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方法論記事

ナノファイバー膜を用いた上皮細胞の三次元共培養モジュールの確立

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DOI:

10.3791/67780

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2024年12月27日

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, School of Medicine, Ajou University, 2Department of Medical Sciences, The Graduate School, Ajou University, 33D Immune System Imaging Core Center, Ajou University

この記事について

サマリー

ここでは、ナノファイバー膜ベースの2層システムで線維芽細胞を培養した上皮細胞が、膜に安定して付着して増殖する様子を示します。

要約

上皮細胞の培養における技術的なハードルには、脱分化や機能の喪失などがあります。バイオミメティック3次元(3D)細胞培養法は、細胞培養の効率を高めることができます。本研究では、3次元環境下で線維芽細胞を培養し、上皮細胞を組織様層として培養することを目的とした先進的な2層培養システムを紹介する。ポリビニルアルコール(PVA)およびポリ(ε-カプロラクトン)(PCL)ナノ繊維膜(NM)は、エレクトロスピニングによって作製され、それぞれ上皮細胞および線維芽細胞の培養に生理学的に関連する細胞外マトリックスとして利用されました。上部インサートウェルでは、肺上皮細胞をPVA NMで培養し、下部チャンバーでは、線維芽細胞をPCL NMで培養しました。この構成により、細胞間直接の接触が排除され、可溶性因子によって媒介されるパラクリンシグナル伝達の検査が容易になります。共焦点顕微鏡法を用いて、上皮細胞の閉塞帯を含む細胞内タンパク質の分布、成長パターン、および発現を解析しました。Zスタッキング技術により、詳細な3D再構成が可能になり、上皮層内のタイトジャンクションと空間構成の完全性に関する正確な洞察が得られました。走査型電子顕微鏡(SEM)は、ナノファイバー膜上の細胞タイプの形態学的特性を評価しました。SEMイメージングにより、複雑な細胞表面構造とナノファイバーとの相互作用が明らかになり、細胞構造とナノファイバー構造との細胞相互作用に関する包括的な視点が得られました。Cell Counting Kit-8(CCK-8)アッセイは、上皮細胞および線維芽細胞の増殖速度を経時的に測定するための簡単な方法です。これは、これらの細胞を共培養することによる増殖挙動と潜在的な相乗効果を提供します。これらの知見は、上皮組織の再生、内皮細胞、免疫細胞、その他の間質細胞による腫瘍微小環境、毒性アッセイ、薬物活性試験など、さまざまな生理学的および薬理学的状況で重要な、線維芽細胞と上皮細胞の同時培養のための単純なインサート共培養システムの有効性を強調しています。

概要

何十年にもわたって、古典的な二次元(2D)単層培養は、感染症、薬理学、毒物学を理解するために不可欠でした1,2。ただし、組織微小環境の複雑さ、マルチコンポジション間の動的相互作用、および3次元(3D)アーキテクチャを考慮することが重要です。したがって、2D細胞培養は、組織様構造を模倣することに限界がある3,4。例えば、細胞間および細胞間マトリックス(ECM)シグナル伝達が欠如しており、これは生体内微小環境における細胞分化、増殖、細胞機能に不可欠です。これらの理由から、3D細胞培養のシステムが開発されてきました5。3D培養中の細胞は、周囲の細胞外マトリックスと3次元で増殖し、相互作用します。さらに、単純な単一細胞タイプのin vitroモデルとin vivoで発生する動的な細胞相互作用との間のギャップを埋めるために、複数の細胞タイプで構成される3D共培養アプローチが開発されました6。3D共培養システムは、細胞間コミュニケーションおよび細胞-細胞外マトリックス(ECM)相互作用の研究で人気を博しています7,8,9,10。現在の3D共培養システムにはいくつかの形態があり、直接共培養と間接共培養に分けることができる8,9。直接共培養では、培養細胞のさまざまな細胞機能が、パラクリン効果ではなく直接接触によって主に影響を受ける可能性があります。これに対し、間接共培養は、バリアや層を使用して異なる細胞タイプを分離することにより、パラクリンの相互作用を研究する上でより大きな利点があります。

