Trackerの赤色染色細胞は凝集体を形成しましたが、共培養条件の細胞はメンブレン上に均一な分布を維持していました(図6A)。共焦点顕微鏡画像の3D解析では、PVA NM上の共培養MLE-12細胞の成長パターンは、線維芽細胞の非存在下で培養された細胞と比較して、よりコンフルエントな細胞密度で培養細胞の膜への層状接着を示しています(図6B)。さらに、細胞間接着および細胞表面上の帯状オクルージン(ZO)-1の発現(矢印が示されている)が、細胞凝集体では発現していないことが、線維芽細胞を含まない培養よりも共培養条件でより明白でした(図6C)。

膜上の細胞の増殖は、CCK-8アッセイを使用して測定しました。NIH3T3およびMLE-12細胞の増殖は時間とともに増加しました(図7)。しかし、細胞の増殖速度は、培養プレート上よりも膜上で観察されました(データは示していません)。NM上で共培養したNIH3T3およびMLE-12細胞は、培養プレート中の単一培養細胞と比較して安定した増殖速度を示します。

図1:スキャフォールドベースの2層システムでのNIH3T3線維芽細胞とMLE-12上皮細胞の共培養法を示す模式図。 略語:PVA =ポリビニルアルコール;PCL =ポリ(ε-カプロラクトン)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:PVAおよびPCLナノファイバーの構造 (A)PVAおよび(B)PCLナノファイバー膜は、エレクトロスピニングにより作製した。ナノファイバーの構造と直径は、膜表面のSEMによって測定されます。スケールバー = 1 μm (A)、10 μm (B)。略語:PVA =ポリビニルアルコール;PCL =ポリ(ε-カプロラクトン)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:共培養システムにおいて、PCLナノファイバー膜上のNIH3T3細胞とPVAナノファイバー膜上のMLE-12細胞の空間分布。NIH3T3細胞(4 × 10⁵)をCell-Tracker Greenで、MLE-12細胞(3 × 10⁵)をCell-Tracker Redで染色しました。播種した細胞を24時間培養し、共焦点顕微鏡のZスタッキング画像を用いて観察しました。数値はμmで示されます。矢印は、X(幅)、Y(長さ)、Z(奥行き)の寸法を示します。略語:PVA =ポリビニルアルコール;PCL =ポリ(ε-カプロラクトン)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:PCLナノファイバー膜上のNIH3T3細胞およびPVAナノファイバー膜上のMLE-12細胞の接着と形態。 細胞をメンブレン上で24時間培養し、SEMを用いて2,000倍の倍率で観察しました。スケールバー = 15 μm。略語:PVA =ポリビニルアルコール;PCL =ポリ(ε-カプロラクトン)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:PCLナノファイバー膜上のNIH3T3細胞およびPVAナノファイバー膜上のMLE-12細胞におけるアクチンストレスファイバー。 NIH3T3細胞(4×10⁵)およびMLE-12細胞(3 × 10⁵ 細胞)をそれぞれPCLおよびPVAナノファイバー膜上に播種した。48時間培養後、細胞をファロイジン-iFlour 488で染色し、共焦点顕微鏡を用いて観察しました。スケールバー = 50 μm。略語:PVA =ポリビニルアルコール;PCL =ポリ(ε-カプロラクトン);FITC = フルオレセインイソチオシアネート。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:PVAナノファイバー膜上での共培養MLE-12細胞の増殖パターン。 (A)Cell-Trackerの赤色染色MLE-12細胞(3×10⁵ 細胞)をPVAナノファイバー膜上に播種し、単独(-NIH3T3細胞)およびNIH3T3細胞を2層システム(+NIH3T3細胞)で48時間培養した(B)単一培養および共培養MLE-12細胞をHoechst 33342(青)およびPhalloidin-iFlour 488で染色し、共焦点顕微鏡で観察した。3D画像は、Imarisソフトウェアの表面機能を使用して表示されます。(C)MLE-12細胞を48時間培養し、Phalloidin-iFlour 488および抗ZO-1抗体(赤)で蛍光標識した。スケールバー = 50 μm。略語:PVA=ポリビニルアルコール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:2層共培養システムにおける細胞の増殖速度。 NIH3T3細胞(4×10、⁵)およびMLE-12細胞(3×10、⁵)を指定の時間共培養します。インサートウェルおよびボトムウェル内の細胞増殖は、CCK-8アッセイを用いて測定されます。データは平均± SD(n = 3)で表されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

2D培養モデルから3D培養モデルへの移行は、 in vitro 共培養モデルの開発における大きな進歩を表しています。3D培養モデルは、細胞が増殖、凝集、および分化できる組織微小環境を模倣する必要があります²²。スキャフォールドベースの3D共培養モデルを使用することで、組織構造の複製が強化されます。本研究では、NMベースのトランスウェルシステムにより、2種類の細胞を間接的に3D共培養します。下部チャンバーに大きな細孔を持つPCL NMは、細胞への浸潤を可能にし、間質マトリックスを模倣します。この足場は、線維芽細胞の成長と空間的組織をサポートします。上部チャンバーにPVAナノファイバーメンブレンを使用すると、層内にMLE-12上皮細胞を形成できます。PVAナノファイバー膜の直径および細孔サイズは、それを上皮細胞の接着および増殖を支持するための理想的な基質にしており、これは上皮組織の基底膜上の上皮細胞を模倣している¹⁹。

