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方法論記事

トランスレーショナルリサーチのための可溶性基底膜抽出物のバイオプリンティングのための容積押出バイオプリンターの設計と検証

973 閲覧数

DOI:

10.3791/67788

2025年3月28日

この記事について

サマリー

可溶性基底膜抽出物は、がん研究で最も広く使用されている生物学的マトリックスですが、その複雑なレオロジー挙動により、市販のバイオプリンティングシステムではバイオプリンティングが困難になります。この研究は、単一層と多層の両方で良好な形状忠実度を持つ純粋なマトリックスコンストラクトを生成するためのカスタマイズされたバイオプリンティング戦略を示しています。

要約

トランスレーショナルリサーチでは、3D in vitro モデルは、科学的な理解と治療法の開発を進めるために不可欠です。この目的のために、マウス肉腫細胞に由来する可溶性基底膜抽出物(SBMes)は、 in vivo 微小環境の機械的および生化学的特徴を再現する重要な役割を果たします。特に、組織工学から薬物試験まで、さまざまな研究分野で価値があります。特に、この分野で広く使用されている従来の2D細胞培養は、3次元(3D)構造や腫瘍微小環境を捉えていないため、誤解を招く情報を提供する可能性があるため、がん研究の基本となっています。

がん研究では、効果的な 3Din vitro モデルが、がんの進行をよりよく理解し、薬剤耐性メカニズムなどの課題を予測するために重要です。オルガノイドは、腫瘍生物学をより正確に表現する有望な 3Din vitro モデルとして浮上しています。それらは、細胞が成長し、3D構造に自己組織化できる環境を作り出すため、SBMで成長します。しかし、SBMeには、低い機械的特性や複雑なレオロジー挙動などの大きな課題があり、市販の空気圧押出バイオプリンティングシステムでの使用が妨げられています。

これらの制限に対処するために、低コストで体積制御されたバイオプリンティングシステムと、SBMeで構造をプリンティングするための特定のプロトコルを開発しました。このシステムは、容積式押出機に基づいており、従来の空気圧駆動アプローチの制限を克服しています。特定のgコードで組み立てられ、プログラムされると、システムは純粋なSBMeと希釈されたSBMeの両方をバイオプリントして、単層と多層の両方のコンストラクトを得ることができます。このアプローチは、3D細胞培養モデルを作成するためのより信頼性と拡張性のある方法を提供し、新しい治療法や薬物試験のより効果的な研究への道を開きます。

概要

トランスレーショナルリサーチでは、in vivo環境を忠実に再現した3Din vitroモデルを作成することが、科学的な理解と治療法の開発を進めるために不可欠です1。それらを構築するための重要な要素は、天然組織の複雑さをよりよく反映する可溶性基底膜抽出物(SBM)などの細胞外マトリックス(ECM)アナログの使用です。SBMは、組織工学から薬物試験まで、さまざまな研究分野で特に価値があります2,3。特に、腫瘍微小環境の機械的および生化学的特徴を再現し、腫瘍の成長、転移、および治療反応をよりよく反映するモデルの開発を可能にするため、がん研究の基本となっています。

実際、過去数十年にわたる大幅な進歩にもかかわらず、多くの治療法は失敗し続けており、臨床現場での治療の失敗が頻繁に発生しています。この失敗は、多くの場合、高レベルの細胞不均一性によって引き起こされる薬剤耐性メカニズムに起因します4,5。ヒト腫瘍の複雑さを正確に再現できる効果的なin vitroモデルは、がんの進行をよりよく理解し、この現象を予測するために重要で....

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プロトコル

1. 3D容積測定バイオプリンターの印刷と組み立て

  1. バイオプリンターのコンポーネントを準備し、3Dプリントします。
    1. *をダウンロードします。 補足ファイル1のSTL設計ファイル。
    2. 負荷*。独自のスライスソフトウェアでSTLファイルを作成し、印刷プレート上のピースの向きと3Dプリンターに必要なすべてのオプションを定義します。中品質のオプション(ノズルサイズ0.4 mm、フィラメント直径1.75 mm、押出機温度220 °C、プリントベッドプレート温度50 °C、層高さ0.2 mm、印刷速度300 mm / s)のポリ乳酸(PLA)を使用してピースを印刷します。
      注意: 中品質のオプションは、ピースの印刷に使用したプリンターによって異なる場合があります。
    3. 印刷したピースを3Dプリンターベッドから取り外します。印刷された支持構造がある場合は取り外し、必要に応じて表面を磨きます。
  2. 押出機を組み立てます(図1)。
    1. 2つのリニアボールベアリング(LM4UU)をプッシャーブロックの垂直穴に挿入します。親ねじナットT8も背面の中央の穴に挿入し、4本のネジ(M3x10)で固定します。
    2. ステッピングモーターにリ....