生体適合性および生分解性物質10を用いてECMを模倣した生体模倣スキャフォールドを作製するために、種々の材料および方法が利用されている。ナノファイバー状の足場構造は、生体組織における天然ECMの形状を模倣し、細胞培養のための3D構造を提供する11,12。エレクトロスピニングナノファイバー膜(NM)は、異なる種類の細胞の直接的および間接的な共培養に使用されてきた13,14,15。

上皮細胞は主要な器官の物理的障壁を形成しますが、線維芽細胞はECMリモデリングを媒介し、隣接する上皮を調節する主要な間質細胞です6,16,17。上皮細胞および線維芽細胞は、細胞表面上のインテグリン受容体を介して、それぞれ基底膜のラミニンおよび間質マトリックスのフィブロネクチンと相互作用する18。直径150-250nmのポリ(ビニルアルコール)(PVA)NMと微細孔で上皮細胞を培養すると、細胞凝集体やスフェロイドの代わりに多層を形成し、その増殖パターンは上皮組織の細胞と類似している19。これに対し、直径400-1,500 nmおよび10-50 μmの微細孔を有するポリ(カプロラクトン)(PCL) NMは、培養線維芽細胞の増殖のための間質マトリックスと同様の空間的次元を提供する13,14。PVAおよびPCLメンブレンは、その生体適合性により、組織工学で一般的に使用されるポリマーです20,21。

本研究では、多孔質エレクトロスピニングNMを用いて、上皮細胞を組織状層として、また3次元構造内の線維芽細胞として培養する先進的な2層培養システムを紹介します。このプロトコールは、ナノファイバーの作製、ファイバーの架橋後および品質評価、膜付着培養ウェルの調製、細胞播種および3D共培養、3D培養細胞のアッセイの5つの主要な段階に分けることができます。

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プロトコル

1. 水安定性PVAナノファイバーの作製

  1. ポリアクリル酸(PAA)0.02gとPVA1gを秤量し、磁気バーが入ったきれいなガラス瓶に入れます。ボトルに7.8mLの蒸留水を加え、ボトルをプレートスターラーに置き、温度を84°C、速度を500rpm、時間を12時間に設定します。
  2. ボトルを室温まで冷ましてから、0.2 mLのグルタルアルデヒド(GA)を加えます。ボトルをプレートスターラーに置き、速度を500rpm、時間を30分、温度を室温に設定します。
  3. エレクトロスピニングには5mLのシリンジを使用し、プランジャーをバレルから分離し、バレル内とプランジャーの先端の小さなプラスチックの破片を清掃します。
  4. 針を使用して液体の流れを遮断し、PVA溶液を各バレルに注ぎます(容量:各2.5〜3 mL)。プランジャーを組み立ててから、針を取り外します。
    注:溶液に気泡がある可能性があるため、気泡が消えるまで待ちます。これには10〜30分かかります。
  5. 新しい27Gの金属針を組み立て、エレクトロスピニングマシンに入れます。
  6. コレクターをホイルでしっかりと包みます。
  7. インジェクターパネルを元の位置に戻します。機械には次の設定を使用します:(各ポンプ)注入量:2 mL、注入速度:6 μL / min、ローラー速度:100 rpm、チップからコレクターまでの距離:14 cm。各ポンプの液体の流れを確認してください。
  8. 約12kVの電位で機械を運転します。
  9. プロセスの最初に湿度が40〜50%、プロセスの終了時に25〜30%であることを確認してください。湿度が下がるときに加湿器を使用し、エレクトロスピニングの前日に蒸留水が入った皿を機械の中に入れて湿度を上げます。
    注:これは、PVAナノファイバーの作製を成功させるための重要な要素です。
  10. フローを定期的に確認してください。針が詰まっている場合は、機械を一時的に停止してください。実験室のワイプを使用してドロップを取り除き、新しいドロップが表示されるまで待ちます。そうでない場合は、針を交換してから、マシンの実行を続けます。
  11. PVAナノファイバーの製造プロセスは、完了するまでに~6時間かかります。エレクトロスピニングプロセスが終了したら、ファイバーマットを含むホイルをコレクターから取り外し、ナノファイバーマットを真空下で乾燥剤で保管します。

