方法論記事

原子間力顕微鏡から得られたフォースマップからのネイティブマウス肺基底膜のヤング率の抽出

DOI：

10.3791/67784

⸱

2025年1月31日

 ,  ,  , 
1Munich University of Applied Sciences, 2Center for Applied Tissue Engineering and Regenerative Medicine - CANTER, Munich University of Applied Sciences, 3Experimental and Clinical Pharmacology and Toxicology, Medical Faculty, University of Freiburg, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Medical Center, University of Freiburg

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、マウス肺組織の凍結切片を調製する方法、原子間力顕微鏡の力マップ実験を行う方法、およびデータを分析してネイティブマウス肺基底膜のヤング率を決定する方法を視覚化します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

原子間力顕微鏡(AFM)は、数十ナノメートルの空間分解能で試料の機械的特性を評価できます。哺乳類の細胞は、身近な微小環境の力学を感知して反応するため、組織の生体力学的特性を高い空間分解能で評価することは、さまざまな発生過程、恒常性維持過程、病理学的過程を理解するために重要です。基底膜(BM)は、約100〜400 nmの薄い細胞外マトリックス(ECM)の下部構造であり、腫瘍の進行と転移形成に重要な役割を果たします。このような薄いECM部分構造のヤング率を決定することは困難ですが、BMの生体力学的データは、BMが細胞の挙動にどのように影響するかについての基本的な新しい洞察を提供し、さらに貴重な診断の可能性を提供します。ここでは、転移しやすい主要な臓器の1つであるマウス肺組織のBM力学を評価するための視覚化されたプロトコルを紹介します。肺組織の内皮細胞層と上皮細胞層の間に位置するBMのヤング率を決定するための効率的なワークフローについて説明します。ステップバイステップの指示には、マウスの肺組織の凍結、凍結切片、および組織切片へのAFMフォースマップの記録が含まれます。さらに、自社開発のユーザーフレンドリーなAFMデータ解析ソフトウェアであるCANTER Processing Toolboxを使用した半自動データ解析手順を提供しています。このツールは、記録された力マップの自動読み込み、力対ピエゾ伸び曲線から力対インデンテーション曲線への変換、ヤング率の計算、およびヤング率マップの生成を可能にします。最後に、空間フィルタリングツールを使用して、肺BMから導出されたヤング率の値を決定および分離する方法を示します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AFMフォースマップは、ナノメートルの空間分解能とピコニュートン力感度1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12を用いて、多様な生体試料のナノ機械的特性を決定するための広く利用されている技術として登場しています.生理学的条件下でのAFM測定の生物学的サンプルへの応用に関する先駆的な研究は、P.ハンスマと同僚によって行われました13、14、15、16、17、18、19、20。続いて、AFM力測定を用いて、個々の分子21、生細胞およびそれらの細胞骨格9,10,22,23,24,25,26、組織および組織切片6,8,11,27,28、 29,30,31、および生物学的ヒドロゲル3,4,32。私たちの研究では、AFMを使用して、生物学的および化学的結合18,33,34,35,36,37の力学的特性を調べ、個々の細胞38,39,40のナノ機械的特性を測定しました。さらに、成長板軟骨8の測定により、コラーゲンの構造と細胞外マトリックス(ECM)のヤング率が軟骨細胞の分裂を指示し、その結果、胚発生中のマウス成長板の成長方向が決定されることが示されました。さらに、関節軟骨2,41,42,43,44,45,46,47における軟骨変性および変形性関節症に関連する変化を調査した。

近年、多数のAFM調査により、健康な肺組織と病理学的肺組織の両方の機械的特性が調査されています48,49,50,51,52。しかし、これらの調査は主に組織全体の力学を調べており、BMなどの特定の組織成分には焦点を当てていませんでした。BMは、ニューロン、筋肉、脂肪細胞組織、血管などの哺乳類の臓器や組織構造の大部分を覆う特殊なECM構造の薄い層(ヒトでは100nm〜400nm)を構成しています。我々は、マウスの肺BMの機械的特性が、転移形成において極めて重要な役割を果たすことを発見し、乳がんおよび腎臓がん患者の生存確率が柔らかいBMと相関することを発見した53。さらに、この調査により、分泌された細胞外マトリックスタンパク質ネトリン-4は、BM内のほぼすべてのラミニンネットワークに存在する主要成分であるラミニンγ1との化学量論的1:1相互作用を通じてBMのヤング率を低下させることが明らかになりました40。

ここでは、100 - 200 nm の薄いマウス肺 BM のヤング率 (EBM) を決定するために開発したプロトコルの視覚化を示します。BMのヤング率は、その剛性の尺度であり、線形弾性変形54、この場合は、インデントAFMチップによるBMの小さな圧縮中に生じる軸ひずみ(変位)に対する応力(単位面積あたりの力)の比率として定義されます。AFM実験では、力と変位(押し込み深さ)はAFMカンチレバーのたわみと片持ち梁の位置から取得でき、ヤング率(応力-ひずみ-関係)は、インデント先端の形状を説明する適切な弾性モデル(この場合は修正されたヘルツモデル55)を使用して、結果として得られる力と押し込み曲線から抽出できます。主な手順を 図 1 に示します。最初に、このプロトコルは、マウス肺組織サンプルをOCTコンパウンドに調製して埋め込むための方法論を説明し(ステップ1を参照)、それにより、AFMフォースマップを使用してBM剛性の決定を可能にする後続の凍結切片手順(ステップ2)を容易にします。ここで紹介するクライオセクショニング技術は、片面テープと両面テープを使用しており、固定を必要とせず、切片を解凍することなく肺組織の切片化を可能にします。BM剛性を評価するための適切なデータを収集するための詳細なAFM手順は、プロトコルの3番目のセクションで概説されています。プロトコールの次のセクションでは、自社開発のMATLABベースのソフトウェアであるCANTER Processing Toolbox56を使用して、生成された力の体積を自動的に解析する方法(ステップ4.1)について説明します。このステップでは、ヤング率は、修正されたヘルツモデルを適合させることにより、記録された各力-インデンテーション曲線から抽出され、これは圧子形状(この場合は4辺ピラミッド55)に対して補正されます。最後に、ステップ 4.2 と 4.3 では、開発したツールボックスの空間フィルタリング ツールと R2 フィルタリング ツールを適用して、歯槽壁のすべての組織コンパートメントを含む力マップで得られたヤング率値の包括的なセットから、基底膜 (BM) に固有のヤング率値を抽出する方法について説明します。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

動物サンプルの取り扱いに関するすべての手続きは、デンマークの動物福祉法に基づき、デンマーク環境食品省の動物実験評議会(許可番号2017-15-0201-01265)によって承認されています。このプロトコルを実証するために、13週齢の雄のC57BL/6マウスを使用しました。

注意:次のプロトコルでは、いくつかのステップで組織標本の取り扱いが必要です。生物学的サンプルを取り扱う際は、常に適切な手袋と実験室用コートを着用してください。

1. サンプル調製

  1. 採取したばかりのマウスの肺を使い捨ての15 x 15 x 5 mmのベース型に入れます。0.9 mm の針が付いた 10 mL シリンジを使用して、最適な切断温度 (OCT) 媒体とリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 溶液の 1:1 (体積対体積) 比でサンプルに慎重に注入すると同時に、針を引っ込めます。室温で注入を行い、小さな外科用ピンセットでサンプルをしっかりと保持します。サンプルが膨潤し、顕著な量のにじみが観察されると、注入は完了したと見なされます。
  2. 試料が完全に浸るまで、純粋なOCTを金型に充填します。肺全体を完全に凍結させるには、サンプルを-80°Cの温度で少なくとも4時間保存します。
    注:この時点で、サンプルは-80°Cで少なくとも2年間保存できます。 OCTのメーカー仕様に基づくと、埋め込まれた組織の保存期間は10年以上です。一般的には、4ヶ月を超える保存が必要なサンプルは、水分がサンプルに吸収されるのを防ぐために、透明なフィルムで包むことが推奨されます。

