くも膜下出血の血管内穿孔マウスモデルの簡易手術

サマリー

ここでは、くも膜下出血の血管内穿孔マウスモデルの簡略化された手術と神経学的スコアリングを紹介します。

要約

血管内穿孔モデルは、実験的研究でくも膜下出血(SAH)をシミュレートする方法として一般的に利用されています。それなりに包括的で信頼性が高い一方で、複雑な技術が必要です。このプロトコルは、神経学的スコアリングと組み合わせて、モデルをある程度詳細に簡略化します。ナイロン縫合糸を使用して総頸動脈(CCA)をループさせて引っ張り、従来の結紮術以外の一時的に血流を遮断しますが、これは明確な術野を提供します。電気焼灼ペンを使用して血管を融合すると、出血のリスクが軽減されます。また、穿刺の深さを判断しやすいように、黒いマークのついたフィラメントを使用しています。

総頸動脈(CCA)が内頸動脈(ICA)に分岐し、抵抗が最小限に抑えられる頸動脈分岐部を越えて黒マーカーが妨げられることなく前進していることは、フィラメントが前大脳動脈(ACA)と中大脳動脈(MCA)の頭蓋内接合部に正常に横断したことを示しています。この現象は、フィラメントが重要な脳血管収束点に位置することを意味します。次に、フィラメントをわずかに前方に進めて血管に穿刺すると、マウスの血管内穿孔の操作が容易になり、遺伝子改変マウスへの血管内穿孔モデルの適用が容易になります。これは、分子研究や医薬品の研究開発にとって非常に重要なことです。

概要

くも膜下出血(SAH)は、脳卒中の重篤な亜型であり、特に50代半ばの人々に影響を及ぼし、高い罹患率と死亡率に関連しています。自然発性 SAH は、主にウィリス ^1,2 の円で発生する頭蓋内動脈瘤の破裂によって引き起こされます。臨床的には、患者はしばしば雷鳴のような頭痛、神経機能障害、および意識の急速な低下を呈します³。ニューロクリティカルケアの進歩にもかかわらず、患者の約40%が出血後1か月以内に死亡します⁴。動脈瘤性SAHの後には、いくつかの二次合併症が発生する可能性があり、進行性の神経学的悪化につながります。しかし、SAHの病態生理学および臨床的特徴はまだ十分に理解されていません。

したがって、根本的なメカニズムをよりよく理解し、治療戦略を改善するためには、小動物における包括的で信頼性の高いモデルが不可欠です。今日まで、SAHモデルを確立するための数多くのプロトコルが提唱されてきました。たとえば、1つのアプローチでは、大槽に自家血液を注入します。別の変更されたプロトコルでは、2 つの別々の注射が必要であり、1 つは大槽に、もう 1 つは視交叉槽に注入されます。自家血液注射は、その技術的単純さと良好な死亡率^5,6により、広く採用されています。より小さく、より安価な実験動物を使用する可能性を達成するために、Barryらは、頭蓋骨⁷を除去した後にタングステン微小電極で脳底動脈を穿刺することを含む、1979年にラットでの最初のSAHモデルを記載しました。

1995 年には、脳虚血の Zea-Longa モデルの修正版である別の血管内穿孔モデルが発表され、その現在の形は後に SAH⁸ の研究に最も一般的に使用されるモデルであることが証明されました。以前の研究では、マウスとヒトは、ウィリスの円と呼ばれる同様の頭蓋内血管構造を持っており、頭蓋内動脈瘤が主に発生することが示されています⁹。この非開頭術法は、精密なICA分岐穿孔¹⁰を通じてヒトの動脈瘤破裂メカニズムを再現します。さらに、遺伝子改変マウスは分子メカニズムの研究に頻繁に使用されます。しかし、小動物ではその複雑な技術のために、血管内穿孔モデルは主にラットやウサギで利用されていますが、マウスでの適用は比較的一般的ではありません。したがって、血管内穿孔マウスモデルを単純化し、その高い死亡率を減らすことは非常に重要です。

ここでは、血管内穿孔マウスモデルの簡略化された修正を示し、ガルシア神経学的評価尺度¹¹の修正版を統合します。私たちの修正は、SAHの将来の実験的研究のための簡単で便利で信頼性の高いモデルを提供します。