2. 塩酸(HCl)蒸気によるPVAナノファイバー膜の処理と繊維品質評価

注:PVA NMsの水安定性は、HCl蒸気による架橋後反応後も良好に維持されます。PVAは非常に親水性のポリマーであり、エレクトロスピニングPVAナノファイバーは水との接触や湿度の高い条件下では不安定です。PVA NMは、PVAポリマーの製造直後にHCl蒸気で処理する必要があります。

  1. ナノファイバーマットをトランスウェルインサートに必要なサイズにカットします。
  2. 純粋なHCl1.5mLが入った小さな皿を用意し、HClを含む皿とナノファイバー片を真空チャンバーに入れ、蓋を閉めます。
    注:HCl蒸気は、ナノファイバーを水に安定させるための架橋後剤として使用されます。
  3. 真空ポンプに接続されているバルブを開き、HClヒュームが上昇するまで10秒待ってから、バルブを閉じます。メンブレンをHClヒュームで2分間処理します。
  4. HCl蒸気で処理した後、メンブレンに蒸留水(DW)を数滴加え、スライドガラスに載せて、メンブレンをホイルから取り除きます。20分間風乾した後、メンブレンは自然にスライドにくっつきます。
  5. カーボンテープにオートスパッタコーターを使用して、メンブレンを金の薄層でコーティングします。走査型電子顕微鏡(SEM)画像を取得します。
  6. PVA NMをHClと架橋した後、1x PBSで3回洗浄し、培地に浸した後でpHをチェックしてHClが残っていないことを確認します。

3. PCLナノファイバーの作製とナノファイバー品質評価

  1. PCL1.5gを秤量し、きれいなガラス瓶に加えます。ボトルに8.5mLのクロロホルムを加え、プレートスターラーにボトルを載せ、PCLをクロロホルムに室温で12時間溶解します。
  2. 手順1.7と1.8を除き、手順1.3から1.9を繰り返し、注入速度を8μL/min、電圧を17.5kVに設定します。
    注:PCLの作製には、完成までに~3.5時間かかります。
  3. メンブレンの小片をカットし、自動スパッタリングプロセスで5分間コーティングします。SEM画像を取得します。

4. トランスウェル内での2層のメンブレンの組み立て

注:このプロトコルでは、24ウェルプレートとそれに対応するインサートウェルを使用します。PVA NMはインサートウェルに取り付けられ、PCL NMはボトムウェルに取り付けられています。

  1. ナノファイバーマットを丸くカットし、PVAとPCL NMにそれぞれ直径10mmと13mmの直径にします。
  2. ポリジメチルシロキサン(PDMS)シルガード184を接着剤として使用して、メンブレンをインサートとチャンバーウェルに接着します。使用する前に、Sylgard 184ベース(パートA)と硬化剤(パートB)をプラスチックカップに10:1の質量比で混合します。きれいなスライドガラスを使用して、混合物全体が気泡で満たされるまで、PDMS溶液を2〜3分間激しく混合します。泡が形成されて10分間消えてから使用してください。その間、滑り台を100°Cまで温めます。
  3. PDMSをスライドガラス上に広げ、インサートの下端をPDMSに少し浸します。スライドウォーマーでインサートを逆さまにして、PDMSが硬化します(10~15分)。200 μLのチップでPDMSがべたつかないか注意深く確認してください。
  4. PVA NMピースは、手順2.2から2.4の説明に従って取り扱います。
  5. インサートの底がメンブレンピースのナノファイバー側によく向くように、インサートをPVA NMピースにしっかりと押し付けます。井戸の中央に蒸留水を一滴加え、鉗子を使用してホイルを取り除きます。インサートを新しい24ウェルプレートにしっかりと入れ、メンブレンを乾かします。
  6. PCL NMピースをボトムウェルに取り付けるときは、必ず200 μLのチップをPDMS混合物に浸し、四隅と中央に正確に点在させてください。
  7. プレートをスライドウォーマーに置き、PDMSを5〜7分間硬化させて、アセンブリの品質を確保します。
  8. PCL NMピースをPDMS含有ウェルに入れ、メンブレンのナノファイバー側をPDMSに接着します。小さなきれいなブラシを使用して、メンブレンピースのホイル側を少し押して、完全に取り付けます。0.2 mLの70%エタノールをウェルに加えると、ホイルを簡単に取り除きます。
  9. トランスウェルセットアップのインサートとボトムウェルをUVライトで一晩滅菌します。
    注:混合PDMSは、さらに使用するために-20°Cで保存できます。注意:PCLナノファイバー膜付属プレートは乾燥して保管できますが、使用前に70%エタノールで濡らす必要があります。
  10. 翌日、1x リン酸緩衝生理食塩水(PBS)をそれぞれ200 μLと500 μLを加えて、インサートと底をよく洗浄します。インサートとボトムウェルはすぐに使用できます。

