新規スタンプデバイスを用いた二次元細胞培養からの三次元スフェロイド/オルガノイドの作製

Summary

この研究では、アガロース型にマイクロウェルを作製するためのスタンプベースのシステムを使用して、3D細胞構造を生成するための費用対効果が高く効率的な方法論を提示します。このシステムは、均一なスフェロイド/オルガノイドの形成を促進し、細胞相互作用を改善します。このアプローチは、実験のばらつきを減らし、薬物試験や組織工学への応用をサポートします。

Abstract

三次元(3D)細胞培養は、細胞と細胞外マトリックスとの間の相互作用の促進を促進するため、従来の二次元(2D)培養物よりもin vivo 微小環境をより正確に表現できます。この研究は、革新的なスタンプベースのシステムを使用して3D細胞構造(スフェロイド/オルガノイド)を生成し、アガロース型にマイクロウェルを作成するための効率的で費用対効果が高く、再現性のある方法論を開発することを目的としています。新しいスタンプを使用して、6ウェルプレートのウェルあたり663マイクロウェルを生成し、細胞凝集に理想的な環境を提供しました。初代ブタ膵島細胞をこれらのマイクロウェルに播種し、そこで凝集してスフェロイド/オルガノイドを形成しました。培養物を37°Cで5%_CO2未満でインキュベートし、培地を3日ごとに交換しました。スフェロイド形成を定期的にモニタリングし、特性評価のためにサンプルを収集しました。この分析法により、均一で高品質なスフェロイドを作製し、実験のばらつきを減らし、操作を最小限に抑え、細胞間相互作用を強化することに成功しました。アガロースベースのマイクロパターンモールドを使用することで、3D培養のための簡素化された制御された環境が提供され、標準化された費用対効果の高いソリューションが提供されました。この方法論は、薬物試験や組織工学のアプリケーションをサポートし、さまざまな実験室環境で簡単に実装できる3D細胞培養モデル用の実用的でスケーラブルなプラットフォームを提供します。

Introduction

過去50年間にわたり、数多くの細胞生物学研究により、二次元(2D)培養では、動物モデルで観察されたin vivo条件を正確に再現できないことが実証されています¹。構造的には、2D細胞培養では、細胞が3次元的に組織化し、in vivoシステムで観察された状況を再現することはできません。さらに、2D培養では、3次元(3D)培養と比較して細胞シグナル伝達経路が変化するため、2D培養を使用した特定のタイプの薬物スクリーニングが非常に矛盾している理由を説明している可能性があります²。細胞培養技術の大幅な進歩は、3D培養システムの導入により明らかになりました。3Dシステムは、細胞の組成や細胞構造によって複雑さが大きく異なります。一般に、スフェロイドとオルガノイドの2種類の構造が生成されます。スフェロイドは、正常組織または腫瘍組織、胚様体、および細胞株から得られた細胞の単純なクラスターとして説明されています。3D構造の形成は、細胞間相互作用や細胞外マトリックス(ECM)の成分によって媒介されるシグナル伝達経路など、さまざまな要因の影響を受けます。これらは、構造的なサポートと生化学的な手がかりを提供します。これらの要素は、組織の組織化と機能に寄与する相互作用を調節します³。スフェロイド培養システムは、1970年代初頭に初めて報告され、結節性がんのモデルとしてV79チャイニーズハムスター肺細胞株を使用し、非接着条件下で増殖し、完全な球を形成しました⁴。オルガノイドは、幹細胞または前駆細胞に由来する臓器特異的な細胞型のクラスターとして説明され、細胞選別や系統指定などのプロセスを通じて空間的に限定された方法で自己組織化し、in vivo^開発5を反映しています。

3D条件下で細胞を培養するために、いくつかの利用可能な方法と材料が利用可能です。現在、3D培養物の生成に採用されている主な方法は、1)液滴を吊るす。2)回転細胞培養と低付着プラスチック。3)円錐形の井戸を含むピラミッドプレート。4)マクロ多孔質の足場。5)磁気ビーズ;6)足場のないハイドロゲル。

吊り下げ式ドロップは、足場のない3D培養物を得るために使用される方法です。この方法には、広範な取り扱い、低い生産効率、球面形状、高いせん断力への曝露など、特定の制限があります。さらに、培地の置換やコンパウンドの添加などの特定の手順は困難であり、材料の損失につながる可能性があります。さらに、文献報告によると、一部の細胞株は、このアプローチを採用すると密集したスフェロイドを産生できないことが示されています⁶。