2. 埋没肺標本の凍結切片化

  1. クライオトームのチャンバーの温度を-17°Cに調整します。これは、肺組織サンプルの最適な切断温度です。この機能が利用可能な場合は、カッティングステージユニットの温度を-22°Cに設定します。これにより、切片作成プロセス全体を通じて、サンプル表面の最適な切断温度が維持されます。
  2. スライドガラスの中央に両面粘着テープを丁寧に貼り、その上に15mLの遠心チューブを転がして、気泡のないしっかりとした接着を確保するため、40枚の顕微鏡スライドを準備します。両面粘着テープの長さが、サンプルを含むOCTブロックの幅とほぼ同じであることを確認してください。エッジがつや消しの顕微鏡スライドでは、サンプル情報とセクション番号が記載された鉛筆でラベリングできます。
  3. 準備した顕微鏡スライドをスライドボックスに挿入します。その後、スライドを保持しているボックスをクライオトームチャンバー内に置いて冷却します。
    注:スライドを冷やすことで、切片をピックアップするときにサンプルの機械的特性を損なう凍結融解サイクルの発生を防ぐことができます。
  4. 凍結したサンプルブロックとほぼ同じサイズの片面粘着テープを複数用意します。
  5. サンプルホルダーの内側の2つのリングにOCTメディウムを充填します。サンプルをOCT培地内のサンプルホルダーに配置し、できるだけ水平になるようにします。その後、OCT培地が完全に固化し、サンプルがホルダーにしっかりと固定されるまで、サンプルホルダーをクライオトームチャンバー内に約10分間置きます。
  6. サンプルを支えているホルダーをクライオトームの切断ステージユニットに取り付けます。切断ステージの傾斜やブレードの位置など、クライオトームのすべての重要なコンポーネントをデバイスのユーザーマニュアルに従って調整し、OCTブロックの表面に平行に整列した切断面を確立します。
  7. 切片の厚さを50μmに調整してサンプルの初期トリミングを行い、組織スライドの収集のためにサンプル内の所望の位置(通常は肺標本の表面から約500μm)に達するまで切断を開始します。クライオトームの切片作成の厚さを、組織切片の所望の厚さに対応する15μmに調整します。
    注意: クライオトームなどの切断器具を使用する際には注意が必要です。個人の安全を確保するために、製造元の安全ガイドラインを遵守し、指をブレードに近づけないでください。
  8. 親指でしっかりと圧力をかけ、片面粘着テープをサンプルに貼り付けます。事前に、親指をクライオトームのチャンバー壁に数秒間押し付けて、親指が冷えていることを確認してください。
    注:接着力が欠けると、切片作成中にテープが組織から剥がれる可能性があるため、テープはサンプルにしっかりと貼り付ける必要があります。
  9. クライオトームで15μmの組織切片を作製します。ブラシを使用してセクションを方向付け、切断手順中に粘着テープがサンプルから剥がれるのを防ぎます。組織切片の表面を滑らかにするためには、切断ペースが遅く、一定に保たれることが不可欠です。
  10. 前の手順で作成したセクションは、テープが上を向いた状態でブレードブロック上に平らに置かれます。冷やした顕微鏡スライドの1つをスライドボックスの両面テープで使用し、切片にしっかりと押し付けて持ち上げます。次に、切片を運んでいる顕微鏡スライドをスライドボックスに戻します。
    注:顕微鏡スライドと切片を取り扱うときは、切断手順中に切片が解凍するのを防ぐために、常にクライオトームチャンバー内に保管してください。
  11. 必要なセクション数 (40) が集まるまで、前の 3 つの手順を繰り返します。
  12. 終了したら、スライドボックスに蓋をし、ドライアイスで-20°Cの冷凍庫に移します。最後に、使用済みのすべてのアイテムを消毒し、クライオトームチャンバー内のUVライトをオンにして、クライオトームをクリーンアップします。
    注:この時点でプロトコルを一時停止できます。AFM測定が実行されるまで、サンプルを-20°Cの温度で保存します。切片とOCT培地の推奨保管期間は6週間を超えてはなりません。この時間枠を超えると、切片とOCT培地は、そのかなりの表面積と水分を吸収する傾向の結果として、冷凍庫の燃焼に似た変化を示す可能性があります。

3. 肺切片のAFM力マップ

注:このプロトコルでは、JPK NanoWizard 4XP(AFM)とブルカーの電動ステージをライカのDMi8(倒立光学顕微鏡)と組み合わせて使用し、肺切片の力-変位曲線を記録しました。