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結果

この記事では、低コストのカスタムメイドの容積式バイオプリンターを使用して、SBMeで作られたバイオプリンティングコンストラクトのプロトコルを紹介します。詳細な説明と3Dプリントを提供します*。STLファイルを使用してシステムを構築し、単層および多層構造を印刷することにより、がん研究での使用の可能性を実証しています。各3Dプリントされたコンポーネントは、組み立てる前に、支持構造や不要なプリント残留物から適切に洗浄されています。 図 8 は、アセンブリ全体のさまざまなビューを示しています。 (A) 生物学的安全キャビネット内の負担を減らす可能性を持つために別々のピースを使用する、 または(B) 構造に直接取り付けられた電子ブロックを使用して、よりコンパクトなシステムを持つという2つの異なるオプションがあります。

この容積式バイオプリンティングシステムおよび提示されたプロトコルの目的は、純粋なSBMe16を用いたバ.......

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ディスカッション

トランスレーショナルリサーチでは、SBMは組織工学から薬物試験まで、さまざまな研究分野で特に価値があります2,3。特に、腫瘍微小環境の機械的および生化学的特徴を再現し、腫瘍の成長、転移、および治療反応をよりよく反映するモデルの開発を可能にするため、がん研究の基本となっています。SBMeは、特に3Dオルガノイド13,14に最も広く使用されている生体マトリックスです。Engelbreth-Holm Swarmマウス肉腫に由来する天然ECMとして、IV型コラーゲン、ラミニン、エンタクチン、およびペルレカンの特異な組成を有する。これらの成分は多くの正常組織に見られるため、SBMeは複雑な基底膜によりよく似たものにすることができます。SBMeは、in vivo組織14の特徴を厳密に模.......

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開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