回転式細胞培養と低接着プラスチックを使用して、細胞が基質に付着して細胞が凝集してスフェロイドを形成するのを防ぎます。このプロセスには、特定のフラスコおよび/または攪拌/回転が必要です。これは、大規模なスフェロイドやオルガノイドの作製に最も簡単な方法の1つですが、特定の機器が必要である、培養寿命が短い、スフェロイドのサイズのばらつき、細胞への機械的損傷、効率の低さなどの欠点がないわけではありません⁶。

円錐形のウェルを含むピラミッドプレートは、一部の操作がスフェロイド/オルガノイドの形成を妨げる可能性があるという事実に加えて、コストに影響を与える市販のプレート^です7。

マクロ多孔質の足場は、3D培養にも使用されます。しかし、効果的な細胞播種と均一な分布を実現するには、大きな障害があります。この問題は、細孔サイズが細胞の浸透には小さすぎるか、細胞をしっかりと保持するには大きすぎる可能性があるために発生します。この問題に対処するために、この手法の複雑さとコストに直接影響を与えるいくつかの戦略が検討^{され8てきました}。

磁気ビーズ法は、少数のスフェロイド/オルガノイドを生成し、コストが高く、細胞内にナノ粒子の残留物を残す可能性がある⁹。

スフェロイドを培養するシステムの中には、足場のないハイドロゲルである非接着性のアガロースハイドロゲルがあります。このアプローチには、3D構造のサイズを正確に制御し、プレートごとに大量のこれらの構造を生成する能力など、注目すべき利点があります。この方法では、細胞を予め形成されたウェルを有するハイドロゲルに導入し、そこで細胞を沈めて3Dスフェロイド¹⁰に自己組織化する。

本研究では、マイクロパターンモールドを用いて、アガロースマイクロウェルを簡便、効率的、再現性、低コストで作製するための装置と方法論を紹介します。

このスタンプを重力の助けを借りてアガロース中にマイクロウェルを生成するための型として使用することで、マイクロウェルと細胞組織内での細胞相互作用を強化し、3D構造(スフェロイド/オルガノイド)を in vitro でシンプル、効率的、再現性、低コストで生成し、研究時間と実験室のリソースを節約することを目的としています。

Protocol

このプロトコルは、2021年9月8日に承認されたCEUA-FMUSP:1699/2021のヒト研究倫理委員会のガイドラインに従っており、2021年9月8日に承認された「ブタ膵島の分離とカプセル化」であり、細胞分子治療NUCELグループ（www.usp.br/nucel、FAPESP助成金番号2016/05311-2、「慢性変性疾患(がんおよび糖尿病)の治療を目指す再生医療」と題されたテーマ別プロジェクトの一部です。

1. スタンプ装置の製作

注:このスタンプは、NUCELグループ(https://w3nucel.webhostusp.sti.usp.br/)によってカスタムメイドされています。スタンプデバイスは、その精度と高度な3次元モデリング機能で広く認められている参照ソフトウェアを使用して開発されました。

1. 設計されたプロトタイプには、スフェロイドやオルガノイドなどの3次元培養物を同数生成できるように配置された663個のマイクロピンが備わっていることを確認してください。T6トレイ表面のスタンプの安定性を確保するには、デバイスの円周に沿って5つのサポートポイントを戦略的に配置します。
2. マイクロピンが円錐形のデザインで、寸法が1mmから3mmの範囲であることを確認してください。円錐形の底面の直径は0.7〜1.5mmの間で変化し、テーパー角度は5°〜10°の範囲です。
3. マイクロピンの深さを定義するデバイスの「ストップ」構造が、長さが10〜19 mm、直径が20〜40 mmで、マイクロピンが表面全体に均一に分布していることを確認してください。
4. さらに、片手での操作に適した人間工学に基づいたハンドルを持つようにデバイスを設計して、使用中の実用性と精度を向上させます。
   注:デバイスの大規模生産を容易にするために、3D印刷プロセスに不可欠な.stl形式のデジタルファイルが提供されます。
5. 適切なソフトウェアを使用してスライスし、互換性のある3Dプリンターで印刷するだけです。次の印刷寸法を使用してください:X-68 mm;Y-120ミリメートル;Z - 150 mm、機能性と構造品質の理想的なバランスを確保します。
6. デバイスの製作には、デバイスの性能を最適化するための必須特性である高分解能と均一な表面仕上げが求められるUV硬化型ポリマー樹脂と互換性のある光硬化型3Dプリンタを使用します。
7. 選択した3Dプリンターと互換性のあるソフトウェアを使用して、印刷用のデジタルモデルをスライスします。