  1. AFM のセットアップ
    1. AFMセットアップに必要なすべてのデバイス(コンピューター、AFMコントローラー、振動絶縁テーブル、光学顕微鏡など)の電源を入れます。
    2. AFM制御ソフトウェアを起動します。 「Choose Experiment」 概要で、「 QI Advanced Imaging 」モードを選択します。さらに、実験データとキャリブレーション ファイルを保存する場所を指定します。
      メモ: QI Advanced Imaging 拡張機能をお持ちでない場合は、代替オプションとして Contact Mode Force Mapping モードをご利用ください。
    3. 観察するサンプルの特定のタイプに適したスプリング定数を持つカンチレバーを選択します。軟肺組織サンプルには、ピラミッド型の先端と公称スプリング定数が0.6 N/mのブルカーのMLCT Cantilever Fが推奨されます。チップに複数のカンチレバー(MLCTなど)が含まれている場合は、実体顕微鏡でピンセットを使用して長いカンチレバーをチップから取り外し、測定に使用したカンチレバーのみがサンプルに接触するようにします。
      注:測定に使用されたカンチレバー以外のカンチレバーがサンプルと接触していると、実験中にサンプルが望ましくない動きをしたり、下にあるテープからサンプルが外れたりする可能性があります。
      注意: 現在または後続のステップでピンセットでの測定に使用したカンチレバーに接触しないようにしてください。
    4. カンチレバーホルダーにチップを取り付けます。ホルダーをAFMヘッドに挿入します。AFMヘッドを倒立光学顕微鏡上にあるサンプルステージ上に配置します。ユーザーマニュアルの指示に従って、光学レバーのパスを合わせます。光レバー経路の適切な位置合わせは、レーザービームが最初に測定カンチレバーの前端に配置され、その後、反射されたレーザービームがセグメント化されたフォトダイオードの中心に当たると達成されます。
  2. 熱雑音法を用いたカンチレバーキャリブレーション57
    注:カンチレバーのキャリブレーションには、倒立光学レバー感度(InvOLS)とスプリング定数の決定が含まれます。カンチレバーに通常提供される公称ばね定数は通常、大まかな近似値にすぎないため、すべての使用済みカンチレバーの個別の校正が必要です。このプロトコルで説明されているような、記録された力曲線からサンプルの機械的特性が決定される実験では、硬質基板上の接触ベースの方法を通じてInvOLSを直接測定することが不可欠です。カンチレバーの形状からInvOLSを導出するなど、InvOLSを決定する別の方法は、大まかな近似しか提供できず、ここで説明するアプリケーションのタイプには適していません。あるいは、供給者が正確なばね定数を提供するカンチレバーを使用する場合、Schillerらによって記述された手順によってInvOLSを決定できます。58.
    1. 顕微鏡スライドをAFMのサンプルステージに置きます。顕微鏡スライドは、InvOLSの接触ベースの測定のための硬質基板として機能します。
    2. AFMヘッドをサンプルステージに置いた後、カンチレバーホルダーと顕微鏡スライドの間の残りのギャップが約1〜2mmになるまで、ステッピングモーターを使用してヘッドを下げます。カンチレバーホルダーの側面にPBSを塗布し、長い針(0.9 mm x 70 mm)付きの1 mLシリンジを使用して、カンチレバーホルダーが流れ落ちてホルダーと顕微鏡スライドの間の隙間に流体メニスカスを形成するようにします。
      注:サンプルの力量測定に使用されるバッファーやメディアなどの同じ液体が、キャリブレーションプロセスにも使用されていることを確認してください。
    3. ソフトウェアで接触ベースのキャリブレーションを実行するには、[データ集録]ページに移動し、[詳細表示]オプションを選択します。キャリブレーションマネージャーにアクセスするには、右上隅にあるハンバーガーメニューボタンを使用します。このインターフェース内で、MethodとしてContact-basedを選択し、カンチレバー名としてドロップダウンメニューからMLCT Fカンチレバーを選択します。さらに、対応する入力フィールドで[セットポイント]を1 Vに、[スキャン数]を10に設定します。
    4. [データ集録]ページの左側のコントロールパネルで、自動進入手順の設定値に1 Vを入力します。ユーザー・インターフェースの左上隅にある青色の下向き矢印ボタンをクリックして、自動アプローチを開始します。アプローチが終了し、カンチレバーが顕微鏡スライドに接触したら、キャリブレーションマネージャーウィンドウのキャリブレーションボタンをクリックします。
      注:InvOLSとカンチレバーのばね定数は、10の力曲線を記録することによって自動的に決定され、熱雑音法57でばね定数を決定するために使用される熱パワースペクトル密度(PSD)も自動的に決定されます。自動キャリブレーション手順が終了したら、フィット曲線がカンチレバーの記録されたPSDのノーマルモード(最初のピーク)を適切に表していること、および決定されたばね定数がカンチレバーメーカーから与えられた公称ばね定数と同じ桁であることを視覚的に確認してください。そうでない場合は、フィット範囲を手動で調整して、フィットが熱パワースペクトルの最初のピークに収束し、それを表すようにする必要があります。
    5. キャリブレーションが終了したら、 Calibration Manager ウィンドウを閉じます。 キャリブレーションマネージャーを閉じると、事前に選択したディレクトリ(ステップ3.1.2を参照)にキャリブレーションファイル(*.tnd asciiファイル)が生成され、決定されたキャリブレーション結果が含まれ、後でデータ解析に必要になります。データ解析プロセス中に後で参照できるように、校正値を実験ノートなどに文書化します。
      注意: このステップ以降、カンチレバーのレーザー位置を変更したり、AFMヘッドのミラーを調整したり、カンチレバーホルダーを再配置したりしないでください。これらの要素を変更すると、InvOLS に影響が及び、キャリブレーション値が無効になります。熱ドリフトを補正するには、AFMヘッドのセグメント化されたフォトダイオードの位置を調整します。
  3. 肺切片の歯槽壁の解析
    1. 評価する試料スライドを冷凍庫から取り出します。OCT培地全体が透明になるまで、サンプルを室温で約1分間解凍します。その後、肺組織切片にPBSの液滴を数滴加えて水分を補給します。
    2. 肺組織切片を載せた顕微鏡スライドをサンプルステージに置きます。AFMヘッドをサンプルステージに戻し、カンチレバーがサンプルから約1mm上に配置されるまでヘッドを下げます。1mLシリンジと0.9mm x 70mmの針を組み合わせて、組織切片とカンチレバーホルダーの間に液体半月板が形成されるまで、カンチレバーホルダーの側面にPBSを追加します。
    3. ユーザーインターフェースの右上隅にあるレンチアイコンの付いたボタンをクリックして、設定マネージャーに移動します。設定マネージャーで、次の一般設定を調整します。[アプローチ設定]セクションで、[ターゲット高さ]を4 μmに設定します。次に、[Current Mode Settings] セクションで [Advanced Feedback Settings] に進み、[Multiplier] を 1 に設定します。最後に、Force Settingsサブセクション内で、Current Mode Settingsセクション内にある、Mode at endドロップダウンメニューからRetracted Piezoオプションを選択します。
    4. 倒立型光学顕微鏡を使用して、無傷の歯槽壁を特定し、ナビゲートします。無傷の壁は、明視野画像では暗く滑らかなエッジによって特徴付けられます。(図 2A-B を参照)。
      注:AFM制御ソフトウェアに明視野画像をインポートすると、利用可能な場合、カンチレバーを特定の歯槽壁までナビゲートし、その上の力またはQIマップを正確にキャプチャするのに役立ちます。JPK SPM ソフトウェアでは、この機能は ダイレクト オーバーレイと呼ばれます。
    5. 左側のコントロールパネルで、使用するAFM、使用するカンチレバー、および観察されたサンプルに基づいて、フォースインデンテーションカーブのパラメータを設定します。BrukerのNanoWizard 4XPおよびMLCT Cantilever Fには、次のパラメータをお勧めします。 Zの長さ= 8μm; z速度 = 300 μm/s。
      注:推奨されるz長8μmはかなり大きいです。これは肺組織の特性に起因します。肺組織は通常非常に柔らかいため、5 nNという比較的控えめな設定値であっても、特定のポイントでくぼみの深さは最大4 μmに達する可能性があります。先端がサンプルと接触していないベースラインが力-押し込み曲線の少なくとも約半分を占めることを保証するために、曲線の全長を8μmに設定することをお勧めします。これにより、後の曲線解析が大幅に簡略化されます。他のバイオAFMについても、これらのパラメータも適用できるはずですが、最大インデント力を決定するセットポイントなど、特定のパラメータの命名法はメーカーによって異なる場合があります。AFMシステムがここで示す高い垂直速度を達成できない場合は、AFMメーカーの推奨に従ってz速度を下げる必要があります。
      注意:結果の比較可能性を確保するためには、すべての実験で同一のzアプローチ速度を使用することが不可欠です。
    6. 初期オーバービューフォースマップの位置とサイズを設定し、歯槽壁全体を囲み、一方の空気側からもう一方の側に伸びるようにします。マウスの肺組織サンプルの場合、通常、20 μm x 20 μmから30 μm x 30 μmのサイズで十分です。マップの特定のサイズに関係なく、ピクセル数(記録されたフォースカーブの数に対応)を50 x 50に設定します。これにより、マップごとに 2,500 のフォース インデント カーブが生成され、フォース マップの勾配チャネル内の BM を識別するために必要な解像度が得られます。(図 2C-D を参照)。
    7. 概観図を記録した後、力マップの高さと傾斜チャネルを調べます。高さチャネルが歯槽壁が無傷であることを示しており( 図2Dを参照)、および傾斜チャネルのBMを上皮と内皮の2つの層の間に位置する明確に定義された明るい線( 図2C、Eを参照)として区別できる場合は、BM上の3μm x 3μmまたは4μm x 4μmのサイズでより焦点を絞った力マップをキャプチャします。x 50 カーブ。
      注意: この手順により、マップ解像度が高くなり、特に BM について、より多くのヤング率値を記録できます (図 2E-F を参照)。さらに、これにより、BMと周囲の組織との間のより正確な鑑別が可能になり、その後の空間フィルタリングプロセスの精度が向上します。オーバービューマップのチャネルに崩壊または破裂した壁が示されている場合、カンチレバーが先端だけでなくサンプルに接触していることによるアーティファクト、または斜面チャネルに識別可能なBMがない場合は、BMのアーティファクトのない評価を持つ壁が特定できるまで、組織切片の別の壁に移動します。
      同じ肺標本のさらに切片で前の手順(3.3.6および3.3.7)を繰り返し、必要な数の肺胞壁が評価されるまで行います。堅牢な結果を達成するために、各肺標本には少なくとも4つの壁が推奨されます59。
    8. 測定が完了したら、サンプルとPBSと接触したすべての機器と材料を清掃します。サンプルが不要になった場合は、オートクレーブ可能なガラス廃棄物容器に廃棄してください。記録したデータをすべて保存し、AFM制御ソフトウェアとコンピューターをシャットダウンします。最後に、使用されていた電気機器をすべてオフにします。
      注:この時点で、プロトコルを一時停止できます。実験データは保存され、後で分析できます。