5. 共培養モデルのための細胞播種と2層の組み立て

注:MLE-12細胞は、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質を含む1x Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)/F12で培養しました。NIH3T3細胞を、10%FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシン系抗生物質を含む1x DMEM高グルコースで培養しました。

  1. 細胞を150 mmの培養皿に保持します。70〜80%がコンフルエントになったら、1x PBS10 mLで細胞を洗浄し、予熱した0.05%トリプシン/EDTA溶液2 mLで37°Cで3分間トリプシン化します。
  2. 皿を軽くたたいて細胞を底から取り除き、各タイプの細胞に8 mLの完全培地を加えてトリプシン酵素を中和します。細胞懸濁液を50mLの遠心チューブに移し、400 × g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。Cell-Trackerで細胞を染色し、NM上の播種細胞の分布を観察します(詳細についてはセクション6を参照)。
  3. 細胞ペレットを5 mLの完全DMEM/F12培地に再懸濁します。細胞番号を決定し、6 × 106 MLE-12 細胞/mL および 8 × 105 NIH3T3 細胞/mL に調整します。
    注:完全なDMEM/F12培地は、MLE-12およびNIH3T3細胞との共培養に使用されます。
  4. ボトムウェルに500 μLの完全DMEM/F12培地(PCLを含まないウェル)を充填します。PVAナノファイバー膜付着インサートをトランスウェルに移し、MLE-12細胞懸濁液50μLを添加します。細胞を37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。
  5. 同時に、PCLナノファイバー膜接着ボトムウェルに500μLのNIH3T3細胞懸濁液を充填し、細胞を37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。
  6. 2時間後、トランスウェルセットアップでMLE-12細胞含有インサートとNIH3T3細胞含有ボトムウェルを組み立てます。これは、MLE-12細胞を上層、NIH3T3細胞を下層とする共培養モデルです。2層構造のメンブレンで細胞を所望の時間共培養します。

6. 細胞分布アッセイ

  1. 5 μMのCell-Tracker赤および緑溶液を、合計2 mLの完全DMEM/F12培地に調製します。
  2. トリプシン処理後、MLE-12細胞をあらかじめ調製したCell-Tracker赤色溶液と混合し、NIH3T3細胞をCell-Tracker緑色溶液と混合します。細胞を37°Cおよび5%CO2 で30分間インキュベートし、最適な細胞標識を確保します。8 mLの完全DMEM/F12培地をサンプルに加え、400 × g で5分間遠心分離します。
    注:Cell Trackerは、細胞の生存率と増殖に影響を与えることはできません。したがって、Cell-Trackerで染色された細胞は、コンフルエントするまで培養することができます。染色した細胞の蛍光強度は、培養後4〜5日で減少する可能性があります。
  3. 手順5.3から5.6を繰り返します。
  4. 共焦点顕微鏡で観察しながら、インサートウェルを24ウェルプレートから12ウェルプレートに移します。
    注:これにより、対物レンズと細胞の間の距離が最小限に抑えられ、細胞の形態を観察することが可能になります。

7. 3D共培養細胞の共焦点観察

注:PVA NMへの上皮細胞の接着は、PCL NMへの線維芽細胞のそれに比べて弱いです。ピペット吸引で古い培地を手動で廃棄し、新しい培地または溶液をウェルの壁にそっと加えます。染色中は、メンブレンを乾燥させないようにしてください。