プロトコル

C57BL/6雄マウス(6-8週齢)は、特定の病原体を含まない動物施設で、温度と順応条件が調整された動物施設で飼育され、12時間の明暗サイクルで維持されました。マウスには、標準的なげっ歯類の食事と滅菌された水道水への無制限のアクセスが提供されました。実験開始前に2週間の順応期間が認められました。動物が関わるすべての手続きは、龍華病院の動物倫理委員会によって承認され、中国国家科学技術委員会の実験動物の世話と使用に関するガイドラインに従って実施されました。

1.動物の調理

1. マウスを37°Cに予熱した加熱パッドに置き、手術が完了するまでこの温度を維持し続けます。
2. 2〜2.5%イソフルランを吸入してマウスに麻酔をかけます。0.4〜0.6 L / minの流量で操作中に1〜1.5%イソフルランで維持します。
3. マウスを手術台に置き、頭を安定させ、仰臥位に保ち、手足をテープで固定します。

2. SAH誘導

1. 前頸部の中央に沿ってハサミで皮膚を切開します(図1A)。
2. 結合組織を解剖し、左総頸動脈(CCA)とその分岐部を露出させます。
   注:迷走神経と隣接する腺を慎重に保護します(図1B)。
3. CCAを6-0ナイロン縫合糸でループし、結紮せずに両端を空けておきます(図1C)。
4. 縫合糸の両端をテープに接続し、縫合糸を水平面に対して45°の角度でゆっくりと下および右に引っ張ります。テープを手術台に固定して、CCAを一時的にブロックします(図1D)。
   注:閉塞した血管内の血流が糸状になると、閉塞が成功したことを示します。
5. ナイロン縫合糸で外頸動脈(ECA)を結紮します(図1E)。
   注:焼灼部位は、頸動脈分岐部から約2 mmの長さで、できるだけ上端に近づける必要があります。
6. ECAを遠位の結紮部位に融合させます 電気焼灼ペン(図1F)。
7. 内頸動脈(ICA)が露出するまで、ECAをゆっくりと下に引き下げます。ECAとICAを直線に合わせ、次の手順の適切な位置を確保します(図1G)。
8. フィラメントの上部をシャープにします。フィラメントのマークポイントは、上から8mmの位置にあります。
9. ECAにフィラメントを挿入するためのハサミで小さな切開を行います。一対の鉗子を使用してフィラメントを挿入します(図1H)。
10. ブラックマークがCCAとICAの分岐部を完全に通過するまで、鉗子でフィラメントを慎重に進めます。血管を穿刺するためにわずかに2 mm前進します(図1I)。
    注:大きな抵抗が感じられ、これは前大脳動脈(ACA)-中大脳動脈(MCA)の分岐に達したことを示しています。
11. ミシン目直後にフィラメントを引っ込めます。
12. 電気焼灼ペンを使用してECAを融合します(図1J)。
13. テープをはがし、CCAのナイロン縫合糸を引っ張り出して血流を回復させます。CCA の明らかな脈動を観察します(図 1K)。
14. 5-0吸収性縫合糸で首の切開を閉じます。

3.偽のグループ

1. 偽群では、フィラメントがICAで部分的に前進し、穿刺せずに引き抜かれる点を除いて、同じ外科手術を行う¹²。

4. 実験終了

1. 手術後 24 時間で、菅原ら ¹¹ (元の Garcia et ^al.13 から) によって報告されたスコアリング システムの修正版に従って、神経学的パフォーマンスを評価します。次の6つの評価を盲検化して実行します:自発的な活動、すべての手足の動き、前肢の動き、ワイヤーケージの壁を登る、体幹の両側に触れることへの反応、および振動刺激に対する反応。行動スコアリングテーブル(表1)を使用して神経機能を評価します。
2. 吸入したイソフルランでマウスを麻酔します。マウスを仰臥位に置き、テープで手術台に固定し、手足を固定します。次に、ハサミを使って腹部の正中線に沿って切開を行い、腹壁を切開して胸腔を露出させます。胸骨を丁寧に切って心臓を露出させます。
3. 注入針を左心室に慎重に挿入し、針が安定していて心臓を貫通しないようにします。
4. 予冷した1x PBS(4°C)で適切な流速(約10 mL/分)で灌流を開始し、流出する液体が透明で透明になり、血液が完全に置換されたことを示します。
5. 灌流が完了したら、輸液針を取り外し、輸液を停止します。脳組織の採取を進めます。