4. データ分析

  1. 力-インデンテーション曲線の解析
    注:Force Curve Analysisアプリケーションの詳細なマニュアルは、次の場所にあります:https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/2a.-Force-Curve-Analysis。
    1. MATLAB で CANTER Processing Toolbox56 を起動し、 Force Curve Analysis アプリケーションを開きます。
      注: ツールボックスは、次のリンクから GitHub リポジトリからダウンロードできます: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool.README.md ファイルは、ソフトウェアのインストール方法とMATLABを使用した起動方法に関する包括的なガイドで構成されており、GitHubリポジトリから入手できます。ツールボックスに含まれる各アプリケーションの詳細については、https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki の対応する wiki を参照してください。
    2. 高解像度(3 μm x 3 μmまたは4 μm x 4 μm)の力マップを読み込むには、[ ファイルの選択 ]ボタンをクリックし、力マップが保存されている場所に移動してダブルクリックし、アプリケーションのユーザーインターフェースの[ データのロード ]ボタンをクリックします。
    3. ポップアップウィンドウが表示され、前のプロトコルステップで選択したフォースマップを記録するために使用されたカンチレバーについて決定されたキャリブレーション値(InvOLSおよびスプリング定数)が要求されます(ステップ3.2を参照)。それぞれの編集フィールドにキャリブレーション値を入力します。手順3.2.4で文書化されていない場合は、キャリブレーション値も含まれている自動生成されたキャリブレーションファイルを参照してください。チップとサンプルの分離を計算する必要があるかどうかの問題については、デフォルトのオプション を yes のままにします。続いて、「 送信 」ボタンをクリックして続行します。
    4. 2つ目のポップアップウィンドウが表示され、インデントされたサンプルの圧子形状とポアソン比を選択できます。使用する MLCT カンチレバーの場合、先端形状として 4 辺錐 形を選択し、エッジに対する半角角に 17.5° を入力します (どちらもデフォルト値です)。デフォルトのポアソン比 0.5 を使用します。これは非圧縮性材料を表します。QIマップの読み込み手順を続行するには、[ 送信 ]ボタンをクリックします。
      注:ローディング手順中、記録されたたわみ-変位曲線(AFMの生データ)は、提供されたキャリブレーション値に基づいて力-インデンテーション曲線に変換されます。個々の変換ステップと関連する方程式の包括的な理解については、Hartmann et al.59の補足情報を参照してください。
    5. ロード処理が完了すると、フォースマップの初期フォースカーブが画面に表示されます。ベースライン補正モード の[オフセット+チルト ]が選択されていることを確認します。このモードは、力-誘導曲線のベースラインを自動的に検出し、傾きと垂直オフセットをゼロに修正します。さらに、 Contact Point Finder のアルゴリズムとして [Via Hertz model] を選択し、このオプションの指定された編集フィールドに 20% の値を使用します。このアルゴリズムは、軟組織サンプルに記録されたフォースインデンテーションカーブの接触点を検出するのに特に適しています。最後に、対応する編集フィールドのフィット深さを1.5μmに設定します。
      注:顕微鏡スライドの剛性が結果として生じるヤング率に影響を与えないようにするために、最大適合深さを組織切片の厚さ60の10%以下の値に設定することをお勧めします。補正アルゴリズムの詳細については、Hartmann et al.59の補足情報を参照してください。
      注意:実験全体で同じフィット深さを使用して、結果が比較可能であることを保証します。
    6. 修正したHertzモデルのフィットをQIマップのすべてのフォースインデンテーションカーブに適用するには、 Keep & Apply to all ボタンをクリックします。解析中に各力曲線を表示するかどうかを尋ねるダイアログウィンドウが開きます。カーブを表示しないことで、処理速度が少し速くなります。
    7. 最後の力曲線解析が完了すると、フィット結果を保存するかどうかを尋ねるウィンドウが表示されます。結果を両方に保存します。tsv(タブ区切り値)および.xlsx(Excel)ファイル形式の場合は、[ はい ]をクリックして、結果ファイルの名前を入力します。さらに、ファイル拡張子が *.meta_data のテキスト ファイルが保存され、利用されたキャリブレーション値、選択したフィット モデル、選択した接触点検出アルゴリズム、フィット範囲、その他の関連情報など、曲線の分析に関するすべての詳細が含まれています。
    8. Force Curve Analysisアプリケーションを閉じるには、メインウィンドウの右上隅にある十字アイコンをクリックします。
  2. QI マップ結果の空間フィルタリング
    注: 空間フィルタリング ステップでは、BM から発信された QI マップのヤング率値のみが、その後の解析で考慮されます。 Result Filtering Tool の詳細なマニュアルは、https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/Result-Filtering-Tool を参照してください。
    1. CANTER Processing Toolboxのアプリケーション選択ウィンドウでアプリケーションのリストからResult Filtering Toolを選択し、Start Applicationボタンをクリックしてアプリケーションを起動します。
    2. フィット結果を読み込むには、結果フィルタリングツールのユーザーインターフェースの上部メニューバーで開くをクリックします。次のポップアップウィンドウで、JPKマップタブ内にある最初のセットボタンを見つけ、力曲線解析の結果を含む.tsvファイルを選択します(手順4.1.6を参照)。2 番目の [セット] ボタンをクリックして、既に選択されている .tsv ファイルに対応する QI マップ ファイルを見つけます。続いて、[送信]をクリックしてマップデータを読み込み、曲線解析結果をフォースします。
    3. 上部の[表示チャンネル]ドロップダウンメニューから[Emodul]オプションを選択して、取得したヤング率の結果をマップ画像として表示します。さらに、ヒストグラムプロットの下にあるデータチャネルドロップダウンメニューからEmodulオプション(まだ選択されていない場合)を選択して、QIマップのロードされたヤング率値の分布を視覚化します。
    4. ユーザー インターフェイスの中央にある [操作フロー] 矢印ボタンをクリックし、右側を指していることを確認します。画像フィルターの切り替えボタンを、ヒストグラム軸の上にあるフィルターパネルの [オン] の位置に設定します。[Filter geometry] ドロップダウンメニューから [Freehand] オプションを選択し、[Add] ボタンをクリックします。
    5. トップチャンネルの画像で、マウスの左キーを押しながらBMを一周してフィルターマスクを描きます。BMは、ヤング率マップで、隣接する軟組織と比較して明るい(ヤング率の値が高い)構造として識別できます(図3Aを参照)。マスクの描画が終了したら、マウスの左キーを放し、マップに適用するマスクをダブルクリックします。右側のヒストグラム グラフには、緑色 (既定の色、図 3C-D を参照) で強調表示されているマップ領域のヤング率の値のみが表示されます。
    6. マスクされたヤング率の値のみを含む新しい .tsv 結果ファイルを作成するには、ユーザー インターフェイスの上部のメニュー バーにある [保存] > [ヒストグラムの保存] > [データの保存] をクリックします。または、ヒストグラムプロット軸の空白領域を右クリックし、コンテキストメニューから データを保存 を選択します。
    7. ポップアップウィンドウで[ すべて選択 ]をクリックして、.tsvファイルに書き込む結果を尋ねます。次に、[ OK ]ボタンをクリックして選択を確認します。その後、保存ダイアログに.tsvファイルの名前を入力し、目的の保存場所を選択し、最後に[ OK ]をクリックしてフィルタリングされた結果を保存します。
    8. 結果のフィルタリングツールを閉じるには、アプリケーションの右上隅にある十字のアイコンをクリックします。
  3. 結果のR2 フィルタリング
    注:このプロトコルステップにより、修正されたヘルツモデルが適合した力-インデンテーション曲線に良好な一致を示したヤング率の結果のみが考慮されます。 R²フィルタリングツール の詳細なマニュアルは、ここにあります:https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/R%C2%B2-Filtering-Tool。
    1. R² Filtering Toolを起動するには、CANTER Processing Toolboxのアプリケーション選択ウィンドウのアプリケーションリストからR²フィルタリングツールを選択し、Start Applicationをクリックします。
    2. ユーザーインターフェイスの上部メニューバーに移動し、[ .tsvファイルを開く]をクリックします。次のロード ファイル ダイアログで、前の手順 4.2.5 で保存した BM のヤング率の結果を含む .tsv ファイルを見つけ、ダブルクリックして選択します。
    3. ダイアログ ボックスが表示され、.tsv ファイルに含まれるデータ列の一覧が表示されます。ヤング率データを含む列として [Emodul] を選択します。その後、R² データを要求する別のリスト ボックス ダイアログで、[rsquare_fit] を選択します 。 ロード手順が完了すると、ロードされたヤング率データは画面の左上にヒストグラムの形で表示され、R²データ分布は右上のグラフに描かれます。
    4. グラフィカルユーザーインターフェースの中央にある編集フィールドに0.96を入力します。[ データのフィルター ] ボタンをクリックして、入力した値を使用して R² フィルターを適用します。このアクションでは、R² 値が 0.96 以上の結果のみが保持されます。ヤング率の結果のフィルタリングされた分布と対応する R² 値は、ユーザー インターフェイスの下半分に表示されます。
    5. 上部のメニュー バーから [ フィルター処理されたデータの保存 ] を選択して、定義された R² フィルター条件 (> 0.96) を満たす結果のみを含む新しい .tsv ファイルを作成します。保存されたデータは、たとえば、プローブされた肺BMのヤング率分布を視覚化する ヒストグラムプロットツールを使用して、ヒストグラムとして表示できるようになりました( 図4Aを参照)。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

