方法論記事

外傷性脳損傷における出血と炎症を研究するための刺し傷マウスモデル

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DOI：

10.3791/67797

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2025年2月21日

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1Institute for Human Life Science, Ochanomizu University, 2Kitasato University School of Frontier Engineering

この記事について

サマリー

簡略化された外傷性脳損傷(TBI)モデルは、治療アプローチの開発を促進しました。このプロトコルは、針を使用して刺し傷マウス皮質の作成を概説し、出血と炎症の分析を可能にします。刺し傷TBIマウスモデルは、特殊な機器を必要とせずに実行できるという利点があります。

要約

外傷性脳損傷(TBI)は、多くの場合、事故やスポーツ関連の事故によって引き起こされる身体的損傷から生じます。TBIの原因は、脳震盪、脳挫傷、血腫、頭蓋骨骨折など、さまざまです。これらの異なる原因を再現するために、さまざまなTBIマウスモデルが異なるプロトコルを使用して開発されてきました。身体的な脳損傷は、一次および二次的な脳損傷を引き起こし、ニューロンの喪失を悪化させます。一次損傷は、損傷の直後に、多くの場合出血が原因で発生し、その後、病変周囲の炎症を含む二次損傷を引き起こします。したがって、出血の進展と炎症性の重症度を評価するのに適したTBIモデルを開発することが重要です。このプロトコルは、TBIの病理に関連する出血、炎症、およびニューロンの損失のメカニズムを研究するために、刺し傷TBIマウスモデルと呼ばれる貫通性脳損傷を模倣する方法を導入します。このモデルは、頭蓋骨と脳に針を刺して作成し、特殊な実験装置を必要とせずに簡単に実行できます。さらに、針を使用してマウスの大脳皮質に負った軽微な損傷は、手術後の動物の行動に影響を与えません。この機能により、研究者は、より広範な行動への影響を心配することなく、脳損傷の局所的な影響を研究することができます。刺し傷を負ったマウス大脳皮質のサンプルデータは、実質への血液漏出、グリア活性化、および炎症性サイトカイン産生の評価におけるモデルの有効性を示しています。さらに、このプロトコルは、血液凝固剤と抗炎症化合物の評価を容易にし、TBIの治療薬の開発を支援します。

概要

外傷性脳損傷(TBI)は、交通事故や転倒事故などの事故に起因することが多い身体的損傷によって引き起こされます。TBIは、鋭利な物体が脳だけでなく頭蓋骨にも穴を開けることで生じる貫通性脳損傷と、頭蓋骨を途切れることなく内部の脳が激しく揺れることで生じる閉鎖性脳損傷の2種類に分類されます1。

TBIの原因は、脳震盪、脳挫傷、血腫、頭蓋骨骨折など、非常に多様です。したがって、TBIマウスモデルは、これらの異なる原因を再現するために、さまざまなプロトコルを使用して開発されてきました。例えば、反復性脳震盪性脳震盪モデルでは、脳の振とうを伴い、電磁気的に制御されたゴム製のインパクター2を用いてマウスを数回動か動かします。さらに、ウェイトドロップTBIモデルでは、標準化されたウェイトドロップデバイスによって頭部に強い外力が加わり、無傷の頭蓋骨3で焦点の鈍的損傷を引き起こします。さらに、刺し傷TBIモデルは、針4 を用いて頭蓋骨および脳に穿刺することによって調製される(図1A)。いくつかのTBIモデルが開発されているため、観察する必要のある特定の病状に基づいてモデルを選択することが重要です。

身体的損傷によって引き起こされる脳損傷は、一次および二次脳損傷を引き起こし、ニューロンの喪失をさらに悪化させます。一次損傷は、血液脳関門(BBB)の破壊、出血、および血腫に起因する損傷の直後に発生します。したがって、出血と血腫の拡大を最小限に抑えることは、これらの要因がTBI症状の重症度を悪化させる可能性があるため、非常に重要です。二次損傷は、実質内血液成分によって引き起こされ、その後、病変部周辺の炎症を引き起こします5。脳損傷後の予後は、炎症動態に依存します。したがって、良好な予後6,7,8のためには、一次および二次損傷の両方を迅速に軽減することが重要です。