5. 術後管理

1. 皮膚を閉じるときは、マウスの痛みを軽減するためにlornoxicamの筋肉内注射を投与します。.
2. 手術中は、エリスロマイシン眼軟膏を両目に塗布して、目の乾燥を改善します。.
3. 手術後、手術過程での失血量に基づいて、0.2〜0.4mLの生理食塩水をマウス腹腔内に注入して体液を補充します。
4. ペニシリンを1日40,000単位ずつ筋肉内注射し、感染予防のため3日間連続して行います。
5. 手術後の最初の数時間は、動物が自発呼吸しているかどうか定期的にチェックし、事前に定義された人道的なエンドポイントについて1日2回監視します。手術によって引き起こされた呼吸障害があることが判明した場合、またはベースラインからの>20%の体重減少、食物/水へのアクセスの持続的な不能、または重度の神経学的欠損などのエンドポイントを満たしていることが判明した場合は、マウスを_CO2で安楽死させます。
   注:動物は、胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで放置されず、完全に回復するまで他の動物の会社に戻されません。

結果

神経学的スコア
各群の 9 匹のマウスを、菅原ら ¹¹ によって報告されたスコアリング システムの変更を使用して、術後 24 時間で評価され、SAH が評価されました。取得可能な最大スコアは18です。その中で、偽グループのn = 9匹の動物はすべて18点を獲得しました。SAH群では、平均スコアは11(p < 0.0001)でした(図2)。

脳の病理学的変化
血栓は脳の基部に見られ、ウィリスの円に蓄積していましたが、偽のグループではそのような所見は検出されませんでした(図3)。

ディスカッション

結論として、この研究は、血管内フィラメント挿入によって誘発されるくも膜下出血(SAH)の単純化された信頼性の高いマウスモデルを提示し、便利で効果的なアプローチを提供します。既存の血管内穿孔モデルと比較すると、このプロトコルは穿孔ステップで同じです:フィラメントは外頸動脈(ECA)に導入され、総頸動脈(CCA)を介して進められ、続いて内頸動脈(ICA)に向けられ、そこでさらに進められて前大脳動脈(ACA)に穿孔されます。結紮術以外では、一時的にCCAを縫合糸で引っ張り、血流を遮断します。ラットとは異なり、マウスの術野はかなり限られています。結紮の代わりに牽引を使用したり、動脈クランプを使用したりすると、術野を適切に露出させることができます。一方では、このアプローチは首に必要な切開領域を効果的に最小限に抑えることができ、それによってマウスへの外傷を減らすことができます。一方、明確な術野を提供し、結紮に使用される時間を大幅に節約するため、処置時間が短縮されます。血流が長期間閉塞すると、脳虚血などの合併症を引き起こしたり、穿刺部位の出血が不十分になったりする可能性があります。別...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
C57BL/6 マウス	上海 Jiesjie 実験動物有限公司 &
電気焼灼ペン	Zhuoyu Angel Medical Equipment Co., Ltd	GermanV50	表面的な軽度の手術、組織凝固、植生の焼灼での使用に適しています。
アイソフルランス 	RWD	R650-IE	イソフルランは吸入全身麻酔薬です。血液/ガス分配係数が小さいです。動物麻酔に使用すると、スムーズ、迅速、快適に麻酔を誘発でき、回復が早く、筋肉の弛緩が良好で、交感神経系への興奮作用がありません。イソフルランは肝臓での代謝率が低いため、肝臓への毒性が少なく、繰り返し使用しても明らかな副作用はありません。麻酔廃ガスが環境や実験室職員に及ぼす悪影響を避けるために、ガス回収システムと一緒に使用することをお勧めします。
MACO フィラメント	Beijing Cinontech Co.LTD	1620-A2	体重 20-25 g のマウスに使用され、縫合先端はポリリジンやシリコンコーティングなしで半球形に溶かされ、先端から 9-10 mm 離れたところにマークされ、消毒され、直接使用できます。このモデルには3つのパッケージ仕様があります。適切なモデルを決定するために、正式な実験の前に事前実験を行うことをお勧めします。
顕微鏡	オリンパス	BX61VS	高解像度・高精度イメージング用に設計されたUIS2光学系を搭載した全電動正立顕微鏡です。機能には、電動ノーズピース、ステージ、フォーカス、および標本の大型で高解像度のデジタル画像を作成するための仮想スライド機能が含まれます。病理学、細胞生物学、神経科学、材料科学における高度な研究用途に適しています。
ナイロン縫合糸	Huawei Medical Supplies Co., Ltd	J1110	高強度、生体適合性材料で作られた非吸収性外科用縫合糸。