無傷の肺胞壁の同定と測定の後、このプロトコルの主な結果は、BMのフィルタリングされたヤング率の値です。すべての組織切片でAFM測定に適した歯槽壁を見つけることは不可能であることに注意することが重要です。私たちの実験的観察では、マウスの肺標本に由来する凍結切片の約75%が定量化可能な肺胞壁を示しました。肺BMにおけるヤング率の空間分布を正確に決定するために、3 μm x 3 μmまたは4 μm x 4 μmのいずれかにまたがる力マップを使用することをお勧めします。このアプローチにより、通常100 nm〜200 nmの厚さを測定するマウス肺BMを検査するのに十分な解像度が確保されます。したがって、実験的なアプローチでは、各フォースマップの 50 x 50 のフォースカーブをキャプチャし、合計 2,500 のフォースカーブを生成します。フォースマップ内では、フォースカーブは等間隔で配置されています。これは、BMのヤング率に加えて、BMを取り巻く組織構造が小さな力マップでもプローブされることを意味します。したがって、肺BMのみのヤング率を正確かつ選択的に決定するために、このプロトコルに2段階のフィルタリングプロセスを実装しました。

オペレーター依存の空間フィルタリングの最初のフィルタリングステップでは、分析されたフォースマップに含まれる合計結果値の約10%から25%を含む、マウスの肺BMに由来するフォースカーブフィット結果が選択されます。この最初の空間フィルタリングの後、約 250 から 625 の近似結果がさらに分析のために保持されます。次のフィルタリング手順では、修正されたヘルツモデルによって適切に記述された力曲線から生じるBM関連の結果のみが含まれるようにします。したがって、修正されたヘルツ モデル フィットの決定係数 (R2) がフィルター基準として使用されます。私たちの経験的経験は、R2 値が 0.96 より大きい結果を保持することが、このプロトコルを順守することによって得られる適合結果に適していることを示唆しています。R2 値は、力曲線のベースラインの品質 (滑らかさ) と長さ、接触点の決定、および近似モデルの収束に大きく影響されることに注意することが重要です。両方のフィルタリング手順を適用した後、約100〜500のヤング率の値が通常、単一の肺胞壁のBMに残ります。

BMからのこれらの残りのヤング率値の分布は、ヒストグラムを使用して視覚化できます(図4A)。結果として得られる肺BMのヤング率の値は、正の値61しか達成できない確率変数で一般的に観察される対数正規分布に従うことに注意することが重要です。これは、 図4BのQQプロットで視覚化されています。したがって、正規分布 (ガウス分布) を対数変換されたヤング率 (E) 値の分布に適合させることができます。ここでは、自然対数 (ln) を使用して E 値を変換しました。分布のピーク位置 (μ) と標準偏差 (σ) をこの近似から抽出し、その後再変換して、次の式を使用して EBM で示される代表的なヤング率を求めました。

figure-results-1

再変換後、標準偏差区間はピーク値を中心に対称ではなくなることに注意してください。標準偏差区間の負のエッジ(σ-)と正のエッジ(σ+)は、次の式を使用して計算できます。

figure-results-2

figure-results-3

これらの方程式は、指数関数が自然対数62の逆関数であるという事実の結果です。

図 4A のヒストグラムから求められたピーク値 (μ = 9.31) と標準偏差 σ = 0.18 を再変換すると、代表的なヤング率の値は EBM = 11.05 kPa で、標準偏差間隔は [-1.82 kPa, +2.18 kPa] となります。あるいは、対数正規分布を変換されていないヤング率(E)値のヒストグラムに当てはめて、分布の特性パラメータを決定することもできます。

マウスごとに少なくとも4つの壁を分析して、Hartmannら59で詳細に示したように、頑健な代表的な結果を得ることが推奨される。マウスの代表的なヤング率 EBM を決定するために、4つの壁すべての対数変換値を1つの結合ヒストグラムにプロットし、正規分布を適合させることによってμとσを決定しました。続いて、μおよびσを前述のように再変換して、 EBM および対象マウスの標準偏差間隔を取得する。