BBBは、周皮細胞、内皮細胞間のタイトジャンクション、およびアストロサイトの末端足で構成されており、これらが連携して健康な脳の血管からの物質の漏れを制限します9。提示された刺し傷システムでは、BBBは物理的に破壊されます。BBBの完全性を評価する一般的な方法には、免疫グロブリンG(IgG)の染色や、Evans blueやdextran10,11などの蛍光トレーサーの漏出の評価が含まれます。IgG染色は、病変部位から漏れて脳に沈着する血液成分を標識します。BBBが回復すると、脳への血液成分の漏れが減少し、これらの沈着物は徐々に分解されます。したがって、IgG染色は、脳損傷後のBBBの回復の程度を評価するために使用されます。さらに、静脈内投与されたトレーサーの脳実質への漏出のレベルは、BBBの回復を反映しています。この方法では、トレーサーの漏出が血流から脳実質への血液成分の移行を直接示すため、BBBダイナミクスをより明確に評価できます。さらに、出血を最小限に抑えると、迅速な血液凝固とタイムリーな線維素溶解によって支えられる、より軽度の一次損傷につながります。したがって、血液凝固および線維素溶解調節因子の発現を定量化することは、このプロセスを分析するための効果的な方法です。凝固の根底にある分子メカニズムについては、脳損傷後の出血はフィブリン形成によって止められます。その後、フィブリンに富む血栓は、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)およびウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子(uPA)によって分解されます。刺し傷TBIマウスモデルでは、フィブリン形成は損傷後1日でピークに達し、その後10日後に減少します。したがって、BBBの回復レベルは、血液成分と脳実質へのトレーサーの血管外漏出、および血液凝固因子の発現を定量化することによって予測できます。

二次損傷プロセスにおける炎症の定量化方法には、グリアの活性化と炎症性サイトカインの発現が含まれます。炎症の長期化は、主に病変部位周辺の過剰なミクログリアと星状細胞の蓄積によって引き起こされます。たとえば、刺し傷TBIモデルでは、刺し傷は病変の周りのグリア細胞の再活性化を刺激して、細胞の破片と血液成分を取り除きます。このグリアの再活性化は、通常、刺し傷の3日後にピークに達します12,13。それらの食作用機能に加えて、再活性化されたグリア細胞は過剰な炎症性サイトカインを分泌し、その結果、病変の周囲のニューロンが失われます14。グリア炎症の減弱は、脳損傷後の予後良好に寄与することが報告されています12,14。炎症のレベルを決定することは、重症度と予後を評価するのに役立ちます。したがって、出血の進展と炎症性の重症度を評価するのに適したTBIモデルを開発することが不可欠です。本研究では、TBIの病理における出血、炎症、神経細胞喪失のメカニズムを研究することを目的として、貫通性脳損傷を模倣した刺し傷マウスモデルを導入します。

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プロトコル

すべてのアニマルケアプロトコルは、日本のお茶の水大学の動物施設管理および使用委員会によって承認され、日本の文部科学省によって確立されたガイドラインに従って実施されました。生後6週齢の成体C57BL/6J雌マウス(20-25g)を用いた。すべてのマウスは、清潔な環境で食物と水を自由に摂取できるように与えられました。使用した試薬や機器の詳細は 、資料表に記載されています。