2. アガロースマイクロウェルの調製

1. アガロース溶液を調製します。
   1. 純粋なアガロース粉末を秤量し、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解して、最終濃度1〜2%(w / v)を達成します。
   2. 溶液を電子レンジまたはウォーターバスで完全に溶解するまで加熱し、均一で透明であることを確認します。
      注意: 過熱や過度の再加熱は、アガロースを劣化させる可能性があるため、避けてください。大量の原液を調製しないでください。
   3. 溶液をピペッティングに理想的な温度である~40°Cまで冷却します。
2. 特注スタンプを用意します。
   1. スタンプを柔らかい毛のスポンジと蒸留水で洗い、残留物を取り除きます。
   2. 洗浄したスタンプをUVライトに5〜10分間さらして、無菌性を確保します。
3. マイクロウェルを形成します。
   1. 40 °C のアガロース溶液を ~3 mL を 6 ウェルプレートの各ウェルに注ぎ、2 〜 3 mm の均一な深さを確保します。
   2. アガロースがまだ温かいうちに、カスタムメイドのスタンプをウェルの中央に配置します。
      注意: スタンプには、位置合わせと安定性を確保する横方向のサポートがあり、手動サポートの必要性を排除します。各スタンプは、ウェルごとに~663マイクロウェル(高さ~2mm)を作成します。マイクロピンに気泡がないことを確認してください。気泡が発生した場合は、スタンプをそっと動かして泡を消します。
   3. プレートを動かさずに、アガロースを室温で5〜10分間固化させます。
      注:凝固中にアガロースを乱さないでください、マイクロウェル構造のばらつきを避けるために。
   4. マイクロウェルを傷つけずに真空を解放するために、穏やかに前後に動かしてスタンプを取り外してください。
      注:この動きにより空気の侵入が容易になり、ゲルを変形させることなくスタンプをスムーズに取り外すことができます。マイクロウェルは無傷のままでなければなりません。
   5. マイクロウェルをPBS溶液で3回洗浄し、残留物を除去します。
   6. プレートをUVライトに10分間さらして、微生物汚染を排除します。
   7. 3 mLの培地を加え、プレートを_CO2 インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートします。
      注:このインキュベーションでは、細胞播種前に汚染がないことを確認します。

3. マイクロウェルでの細胞播種

1. 細胞懸濁液を準備します。
   1. トリプシン処理または別の解離法によって細胞を採取し、均質な懸濁液を得る。
   2. 細胞をカウントし、マイクロウェルごとに必要な数に応じて濃度を調整します。
      注:663マイクロウェルにマイクロウェルあたり5,000個の細胞を播種するには、少なくとも3.315個の×10個の⁶ 個の細胞を含む懸濁液を調製します。細胞濃度を最適化して、中枢性壊死を予防し、適切な栄養素と酸素の拡散を確保します。
2. 細胞を播種します。
   1. 調製した細胞懸濁液を~3 mLをマイクロウェル上にピペットで移動させ、プレートを穏やかに撫でることで均一な分布を確保します。
   2. 細胞を重力(~10~15分)で沈降させるか、100 × g で5分間穏やかに遠心分離を行います。
      注:遠心分離は、細胞がマイクロウェルに集中することを確認するために使用できます。
   3. プレートを加湿雰囲気のある37°Cの_CO2 インキュベーターに移します。

4. 3次元細胞培養の維持

1. 培地を交換してください。
   1. 2〜3日ごとに培地を交換し、古い培地の50%を取り除き、新しい培地を追加します。
      注:脱水症を防ぐために、培養期間中はマイクロウェルが水没していることを確認してください。
2. 3D培養の形成を監視します。
   1. 3D構造が完全に形成され、コンパクトになるまで培養を続けます(例えば、一次膵島培養の場合は2〜3日)。
      注:より長い形成時間を必要とする培養物の場合は、2〜3日ごとに部分的な培地交換を行います。

5. 3D構造の収集と特性評価

1. スフェロイド/オルガノイドを収集します。
   1. 古い培地を取り出し、広径またはカットされたピペットチップを使用して激しいピペッティングで3D構造を回収し、圧縮や分解を防ぎます。
      注:骨材を変形させずに骨材を取り除くために、激しいピペッティングを制御する必要があります。
2. 解析の準備をします。
   1. 採取したスフェロイド/オルガノイドはすぐに使用するか、将来の分析のために修正してください。
      注:スフェロイドの関連と安定性は、細胞の種類、形成時間、および培養条件によって異なります。解離を避けるためには注意が必要です。