figure-results-4
図1:マウス肺基底膜のヤング率を決定するための主なプロトコルステップの概要。 最初のステップでは、マウスの肺を入手して準備し、その後にマウスの肺を埋め込みます。したがって、OCT培地とPBSの組み合わせで肺を注入し、次にOCT化合物に完全に浸します。その後、クライオトームによる凍結切片により、厚さ15μmの肺組織切片が得られます。このプロトコルでは、切断プロセス中にサンプルを所定の位置に固定するために片面および両面の粘着テープを使用するプロセスについて詳しく説明します。その後、BMのヤング率の値は、組織切片のAFMフォースマップ測定によって決定されます。力曲線解析プロセスの完了後、空間フィルタリングとR²フィルタリングを適用して、対象構造、特にBM(力マップでは緑色で示され、対数変換されたヤング率分布で定量化)のヤング率の結果が分離されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-5
図2:マウスの肺組織切片で行われた例示的なフォースマップAFM実験(A)マウスの肺組織切片の明視野顕微鏡概観画像で、2つの肺胞の間に位置する適切な無傷の肺胞壁の同定を可能にした。画像の右側には、AFMの三角形のMLCTカンチレバーFが見えます。(b)組織切片内の選択された壁の拡大図。(C)歯槽壁の50 x 50の力曲線を含む概観15 x 15 μmマップの傾斜および(D)高さチャネル。スロープ チャネルでは、BM は明るい線 (白い矢印) として識別でき、壁内の剛性が増加した構造を示しています。高さのチャネルは壁の完全性を確認し、破裂の証拠を示していません。概要の15 x 15 μmマップでBMを特定した後、50 x 50の力曲線を持つ小さな4 x 4 μmマップ(E:スロープチャネル、F:高さチャネル)が記録されます。スケールバー:(A)200μm、(B-D)25μm。示されているAFM像の色スケールの範囲は、(C)2.36 - 9.29 nN/μm、(D)0 - 3.38 μm、(E)2.36 - 9.29 nN/μm(オーバービュー画像)、2.42 - 8.37 nN/μm(小さい画像)、(F)0 - 3.38 μm(オーバービュー画像)、0 - 1.99 μm(小さい画像)で、暗いものから明るいものまであります。すべてのAFM画像には線形カラースケールが使用されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-6
図 3: 空間フィルタリング手順の視覚化。 (A) 力曲線解析の結果として得られたヤング率マップは、結果の空間フィルタリングを有効にするために結果フィルタリングツールで示されています。BMは、より柔らかい組織コンパートメントに囲まれた明るい(ヤング率の値が高い)ストライプとして識別できます。(B)フィルタリングされていないマップ(A)に対応するヤング率値のヒストグラム。(C) 空間フィルター マスク (緑色の領域) を適用した後、(D) ヒストグラムは、BM として識別された緑色で強調表示された領域からのヤング率の値のみで構成されます。ヒストグラムの左側で観察できる残留ソフト値は、収束不良の近似に起因する可能性があり、これは後続の R² フィルタリング ステップで除去されることに注意してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-7
図4:このプロトコルに従って受け取ったマウス肺BMのヤング率分布(A)結果として得られるBMヤング率の値(N = 325)の対数正規化ヒストグラム。正規分布(黒の実線)を当てはめると、標準偏差がσ = 0.18の平均値μ = 9.31が決定されます。再変換後、これは EBM = 11.05 kPa の BM のヤング率に対応し、非対称標準偏差間隔は [-1.82 kPa, +2.18 kPa] になります。(B)対数化されたBMヤング率の値の分位数と標準正規分布の分位数のQQプロット。このプロットは、分布の左右の裾の一部の値を除き、結果として得られるヤング率の値は主に対数正規分布であることを示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BMの機械的特性は、腫瘍の出芽、細胞分化、細胞移動、クロマチン53,63,64,65,66,67,68のアクセシビリティなど、さまざまな細胞機能に影響を与えるため、かなりの関心を集めています.その結果、BMメカニックを一貫した測定可能な方法で評価する能力には、満たされていないギャップが存在します。このプロトコルは、AFMユーザーが、野生型または遺伝子組み換えマウスから得られた健康または病理学的なマウス肺サンプルから肺BMのヤング率を決定できるようにすることを目的としています。ユーザーフレンドリーなグラフィカルユーザーインターフェースベースのMATLABアプリケーションCANTER Processing Toolbox56は、AFMデータのダウンストリーム解析を容易にします。このプロトコルは、肺疾患の臨床診断、管理、または新しい治療戦略の進歩につながる可能性のある研究を行っている他の研究者に役立つと期待されています。

プロトコルの重要なステップには、肺標本の凍結切片中に、凍結融解サイクルによる機械的特性の変化を防ぐために、組織切片がいつでも融解しないようにすることが含まれます。したがって、切片を採取し、クライオトームのチャンバー内でのみ取り扱うためには、事前に冷却した顕微鏡スライドのみを使用することが不可欠です。歯槽壁に力マップを記録する際の最も重要なステップは、プローブされた領域の剛性分布の定性的な概要を提供する生成された傾斜画像を利用して、BMの適切な測定位置を特定することです。得られたヤング率の値の空間フィルタリングは、プロトコルの重要なステップを構成し、CANTER Processing Toolboxの重要な機能です。このフィルタリングステップにより、研究者は、2つの柔らかい細胞層の間に位置するBMを、その独特の硬いフットプリントを通じて特定し、BMの対応するヤング率値を抽出してさらに分析することができます。

この高度な分析ワークフローにより、ネトリン-4ノックアウトマウスは、野生型リターマウスと比較して、肺基底膜において実質的に(約2倍)高いヤング率を示したことが明らかになった53。したがって、本プロトコルは、多様な条件またはグループの比較分析を容易にする。

AFMに加えて、生体材料の機械的特性を調べるための多数の方法論が存在し、分子レベルでの光学または磁気ピンセット69,70,71、中規模でのマイクロインデンテーション技術72,73、巨視的レベルでの閉じ込められたまたは閉じ込められていない圧縮試験74,75が含まれます。具体的には、圧力筋電図法、引張試験76,77、およびレオロジー78が、血管サンプルおよび再構成されたBMマトリックスのBM剛性を評価するために採用されてきた。しかし、圧力筋電図検査や引張試験などの手法では、さまざまな細胞層や構造要素を含む血管全体など、組織全体または組織全体の構造の機械的特性しか評価できません。その結果、これらの手法を用いてBMバイオメカニクスを評価する場合、細胞成分などの非BMの力学的特性が常にBMの結果に重なり合うため、BM自体の特異的な特性を分離することが困難になります。

このプロトコルでは、フォースマップ結果の空間フィルタリングを通じて、対象の特徴(BM)が抽出されます。このアプローチの制限は、関心のある特徴が、取得されたヤング率マップまたは他の利用可能なマップチャネル内の明確なパターンとして識別可能であり、識別可能であるという要件である。例えば、肺胞組織のBMは、その相互接続された構造によってのみ識別可能であり、周囲の細胞と比較して有意に高いヤング率を示します。その結果、BMは、得られたヤング率マップに連続した明るい縞として現れます。それにもかかわらず、他の生物学的構造は、マップ結果で空間フィルタリングを可能にするために、周囲の組織のものと十分に区別できない機械的特性を示します。このプロトコールは、免疫蛍光染色など、記録されたフォースマップ内の構造を同定する他の方法と組み合わせることができますが、このアプローチでは解釈が困難な結果が得られる可能性があります。この合併症は、染色手順が組織の機械的特性を変化させる可能性があるために発生する可能性があります。したがって、AFM測定前の組織の処理または染色は、関心のある特徴を特定するための代替方法が利用できない場合にのみ実施する必要があります。さらに、染色されたサンプルと未染色のサンプルの生体力学的特性を比較する適切な制御実験を行うことが重要です。