この研究は、Cancer Research UKとFondazione AIRC(n° 22790)のパートナーシップを通じて資金提供されたAccelerator Award n° A26815「Single-cell cancer evolution in the clinic」、および欧州連合-次世代EU、ミッション4、コンポーネント1、CUP D53D23003310006によって部分的に資金提供されました。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
12マルチウェルプレートSigma-AldrichCLS351143
3D FDMプリンターFlashforgeAdventurer 5M Pro
3Dプリンター マザーボードGEETECHGT2560 REV A+
6マルチウェルプレートSigma-AldrichM8687
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ソケット+hiletgo%2Caps%2C173&sr=8-1
15 A 250 V
調整可能な脚EXIN DEHCENhttps://www.amazon.it/gp/product/
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高さ 27-40 mm
ボールベアリング 4 mmQUARKZMAN684ZZ寸法 4 x 9 x 4 mm
ボールベアリング 5 mmXiKe625-2RS寸法 5 x 16 x 5 mm
ベルトクローズTurmberg3Dhttps://www.amazon.it/gp/product/
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幅6 mm
ベルトオープンFajoedahttps://www.amazon.it/gp/product/
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幅 6 mm
バイオプリンティング ノズルFisher Scientific17780789Corning 標準円錐形バイオプリンティングノズルB
ürker 細胞計数チャンバーGLASWARENFABRIK KARL HECHT
心分離機Eppendorf5702 R
心分離管Sigma-AldrichCLS43147015 mL
遠心分離管Sigma-AldrichEP00301200861.5 mL
ディスプレイSigma-AldrichBR718905
DMEM Gibco Thermofisher11965092
FBSSigma-AldrichF7524
フランジ付きリニアボールベアリングマップhttps://www.amazon.it/gp/product/
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LMF8UU
ガラスシリンジFisher Scientific11520062Hamilton GasTight 1 mL (TLL 端子)
ヒンジYASQZhttps://www.amazon.it/gp/product/
B09DNXGDGG/ref=ppx_yo_dt_b_
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インキュベーターフィッシャーサイエンティフィック15481374エッペンドルフ ギャラクシー 48 R CO2 インキュベーター、48 L、ステンレス鋼
立顕微鏡NikonEclipse Ti2-U
ジャンパーワイヤーIverntechhttps://www.amazon.it/Iverntech-XH2
-54-Terminale-Stampante-Stepper/dp/
B07Q12B6K5/ref=pd_ci_mcx_mh_
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66cb-4977-48ce-b095-0dcedf8c372f&
pd_rd_i=B07Q12B6K5&th=1
LCD ユニットParadisetronic.comhttps://www.amazon.it/Display-controller
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古い Prusa i3 LCD ユニット。市販の代替
リードスクリュー M8RS PRO280-408
リードスクリュー ナット M8Comiokeへのリンク https://www.amazon.it/dp/B0C7QB13C4?
ref=ppx_yo2ov_dt_b_fed_asin_title&th=1
M8 ネジ用ナット
ねじナット T8Aipaidehttps://www.amazon.it/gp/product/B086QJCX1M/ref
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T8 ネジ用ナット
ねじ T8VBESTLIFEhttps://www.amazon.it/gp/product/B07CXRB52Y/ref
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長さ 15 mm
L-グルタミンSigma-AldrichG7513
リミットスイッチCESFONJERhttps://www.amazon.it/gp/product/B07SPX492J/ref
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リニア玉軸受 (LM4UU)A ABSOPROhttps://www.amazon.it/gp/product/B0CB3M5GHJ/ref
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寸法 4 x 8 x 12 mm
リニアボールベアリング (LM8LUU)Fdithttps://www.amazon.it/LM8LUU-Linear
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寸法 8 x 15 x 45 mm
リニアボールベアリング (LM8UU)ARCELIhttps://www.amazon.it/gp/product/
B07BV3YBP2/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
寸法 8 x 15 x 24 mm
マグネットOCEUMAOAhttps://www.amazon.it/gp/product/
B0CB6C2RF4/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title?ie=UTF8&th=1
8 x 3 mm
MatrigelGibco ThermofisherLOT 0202003SBMe
モーター ドライバー ロングラナーhttps://www.amazon.it/gp/product/
B071P41ZBW/ref=ppx_yo_dt_b_search
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ドライバー A4988
PBSMicroGem、VWRTL1006-500ML
ペニシリン - ストレプトマイシンGibco Thermofisher15070063
ピペット チップSigma-AldrichZ740058BRAND フィルターチップ、ラック付き、TipBox(容量50-1000&μ;L)
プレキシガラスシートMVQPERhttps://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti-
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厚さ 2 mm、透明シート、21 x 32.5 cm
プレキシガラス シートMVQPERhttps://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti
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透明シート 2 枚、厚さ 2 mm、20 x 20 cm
プレキシガラス シートMVQPERhttps://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti
-plexiglass-trasparente-decorazione/dp/B0C
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透明シート 2 枚、厚さ 2 mm、20 x 30 cm
ポリ乳酸 (PLA) フィラメントFlashforgeブラック 100102
電源SQUADOhttps://www.amazon.it/SQUADO-Alimentatore
-stabilizzato-dissipatore-efficienza
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C+DC+出力%3A+12V+15A&n
sdOptOutParam=true&qid=173471
4722&sr=8-6
古い Prusa i3 電源 (AC 入力: 110-220 V、DC 出力: 12 V 15 A)。市販の代替
プーリー 5 mmVooGenzekhttps://www.amazon.it/gp/product/
へのリンクB0B8H16KWX/ref=ppx_yo_dt_b_
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ボア 5 mm、幅ベルトスペース 6 mm
プーリー 8 mmYxtaiihttps://www.amazon.it/gp/product/
B07X852RFN/ref=ppx_yo_dt_b_
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ボア 8 mm、幅ベルトスペース 6 mm
ボンケーブルQUARKZMANhttps://www.amazon.it/sspa/click?ie
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C3 %2595%25C3%2591%26crid%3
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リボンケーブル 2651 28AWG 10 ピンリ
ジッドシャフトカップリンググウルフhttps://www.amazon.it/gp/product/
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5〜8 mm の結合;
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参考文献

  1. Patel, T., et al. Multicellular tumor spheroids: A convenient in vitro model for translational cancer research. Life Sci. 358, 123184(2024).
  2. Tanaka, M., et al. Emerging translational research in neurol....

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