注:細胞接着は、ラミニンをコーティングするか、またはインテグリン結合モチーフのペプチドをPVAナノファイバーに組み込むことによって改善することができる19。

  1. インサートを新しい24ウェルプレートに移します。古い培地を捨て、4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液150μLを加えます。室温で15分間インキュベートします。
  2. 4% PFA溶液を取り出し、付着した細胞を1x PBS150 μLで洗浄します。
  3. ブロッキングおよび透過処理のために、150 μLの5%正常ヤギ血清と1x PBSで希釈した0.2% Triton X-100を加え、室温で30分間インキュベートします。
  4. Alexa Fluor 594-conjugated anti-zona occludens Ab (1:400) と Phalloidin-iFlour 488 (1:1,000) を抗体希釈試薬で希釈して調製します。ブロッキング溶液を取り出し、1ウェルあたり150 μLの蛍光色素溶液を加え、室温で1時間インキュベートします。
    注:抗体溶液は結果の品質に直接影響するため、最高の精度で調製してください。光にさらされないようにしてください。
  5. 抗体溶液を廃棄し、1x PBS150 μLで細胞を10分間洗浄します。
  6. 1x PBS(1:1,000)で希釈したHoechst 33342 150 μLを加え、10分間インキュベートします。光にさらさないでください。
  7. Hoechst 33342溶液を取り出し、接着した細胞を1x PBS150 μLで10分間洗浄します。
  8. きれいなスライドガラスを準備し、正確な量の水性マウントゲルを追加します。先端が尖った鉗子を使用して、膜を周囲の端から繊細に剥がします。メンブレンを埋込ゲルに置き、細胞を含む側が上を向いていることを確認します。正確な量のマウンティングジェルを加え、カバースライドで覆います。スライドをマニキュアで密封し、正確で完全な密封を確保します。
  9. 次のイメージング設定を使用して、共焦点顕微鏡下で細胞を観察します: レーザー出力制御:405強度10;レーザー出力制御:488強度10;レーザーパワーコントロール:561強度10;検出器感度:420LP(600値);検出器感度:525/50(700値);検出器感度:561LP(750値)。

8. ナノファイバーへの細胞接着のアッセイ

  1. 古い培地を捨て、1x PBSの150μLで細胞を洗浄します。
  2. 150 μLの3% GAを1x PBSで希釈し、室温で1時間細胞を固定します。
  3. 150 μLの1x PBSで細胞を10分間で洗浄します。
  4. 1x PBSで希釈した1%四酸化オスミウム(OsO4)150 μLを1時間加えて、細胞を二次的に固定します。
    注意: OsO4 とその蒸気は有害です。ヒュームフードで使用する必要があります。
  5. 溶液を廃棄し、細胞を1x PBS300 μLで10 x 2分間洗浄します。
  6. 50%、70%、90%、95%から100%までの等級付けされたエタノールで、各ステップで10分間、細胞を脱水します。最後の脱水ステップを実行するには、新鮮な100%エタノールを10分間加えます。
  7. 細胞と膜を完全に風乾します。先端が尖った鉗子を使用してメンブレンを取り外し、両面タップを使用してメンブレンを試料ホルダーに置きます。イオンスパッタリングを5分間行い、SEMで細胞を2,000倍の倍率で観察します。

9. 細胞増殖アッセイ

注:このプロトコルでは、CCK-8アッセイを使用して、製造元の指示に従って細胞増殖速度を定量化します。

  1. 予熱したDMEM/F12 9部(容量比)とCCK-8試薬1部を混合して、CCK-8混合物を調製します。古い培地を取り除いた後、150 μLのCCK-8混合物を細胞含有ウェルに加えます。
  2. インサートを新しい24ウェルプレートに移し、細胞を含むボトムウェルから分離します。細胞を37°Cおよび5%CO2で45分間インキュベートします。
  3. 上清を採取し、1.5mLのチューブに移します。1,800 × g で3分間遠心分離します。
  4. 微量遠心チューブから上清100μLを96ウェルプレートに加えます。450nmでの読み取り光学密度(OD)。

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結果

このプロトコルは、ナノファイバー膜ベースの2層モデルを構築することにより、MLE-12肺上皮細胞とNIH3T3線維芽細胞を共培養するための重要なステップを概説しています(図1)。このモデルは、共培養細胞の生細胞イメージング、免疫組織化学、およびエンドポイント定量分析に適しています。他の細胞型も、細胞密度および増殖条件を最適化することによって利用することができる。

SEMは、ビード形成なしで作製されたPVAナノファイバーの均一な分布を示しています(図2A)。PVAナノファイバーの直径は、150nm〜230nm(180nm±25nm、平均±標準偏差(SD))の範囲でした。エレクトロスピニングPCL NM中のナノファイバーはランダムに配向しており、構造的にはコラーゲンに類似していました(図2B)。PCL NMのほとんどのファイバーの直径は300 nm〜7 μm(3.8 μ ± 2.5 μm)でした。したがって、...