このプロトコルでは、ヤング率のコントラストに基づいてターゲット構造を同定する方法が導入されています。その結果、甲状腺、結腸、前立腺など、肺と同様の解剖学的BMを持つ組織に適用することができます。(Hartmann et al.59の拡張データ図を参照)。当初は BM 力学の解析用に開発されましたが、このプロトコルと CANTER Processing Toolbox56 は、AFM 力マップ内の機械的に異なる結合領域を調べるのに十分な汎用性を備えています (www.github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki の説明を参照)。この幅広い適用性により、このツールはAFM分野全体で価値があり、より広範な科学コミュニティでメカノバイオロジーへの注目が高まっていることを支えています。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、競合する利益を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BHおよびHC-S.バイエルン州科学芸術省からの資金提供を認め、バイエルン研究フォーカスHerstellung und biophysikalische Charakterisierung von dreidimensionalen Geweben(CANTER)およびバイエルン学術フォーラム(BayWISS)-博士コンソーシアム健康研究を通じて。データ解析ソフトウェアCANTER Processing Toolboxの開発は、研究コンソーシアム「変形性関節症における関節軟骨および軟骨下骨の変性と再生の探索 - ExCarBon (FOR2407-1/2)」のサブプロジェクト1(CL 409/4-1/2)の一環として、ドイツ研究財団から資金提供を受けました。BHおよびHC-S.主要な計装キャンペーンであるGGA-HAW(INST 99/38-1)を通じて、ドイツ研究財団からの資金提供を認めます。この研究は、デンマーク癌協会(R204-A12454(R.R.))およびドイツ研究財団(539446614からR.R.)によってさらに支援されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 mL シリンジB Braun9166017VInjekt-F
10 mL シリンジB Braun4606108VInjekt Luer Solo
15 mL Falcon tubeSarstedt62.554.002スクリューキャップチューブ
カンチレバー - MLCTBruker AFM Probes3444ピラミッド型先端形状の AFM カンチレバー
クライオトームブレードLeica Biosystems14035843496ロープロファイルの使い捨てブレード DB80LX
クライオトームサンプルホルダーライカバイオシステムズ14047740044試料ディスク 30
CyotomeライカバイオシステムCM1950ライカクライオスタット
ダイレクトオーバーレイエクステンションJPK SPMソフトウェア用のブルカーソフトウェア拡張で、倒立顕微鏡の光学画像をSPMソフトウェアのデータビューアにインポートすることができます。
使い捨てベースモールドScience ServicesSA62534-15Tissue-Tek Cryomold 15x15x5 mm
両面テープテサフィルム56661-00002フォトフィルムテープ
固定スプリングカンチレバーホルダーブルカー
倒立顕微鏡 - ライカDMi8ライカマイクロシステム
ズ JPK 電動ステージブルカー
JPK NanoWizard 4XP BioScienceBruker
JPK SPM SoftwareBruker
K5 CMOS Microscope KameraLeica Microsystems
MATLABMathworksVersion R2024a or higher
MATLAB - Curve Fitting Toolbox Mathworks
MATLAB - 画像処理ツールボックスMathworks
MATLAB - 信号処理ツールボックス Mathworks
MATLAB - Statistics and Machine Learning ToolboxMathworks
顕微鏡スライドCarl RothH869.1カンチレバーキャリブレーション用プレーン顕微鏡スライド
- つや消しエッジCarl RothH870.1クライオセクショニング用つや消しエッジ付き顕微鏡スライド
ニードル&オスラッシュ;0.9 mm ×25 mmB Braun4657500OCT注射  肺サンプル
への注射針とオスラッシュ;0.9 mm ×70 mmB ブラウン4665791AFM
OCT 化合物Sakura Finetek4583Tissue-Tek O.C.T. 化合物
リン酸緩衝生理食塩水Bio&Ca2+、Mg2+、500 mL
JPK SPM ソフトウェア用の拡張は、記録された各画像ピクセルに対して、基礎となる力曲線全体を提供します。
メスB ブラウン5518083外科用使い捨てメス
はさみKaut-BullingerM681700精密はさみ 13 cm 
片面テープtesa Film57330-00000クリスタルクリアテープ、33 m x 19 mm
スライドボックスGWL 収納システムK50Wスライドボックス 50 スライド用
実体顕微鏡 - Stemi DR1663Zeiss
Tweezers - Vomm SS-SA-ESDEleshopELE002121
QI Advanced Imaging Extension Bruker Software Extension を含まない BS.L1825 PBS solution を販売します