1. 大脳皮質への刺し傷手術

  1. 試薬の調製
    注:麻酔プロトコルは、前に説明したものと似ています15。動物施設が特定の麻酔薬を推奨している場合は、その指示に従ってください。ペントバルビタールナトリウムが大脳皮質4,13,16,17の刺し傷手術に有効であることが以前に確認されています。
    1. 併用麻酔薬MMB:1 mg / mLメデトミジン1.875 mL、5 mg / mLミダゾラム2.0 mL、酒石酸5 mg / mLブトルファノール2.5 mLを18.625 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解して、総容量25 mLを作成します。.この混合物の濃度は、75 mg/L メデトミジン、400 mg/L ミダゾラム、および 500 mg/L 酒石酸ブトルファノール混合物です。使用前に最大8週間4°Cで保管してください。
    2. 麻酔拮抗薬:150μLの5 mg / mL塩酸アチパメゾールを9.85 mLのPBSに溶解して、総容量10 mLを作成し、濃度は75 mg / Lの塩酸アチパメゾールです。.光を避けて4°Cで保管し、使用前に最大8週間保管してください。
  2. 手術の手順
    1. マウス麻酔:イソフルラン吸入液に浸した紙を使用して、マウスが眠りにつくまで一時的に麻酔をかけます。次に、27 G x 3/4 インチの針が付いた 1 mL シリンジを使用して、10 μL/g の併用麻酔薬 MMB 腹腔内麻酔薬を注入します。3〜5分後、つま先をつまんで立ち直り反射を確認して、麻酔効果を確認します。
      注:イソフルラン吸入溶液を使用するときは、麻酔を過剰に行わないように細心の注意を払うようにしてください。.
    2. マウスを腹側に置いてペーパータオルに入れます。転送後、マウスがまだつま先をつまんで麻酔されていることを再確認してください。
    3. 後頭部の皮膚の毛皮を剃ります。綿棒を使用して、マウスの後頭部の毛皮を70%エタノールで滅菌します。鈍い鉗子で後頭の皮膚をつかみ、幅1.0〜1.5 mmの切開を行って、頭蓋骨や臓器に損傷を与えることなく後頭骨を露出させます。切開部を静かにゆっくりと開き、頭蓋骨を通じて大脳皮質と小脳の間の境界を観察します(図1B)。
      注意: 無傷マウスの頭蓋骨や脳に損傷が発生しないことを確認してください。
    4. マウス開頭術:19 G x 1•1/2インチの針を使用して、後頭骨の右半球に小さな穴を開けます。針をゆっくりと回転させて刺し傷ニードリングの挿入点を作り、脳実質を傷つけないように注意してください。穴は、ラムダとエッジの間の右半球の両耳間線の中点に配置する必要があります(図1B)。この穴は、後工程で刺し傷針を挿入するためのガイドとして機能します。
    5. 刺し傷:挿入点から27 G x 3/4インチの針を挿入し、吻尾軸に沿って大脳皮質を刺します(図1B、C)。針は頭蓋骨の前面に接触するまで挿入され、その後ゆっくりと引き抜かれます。適切な深さは、針が大脳皮質の表面を通して見ることができる深さです。大脳皮質の左側は、損傷を受けていないコントロールとして使用されます。
    6. ナイロン3-0縫合糸と1/2の丸い針を使用して、皮膚の切開部を縫合します。
    7. 麻酔拮抗薬の 10 μL/g を併用麻酔薬 MMB として腹腔内に投与します。マウスは、麻酔拮抗薬注射後8〜16時間以内に歩くことができるはずです。