Results

この研究で使用された細胞培養は、ブタの膵島に由来しました。この研究で使用した膵島調製物は、ジチゾン染色に基づく純度は80±5%、生細胞中のフルオレセインジアセテートの検出または死細胞中のヨウ化プロピジウムの検出に基づく膵島細胞の生存率は>80%でした(Live/Dead蛍光法)。ブタ膵島製剤が少なくとも80%の純度(例:.、ジチゾン染色による)および>80%の生存可能であることを確認してください。.単離後、1 mM L-グルタミン、0.2%シプロフロキサシン、および10%ウシ胎児血清(FCS)を添加したCMRL 1066培地で、前述の^11,12と同様に、37°Cおよび5%_CO2で接着培養物を維持します。

本研究では、アガロース型にマイクロウェルを生成するためのスタンプベースのシステムの有効性を徹底的に評価しました(図1)。 図2

Discussion

文献にはさまざまな3D培養プロトコルが存在しますが、Wassmerらが実施した研究では¹³ 、膵島を使用して3D構造を生成するためのいくつかの方法論がテストされました。その結果、在来の膵島と自己凝集したスフェロイドは、サイズと形状に関してかなりの不均一性を示し、他の方法を用いて得られたものよりも大きいことが観察された。彼らの発見に基づいて、彼らはスフェロイドは異なる技術を使用して生成でき、それぞれに独自の長所と短所があると結論付けました。膵島細胞の凝集には、ハンギングドロップ法、アガロースマイクロウェルプレート、またはSphericalplate 5Dが推奨されます。

アガロースマイクロウェルを生成するためのデバイスがあり、文献で成功裏に採用されています。例えば、Stuart et ^al.14 は、デバイスを使用して有望な結果を示しましたが、対処が必要な特定の欠点を示しました。例えば、製造できるマイクロウェルの数が限られ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
31L マイクロ波	エレクトロラックス	78965840 6699 9	アガロース溶液を加熱するために使用される装置で、アガロース溶液の溶解を促進し、より高い均質性を確保します。これにより、溶液はウェルの形成に理想的な液体状態に達することができます。
3DFila Gray Opaque 感光性3D樹脂			UV硬化型ポリマー樹脂
3Dプリンター - Creality Halot One	Creality	N/A	スタンプデバイスの印刷に使用される3Dプリンター
アガロース	UNISCIENCE	UNI-R10111	ゲルを形成するには、生理食塩水リン酸緩衝液(PBS)または適切な媒体に1〜2%溶解します。
Autodesk Fusion 360			3D modeling
BB15 CO2 インキュベーター	サーモフィッシャー	51023121	培養細胞を適切で制御された環境でインキュベートするために使用される機器です。
Chitubox	Chitubox	N/A	を印刷するための部品をスライスするために使用されるソフトウェア
			確立されたパラメータおよびプロトコル内で細胞培養を行うための無菌環境を確保する。
培地	USBiological/Life Sciences	C5900-03A	適切な細胞培養のための添加物が含まれています。
培養プレート (P6)	ザルスタット 1023221		アガロースの形状と細胞の培養に使用されます。
三角フラスコ(25 mL)	Laborglas	91 216 14	1&ndashを溶解するために使用される容器。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)または別の適切な媒体に2%アガロースを含ませ、通常は電子レンジで加熱します。
ファルコン15 mLポリスチレン遠心チューブ	コーニング	352099	を懸濁液に保ち、可能な希釈を行うために使用されます。
ウシ胎児血清(FBS)	Vitrocell Embriolife	005/19	培地用添加剤。
PBS溶液(生理食塩水リン酸緩衝液)	Lab made	N/A	MiliQ超純水で1倍希釈。アガロースを1〜2%溶解し、すでに製造されたウェルを洗浄するために使用されます。
青いキャップ付き試薬ボトル - Schott	Laborglas	21801545	培地の準備と保存に使用されます。
スタンプ デバイス	NUCEL Group	N/A	リンク - このリンクは、スタンプ デバイスの .stl ファイルへのアクセスを提供します。適切なソフトウェアを使用してスライスし、互換性のある3Dプリンターで印刷するだけです。https://drive.google.com/drive/folders/1gTYComnJWzHpN6ZKOyK EChKS3Qns0rOA?usp=sharing
フィルター付き処理培養フラスコ 25 cm²	コーニング	430639	細胞の培養と維持に使用されます。
トリプシン	メルク	07-07-9002	播種前の細胞の解離用。
紫外線(UV)	N/A	N/A	スタンプとプレートの滅菌に使用します。