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alsteens, D., et al. Atomic force microscopy-based characterization and design of biointerfaces. Nat Rev Mater. 2 (5), 17008(2017).
  2. Aro, E., et al. Severe extracellular matrix abnormalities and chondrodysplasia in mice lacking collagen prolyl 4-hydroxylase isoenzyme II in combination with a reduced amount of isoenzyme I. J Biol Chem. 290 (27), 16964-16978 (2015).
  3. Domke, J., Radmacher, M. Measuring the elastic properties of thin polymer films with the atomic force microscope. Langmuir. 14 (12), 3320-3325 (1998).
  4. Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), e0220281(2019).
  5. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nat Rev Phys. 1 (1), 41-57 (2019).
  6. Loparic, M., et al. Micro- and nanomechanical analysis of articular cartilage by indentation-type atomic force microscopy: validation with a gel-microfiber composite. Biophys J. 98 (11), 2731-2740 (2010).
  7. Plodinec, M., et al. The nanomechanical signature of breast cancer. Nat Nanotechnol. 7 (11), 757-765 (2012).
  8. Prein, C., et al. Structural and mechanical properties of the proliferative zone of the developing murine growth plate cartilage assessed by atomic force microscopy. Matrix Biol. 50, 1-15 (2016).
  9. Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope. Biophys J. 70 (1), 556-567 (1996).
  10. Radmacher, M., Tillamnn, R. W., Fritz, M., Gaub, H. E. From molecules to cells: imaging soft samples with the atomic force microscope. Science. 257 (5078), 1900-1905 (1992).
  11. Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nat Nanotechnol. 4, 186-192 (2009).
  12. Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophys J. 86 (5), 3269-3283 (2004).
  13. Florin, E. L., Moy, V. T., Gaub, H. E. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  14. Hansma, P. K., et al. Tapping mode atomic force microscopy in liquids. Appl Phys Lett. 64 (13), 1738-1740 (1994).
  15. Moy, V. T., Florin, E. L., Gaub, H. E. Intermolecular forces and energies between ligands and receptors. Science. 266 (5183), 257-259 (1994).
  16. Radmacher, M., Fritz, M., Hansma, H. G., Hansma, P. K. Direct observation of enzyme activity with the atomic force microscope. Science. 265 (5178), 1577-1579 (1994).
  17. Radmacher, M., Fritz, M., Hansma, P. K. Imaging soft samples with the atomic force microscope: gelatin in water and propanol. Biophys J. 69 (1), 264-270 (1995).
  18. Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nat Struct Biol. 6 (4), 346-349 (1999).
  19. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  20. Drake, B., et al. Imaging crystals, polymers, and processes in water with the atomic force microscope. Science. 243 (4898), 1586-1589 (1989).
  21. Clausen-Schaumann, H., Rief, M., Tolksdorf, C., Gaub, H. E. Mechanical stability of single DNA molecules. Biophys J. 78 (4), 1997-2007 (2000).
  22. Rotsch, C., Radmacher, M. Drug-induced changes of cytoskeletal structure and mechanics in fibroblasts: an atomic force microscopy study. Biophys J. 78 (1), 520-535 (2000).
  23. Lekka, M., et al. Elasticity of normal and cancerous human bladder cells studied by scanning force microscopy. Eur Biophys J. 28 (4), 312-316 (1999).
  24. Weisenhorn, A. L., Khorsandi, M., Kasas, S., Gotzos, V., Butt, H. J. Deformation and height anomaly of soft surfaces studied with an AFM. Nanotechnology. 4 (2), 106(1993).
  25. Rotsch, C., Jacobson, K., Radmacher, M. Dimensional and mechanical dynamics of active and stable edges in motile fibroblasts investigated by using atomic force microscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (3), 921-926 (1999).
  26. Goldmann, W. H., Ezzell, R. M. Viscoelasticity in wild-type and vinculin-deficient (5.51) mouse F9 embryonic carcinoma cells examined by atomic force microscopy and rheology. Exp Cell Res. 226 (1), 234-237 (1996).
  27. Tschaikowsky, M., et al. Hybrid fluorescence-AFM explores articular surface degeneration in early osteoarthritis across length scales. Acta Biomater. 126, 315-325 (2021).
  28. Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthr Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
  29. Kinney, J. H., Balooch, M., Marshall, S. J., Marshall, G. W. Jr, Weihs, T. P. Atomic force microscope measurements of the hardness and elasticity of peritubular and intertubular human dentin. J Biomech Eng. 118 (1), 133-135 (1996).
  30. Symposium on Thin Films - Stresses and Mechanical Properties VI,. 1996 MRS Spring Meeting. Lundkvist, A., et al. , 353-358 (1997).
  31. Tao, N. J., Lindsay, S. M., Lees, S. Measuring the microelastic properties of biological material. Biophys J. 63 (4), 1165-1169 (1992).
  32. Radmacher, M. Measuring the elastic properties of biological samples with the AFM. IEEE Eng Med Biol Mag. 16 (2), 47-57 (1997).
  33. Becke, T. D., et al. Pilus-1 backbone protein RrgB of Streptococcus pneumoniae binds collagen I in a force-dependent way. ACS Nano. 13 (6), 7155-7165 (2019).
  34. Becke, T. D., et al. Single molecule force spectroscopy reveals two-domain binding mode of Pilus-1 tip protein RrgA of Streptococcus pneumoniae to fibronectin. ACS Nano. 12 (1), 549-558 (2018).
  35. Pill, M. F., East, A. L. L., Marx, D., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Mechanical activation drastically accelerates amide bond hydrolysis, matching enzyme activity. Angew Chem Int Ed Engl. 58 (29), 9787-9790 (2019).
  36. Schmidt, S. W., Filippov, P., Kersch, A., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Single-molecule force-clamp experiments reveal kinetics of mechanically activated silyl ester hydrolysis. ACS Nano. 6 (2), 1314-1321 (2012).
  37. Docheva, D., et al. Researching into the cellular shape, volume and elasticity of mesenchymal stem cells, osteoblasts and osteosarcoma cells by atomic force microscopy. J Cell Mol Med. 12 (2), 537-552 (2008).
  38. Docheva, D., Padula, D., Schieker, M., Clausen-Schaumann, H. Effect of collagen I and fibronectin on the adhesion, elasticity and cytoskeletal organization of prostate cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 361-366 (2010).
  39. Kiderlen, S., et al. Age related changes in cell stiffness of tendon stem/progenitor cells and a rejuvenating effect of ROCK-inhibition. Biochem Biophys Res Commun. 509 (3), 839-844 (2019).
  40. Reuten, R., et al. Structural decoding of netrin-4 reveals a regulatory function towards mature basement membranes. Nat Commun. 7, 13515(2016).
  41. Fleischhauer, L., et al. Nano-scale mechanical properties of the articular cartilage zones in a mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Appl Sci. 12 (5), 2596(2022).
  42. Alberton, P., et al. Aggrecan hypomorphism compromises articular cartilage biomechanical properties and is associated with increased incidence of spontaneous osteoarthritis. Int J Mol Sci. 20 (5), 1-16 (2019).
  43. Alberton, P., et al. Aggrecan is critical in maintaining the cartilage matrix biomechanics which in turn influences the correct development of the growth plate. Osteoarthr Cartilage. 27, S178-S178 (2019).
  44. Gronau, T., et al. Forced exercise-induced osteoarthritis is attenuated in mice lacking the small leucine-rich proteoglycan decorin. Ann Rheum Dis. 76 (2), 442-449 (2017).
  45. Hartmann, B., et al. Early detection of cartilage degeneration: A comparison of histology, fiber Bragg grating-based micro-indentation, and atomic force microscopy-based nano-indentation. Int J Mol Sci. 21 (19), 7384-7398 (2020).
  46. Rellmann, Y., et al. ER stress in ERp57 knockout knee joint chondrocytes induces osteoarthritic cartilage degradation and osteophyte formation. Int J Mol Sci. 23 (1), 182(2021).
  47. Kamper, M., et al. Early changes in morphology, bone mineral density and matrix composition of vertebrae lead to disc degeneration in aged collagen IX -/- mice. Matrix Biol. 49, 132-143 (2016).
  48. Akhtar, R., Sherratt, M. J., Cruickshank, J. K., Derby, B. Characterizing the elastic properties of tissues. Mater Today. 14 (3), 96-105 (2011).
  49. Junior, C., et al. Baseline stiffness modulates the non-linear response to stretch of the extracellular matrix in pulmonary fibrosis. Int J Mol Sci. 22 (23), 12928(2021).
  50. Junior, C., et al. Multi-step extracellular matrix remodelling and stiffening in the development of idiopathic pulmonary fibrosis. Int J Mol Sci. 24 (2), 1708(2023).
  51. Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. J Mech Behav Biomed Mater. 74, 118-127 (2017).
  52. Zemla, J., et al. AFM-based nanomechanical characterization of bronchoscopic samples in asthma patients. J Mol Recognit. 31 (12), e2752(2018).
  53. Reuten, R., et al. Basement membrane stiffness determines metastases formation. Nat Mater. 20 (6), 892-903 (2021).
  54. Johnstone, A. H. CRC Handbook of Chemistry and Physics. J Chem Technol Biotechnol. 50 (2), 294-295 (1991).
  55. Rico, F., et al. Probing mechanical properties of living cells by atomic force microscopy with blunted pyramidal cantilever tips. Phys Rev E. 72 (2), 1-10 (2005).
  56. CANTER Processing Toolbox v.5.7.0. , GitHub. (2022).
  57. Hutter, J. L. J. B. Calibration of atomic-force microscope tips. Rev Sci Instrum. 64 (7), 1868-1873 (1993).
  58. Schillers, H., et al. Standardized nanomechanical atomic force microscopy procedure (SNAP) for measuring soft and biological samples. Sci Rep. 7 (1), 5117(2017).
  59. Hartmann, B., et al. Profiling native pulmonary basement membrane stiffness using atomic force microscopy. Nat Protoc. 19 (5), 1498-1528 (2024).
  60. Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophys J. 82 (5), 2798-2810 (2002).
  61. Jolicoeur, P. Introduction to Biometry. , Springer US. Boston, MA. (1999).
  62. Bronshtein, I. N., Semendyayev, K. A., Musiol, G., Mühlig, H. Handbook of Mathematics. , 6th Edition, Springer. Berlin. (2015).
  63. Fiore, V. F., et al. Mechanics of a multilayer epithelium instruct tumour architecture and function. Nature. 585 (7825), 433-439 (2020).
  64. Koester, J., et al. Niche stiffening compromises hair follicle stem cell potential during ageing by reducing bivalent promoter accessibility. Nat Cell Biol. 23 (7), 771-781 (2021).
  65. Bedzhov, I., Zernicka-Goetz, M. Self-organizing properties of mouse pluripotent cells initiate morphogenesis upon implantation. Cell. 156 (5), 1032-1044 (2014).
  66. Kyprianou, C., et al. Basement membrane remodelling regulates mouse embryogenesis. Nature. 582 (7811), 253-258 (2020).
  67. Saraswathibhatla, A., Indana, D., Chaudhuri, O. Cell-extracellular matrix mechanotransduction in 3D. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (7), 495-516 (2023).
  68. Sherwood, D. R. Basement membrane remodeling guides cell migration and cell morphogenesis during development. Curr Opin Cell Biol. 72, 19-27 (2021).
  69. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Opt Lett. 11 (5), 288(1986).
  70. Marago, O. M., Jones, P. H., Gucciardi, P. G., Volpe, G., Ferrari, A. C. Optical trapping and manipulation of nanostructures. Nat Nanotechnol. 8 (11), 807-819 (2013).
  71. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  72. Marchi, G., et al. Microindentation sensor system based on an optical fiber Bragg grating for the mechanical characterization of articular cartilage by stress-relaxation. Sens Actuators B. 252, 440-449 (2017).
  73. Wakitani, S., et al. Repair of large full-thickness articular cartilage defects with allograft articular chondrocytes embedded in a collagen gel. Tissue Eng. 4 (4), 429-444 (1998).
  74. Moutos, F. T., Freed, L. E., Guilak, F. A biomimetic three-dimensional woven composite scaffold for functional tissue engineering of cartilage. Nat Mater. 6 (2), 162-167 (2007).
  75. Schwarz, S., et al. Contactless vibrational analysis of transparent hydrogel structures using laser-Doppler vibrometry. Exp Mech. 60 (8), 1067-1078 (2020).
  76. Bhave, G., Colon, S., Ferrell, N. The sulfilimine cross-link of collagen IV contributes to kidney tubular basement membrane stiffness. Am J Physiol Renal Physiol. 313 (3), F596-F602 (2017).
  77. Fisher, R. F., Wakely, J. The elastic constants and ultrastructural organization of a basement membrane (lens capsule). Proc R Soc Lond B Biol Sci. 193 (1113), 335-358 (1976).
  78. Wisdom, K. M., et al. Covalent cross-linking of basement membrane-like matrices physically restricts invasive protrusions in breast cancer cells. Matrix Biol. 85-86, 94-111 (2020).

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

CANTER Processing Toolbox

関連記事