フィブロネクチンやラミニンなどの細胞接着タンパク質は、ECMの重要なタンパク質であり、細胞をコラーゲン線維と結合します²³。上皮細胞は、その表面上のインテグリン受容体を介してラミニンと相互作用する¹⁸。PVA NM上に播種されたMLE-12細胞は、メンブレンに付着し、3次元的に増殖しました。しかし、多孔質PVA NMへの上皮細胞の結合は低く、培養細胞と相互作用する特定の生物学的モチーフがないため、凝集してしまいました。私たちの共培養システムでは、NIH3T3細胞とMLE-12細胞の間の直接的な細胞間接触はなく、コミュニケーションはパラクリンシグナル伝達を介してのみ行われます。共培養されたNIH3T3細胞の存在は、培養期間を通じてMLE-12細胞の膜への付着を安定させる可能性があります。この安定化は、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、および種々の成長因子²⁴を含む線維芽細胞による可溶性因子の分泌に起因する可能性がある。これに対し、PCLナノファイバースキャフォールドで線維芽細胞とがん細胞を直接共培養する腫瘍モデルでは、線維芽細胞はマトリックスリモデリングを通じてECMの特性を変化させる²⁵。

上皮細胞は、成長支持体および選択的透過性層として機能する基底膜上にあります。オルガノイド技術を含むいくつかの技術戦略が現在開発されており、上皮組織の3D複雑モデルを作成するために²⁶。しかし、オルガノイド構造は、従来のアッセイの使用を妨げます²⁷。さらに、実験データ収集のための従来の顕微鏡法は、オルガノイドが3Dハイドロゲルマトリックスに埋め込まれた状態で培養されるという事実によって複雑である²⁷。本研究では、PVA NM上で培養した上皮細胞の精密な観察を容易にするために、インサートチャンバーをローチャンバーから分離しました。さらに、3Dオルガノイドは幹細胞の分化によって生成されます。このように、幹細胞の培養は、共培養系に比べて長い時間がかかり、複雑な手順であり、オルガノイドの不均一性が報告されている²⁸。

上皮細胞と線維芽細胞の共培養は、単一培養と比較して、足場への接着性を向上させ、培養上皮細胞の安定した増殖と機能を維持します。さらに、成長因子やサイトカインなどの補助材料は、共培養した線維芽細胞から分泌される可溶性因子のため、培地には必要ありません。構造的支持を提供することにより、細胞共培養においてナノファイバースキャフォールドを使用することの利点にもかかわらず、生体適合性ヒドロゲル²⁹と比較して、細胞を囲むECMを提供することはできない。したがって、この制限は、重層化されたハイドロゲルを備えたNM上の細胞を使用して達成できます。

結論として、線維芽細胞と上皮細胞を同時に培養するためのシンプルなインサート共培養システムは、上皮組織の再生、腫瘍微小環境、毒性アッセイ、薬物活性試験など、さまざまな生理学的および薬理学的状況で重要です。ナノファイバー膜ベースの3D共培養システムは、ハイスループットの薬物吸収および輸送スクリーニング研究のために機器化および設計されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.05% トリプシン/EDTA	Welgene	LS015-01
100x ペニシリン/ストレプトマイシン	Gibco	10378016
20x PBS	LPS solution	CBP007A
4% パラホルムアルデヒド	Biosesang	PC2031-050-00
Alexa Fluor-594 標識 ZO-1 抗体	Invitrogen	339194
抗体希釈剤OP Quanto	Epredia	10129-576
CCK-8 assay kit	Donginbio	CCK-3000
Cell culture dish (150x20)	SPL	20151
CellTracker Green CMFDA	Invitrogen	C7025
CellTracker Red CMTPX	Invitrogen	C34552
Chloroform	Samchun	C0584
円錐管	SPL	50050
カバーガラス	コーニング	CLS2980245
DMEM 高グルコース	Welgene	LM001-05
DMEM/F12	Welgene	LM 002-05
DURAN デシケーターベース、平面フランジ、ねじ山付き	DWK Life Sciences	7.022 260
DURANガラスデシケーター蓋&ストップコック	ダイハンサイエンス	SM.2444061
DURANストップコック PTFEスピンドル付	DWKライフサイエンス
エレクトロスピニングマシン	ナノNC	ESR200RD
エチルアルコール ピュア	シグマ アルドリッチ	459844
FBS	シグマ アルドリッチ	TMS-013-BKR
蛍光レーザー共焦点スキャナーモジュール K1-fluo	ナノスコープシステム
ゲル/マウント	Biomeda Corp.	M01
グルタルアルデヒド溶液	Sigma Aldrich	340855
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399
金属ノズル 27G	NanoNC
マニキュア ネイチャー	リパブリック
ノーマルヤギ血清	ベクターラボラトリーズ	S-1000
四酸化オスミウム	Sigma Aldrich	201030
Phalloidin-iFlour 488	abcam	ab176753
プラスチックSyringe_Lureロック (10 mL)	HENKE SASS WOLF	AL10
ポリ(アクリル酸)	Sigma Aldrich	323667
Poly(ビニルアルコール)	Sigma Aldrich	341584
Polycaprolactone	Sigma Aldrich	440744
PureHCL	Duksan	1129
走査型電子顕微鏡	SEC	SNE-4500M
スライドガラス	マリエンフェルド スーペリア	K15663717
シルガード 184 セット	全知	OMNI.05255
シナジー H1 マルチモード リーダー	Biotek
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100