2. 出血の評価とBBB壊死からの回復

  1. マウスIgG漏出に対する刺し傷脳切片の免疫酵素染色
    注:ここでは、スライドマウントされた凍結脳切片を使用しました。フリーフローティング凍結脳切片もこのプロトコルに適しています。
    1. マウス麻酔:イソフルラン吸入溶液を染み込ませた紙の近くにマウスを置き、眠りにつくまで麻酔を誘発します。その後、直ちに 100 μL/kg 配合麻酔薬 MMB を腹腔内に投与します。つま先つまみと立ち直り反射で麻酔の効果を確認します。
    2. マウスを仰向けに置き、両腕と両足を解剖ボードに固定します。
    3. マウス開胸術:鈍い鉗子を使用して腹部の皮膚をつかみ、皮膚と腹膜を1.0〜1.5cm切開して胸郭を露出させます。心臓への損傷を避けながら、ハサミで胸郭を慎重に開き、心臓灌流のために胸郭を露出させます。
    4. 心臓灌流固定:蠕動灌流ポンプを準備し、一端に19 G x 1•1/2インチの針でチューブを取り付けます。使用前にポンプの電源を入れて、チューブにPBSを充填してください。その後、ポンプが作動している間に、針先を左心室に挿入し、鉗子で固定します。右心房に0.5〜1.0mmの切開を行います。マウス18 を4〜6mL / minの速度で5分間灌流し、少なくとも20 mLのPBSを使用して血液を除去します。
    5. ポンプを停止し、チューブをPBS中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)の溶液に移します。固定18のためにPBS中の4%PFAを少なくとも20mLで、4〜6mL /分の速度で5分間ポンプを再開します。
      注:ポンプが利用できない場合は、19 G x 1•1/2インチの針を備えた50 mLシリンジを灌流に使用することも可能です。
    6. 脳の解剖:マウスを解剖ボードの腹側に置き、後頭部から鼻までの皮膚の正中線を切開して頭蓋骨を露出させます。脳を傷つけないように注意しながら、ハサミで頭蓋骨を取り出して脳を丁寧に完全に露出させます。湾曲した鉗子で脳を持ち上げ、PBS中の4%PFAを10mL充填した15mLチューブに移します。
    7. 解剖した脳をPBS中の4%PFAで4°Cで一晩インキュベートし、完全に固定します。その後、PBS中の15%スクロース10mLで脳を一晩インキュベートし、シーソーシェーカーでPBS中の30%スクロース10mLに移します。この段階的なショ糖の置換は、後で脳を冷凍庫に保管するときに、氷による組織の損傷を防ぐのに役立ちます。
    8. 脳の埋め込み:脳を組織包埋型内の埋め込み媒体に冠状に埋め込み、次にドライアイス19を含む2-メチルブタンを使用して凍結します。
    9. 凍結した脳切片:クライオスタットを使用して、埋め込まれた脳の連続冠状切片(厚さ20μm)を正に帯電したスライドガラスに取り付けます。脳切片は室温で一晩完全に風乾され、-80°Cの冷凍庫で保存されます。
    10. ブロッキングバッファーの調製:10%ウシ新生児血清、30 mg/mLウシアルブミン、10 mg/mLグリシン、および0.4% Triton X-100をTBSに混合して、ブロッキングバッファーを作製します。使用前に最大2週間4°Cで保管してください。
    11. マウスIgG染色:刺し傷を負った大脳皮質切片を室温で1時間風乾した後、スライドあたり500μLの4%PFAで30分間後固定します。次に、切片をPBS(500 μL/スライド)で5分間洗浄し、続いてトリス緩衝生理食塩水(TBS、500 μL/スライド)で2回、各5分間洗浄します。
      注意: バッファーが蒸発するのを防ぐために、保湿ボックスですべての手順を実行してください。
    12. TBS中の10%メタノールと3%過酸化水素を含む切片で内因性酵素活性を5分間クエンチした後、トリス緩衝生理食塩水(TBS、500 μL/スライド)でそれぞれ5分間2回洗浄します。
    13. ブロッキングバッファー(500 μL/slide)を用いて室温で1時間ブロッキングを行い、抗体の非特異的結合を防止します。次に、ビオチン標識マウスIgG抗体(ブロッキングバッファーで1:300希釈、300 μL/スライド)で切片を室温で1時間インキュベートします。
    14. マウスIgG抗体とインキュベートしながら、アビジン/ビオチンベースのペルオキシダーゼシステムキットの試薬A1 μLと試薬B1 μLの混合物を、ブロッキングバッファー300 μLに調製します。この混合物を室温で30分間インキュベートしてから使用してください。マウスIgG抗体のインキュベーションが完了したら、切片をTBSで5分間、3回洗浄します。次に、調製した試薬AとBの混合物(300 μL/スライド)で切片を室温で1時間インキュベートします。
    15. 切片を0.1 M Tris-HCl pH 8.0で5分間、1時間かけて3回洗浄します。次に、0.05%過酸化水素添加0.1 M Tris-HCl pH 8.0(500 μL/slide)に0.05% 3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)を添加し、5分間から1時間かけて発色します(図2A)。反応を止める前に、顕微鏡で色の変化を観察してください。
    16. 切片を0.1 M Tris-HCl pH 8.0で5分間3回洗浄し、切片を15分間風乾します。その後、切片を95%エタノールに2分間2回浸漬し、続いて100%エタノールを2分間2回浸漬して脱水します。キシレンの切片を5分間2回クリアします。水に溶けない封入剤を使用して切片を覆い、乾燥させます。
    17. マウスIgG染色強度の分析:20倍対物レンズを備えた顕微鏡を使用して切片の画像をキャプチャします。
    18. ImageJソフトウェアを使用して、各切片の免疫酵素的に染色された領域から、ランダムに選択された5つのフィールド(それぞれ8 μm 2×8 μm2 )の平均グレー値を測定することにより、染色強度を定量化します。各対側からの平均グレー値を使用して染色強度を正規化します。背景補正として傷ついた領域はありません。5つのフィールドから正規化された平均グレー値の平均を計算して、各切片のマウスIgG染色の平均グレー値を決定します。
  2. 脳実質へのエバンスブルー漏出の評価
    注:エバンスブループロトコルは、前述の方法11と似ています。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識デキストランもBBB分解からの回復に機能します10。
    1. エバンスブルー注射:解剖の1時間前に、刺し傷のあるマウスにPBS(3 mL / kg)で2%エバンスブルーを尾静脈から投与します。.
    2. 新鮮な脳の抽出:エバンスブルー投与の1時間後、ステップ2.1.1-2.1.4で説明されているように、マウスにPBSを灌流します。次に、新鮮な脳を脳スライサーを使用して冠状に1mmの厚さのセクションにスライスします。グラフ紙に従って、4つのスライスを選択し、無傷大脳皮質の刺傷領域または無傷領域を含む脳片(各1 mm2 正方形)を切り取ります(図1D)。
    3. Evans blueの定量:4つの脳片を1.5 mLチューブに集め、ティッシュグラインダーを使用して200 μLのトリクロロ酢酸でホモジナイズします。ホモジネートを10,000 x g 、4°Cで20分間遠心分離します。次に、ピペットで上清を回収し、600μLのエタノールで希釈します。0 〜 1.0 ng/mL の範囲の Evans blue の標準曲線を調製して、その濃度を定量します。プレートリーダーを使用して、励起波長620nmで680nmの蛍光強度を測定します。