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ディスカッション

2D培養モデルから3D培養モデルへの移行は、 in vitro 共培養モデルの開発における大きな進歩を表しています。3D培養モデルは、細胞が増殖、凝集、および分化できる組織微小環境を模倣する必要があります22。スキャフォールドベースの3D共培養モデルを使用することで、組織構造の複製が強化されます。本研究では、NMベースのトランスウェルシステムにより、2種類の細胞を間接的に3D共培養します。下部チャンバーに大きな細孔を持つPCL NMは、細胞への浸潤を可能にし、間質マトリックスを模倣します。この足場は、線維芽細胞の成長と空間的組織をサポートします。上部チャンバーにPVAナノファイバーメンブレンを使用すると、層内にMLE-12上皮細胞を形成できます。PVAナノファイバー膜の直径および細孔サイズは、それを上皮細胞の接着および増殖を支持するための理想的な基質にしており、これは上皮組織の基底膜上の上皮細胞を模倣している19。

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開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、韓国保健福祉部(HR16C0001)が資金提供する韓国健康産業開発院(KHIDI)を通じた韓国医療技術研究開発プロジェクトからの助成金によって支援されました。教育部の資金提供による韓国基礎科学院(国立研究施設設備センター)の助成金による基礎科学研究能力強化プロジェクト(2019R1A6C1010003)。韓国政府(MSIT)の資金提供を受けた韓国国立研究財団(NRF)の助成金(2022R1A4A5032702)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.05% トリプシン/EDTAWelgeneLS015-01
100x ペニシリン/ストレプトマイシンGibco10378016
20x PBSLPS solutionCBP007A
4% パラホルムアルデヒドBiosesangPC2031-050-00
Alexa Fluor-594 標識 ZO-1 抗体Invitrogen339194
抗体希釈剤OP QuantoEpredia10129-576
CCK-8 assay kitDonginbioCCK-3000
Cell culture dish (150x20)SPL20151
CellTracker Green CMFDAInvitrogenC7025
CellTracker Red CMTPXInvitrogenC34552
ChloroformSamchunC0584
円錐管SPL50050
カバーガラスコーニングCLS2980245
DMEM 高グルコースWelgeneLM001-05
DMEM/F12WelgeneLM 002-05
DURAN デシケーターベース、平面フランジ、ねじ山付きDWK Life Sciences 7.022 260
DURANガラスデシケーター蓋&ストップコックダイハンサイエンスSM.2444061
DURANストップコック PTFEスピンドル付DWKライフサイエンス 
エレクトロスピニングマシンナノNCESR200RD
エチルアルコール ピュアシグマ アルドリッチ459844
FBSシグマ アルドリッチTMS-013-BKR 
蛍光レーザー共焦点スキャナーモジュール K1-fluoナノスコープシステム
ゲル/マウントBiomeda Corp.M01
グルタルアルデヒド溶液Sigma Aldrich340855
Hoechst 33342InvitrogenH1399
金属ノズル 27GNanoNC
マニキュア ネイチャーリパブリック
ノーマルヤギ血清ベクターラボラトリーズS-1000
四酸化オスミウムSigma Aldrich201030
Phalloidin-iFlour 488abcamab176753
プラスチックSyringe_Lureロック (10 mL)HENKE SASS WOLFAL10
ポリ(アクリル酸)Sigma Aldrich323667
Poly(ビニルアルコール)Sigma Aldrich341584
PolycaprolactoneSigma Aldrich440744
PureHCLDuksan1129
走査型電子顕微鏡SECSNE-4500M
スライドガラスマリエンフェルド スーペリアK15663717
シルガード 184 セット全知OMNI.05255
シナジー H1 マルチモード リーダーBiotek
Triton X-100Sigma AldrichX100
10322671

参考文献

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