3. 刺傷後の脳内の炎症レベルの評価

  1. グリア細胞の刺し傷脳切片の免疫酵素染色
    1. 脳切片の準備:手順2.1.1-2.1.9で説明されているように、脳切片を取り付けたスライドグラスを作成します。
    2. グリア染色:刺し傷のある大脳皮質切片を1時間風乾した後、切片を再度4%PFA(500μL/slide)で30分間固定します。次に、切片をPBS(500 μL/スライド)で5分間洗浄し、続いてTBS(500 μL/スライド)で2回、それぞれ5分間洗浄します。
    3. TBS中の10%メタノールと3%過酸化水素を含む切片で内因性酵素活性を5分間クエンチした後、トリス緩衝生理食塩水(TBS、500 μL/スライド)でそれぞれ5分間2回洗浄します。
    4. ブロッキングバッファー(500 μL/slide)を用いて室温で1時間ブロッキングを行い、抗体の非特異的結合を防止します。
    5. 切片を一次抗体(300 μL/スライド)と一晩インキュベートします。一次抗体には、Iba1に対して1:3,000、GFAPに対して1:1,000に希釈し、ブロッキングバッファーで希釈してください。
    6. 切片をTBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。次に、ビオチン標識二次抗体(ブロッキングバッファーで1:300希釈、300 μL/スライド)と室温で1時間インキュベートします。
    7. 二次抗体とインキュベートしながら、アビジン/ビオチンベースのペルオキシダーゼシステムキットから1 μLの試薬Aと1 μLの試薬Bを300 μLのブロッキングバッファーに混合します。その後、混合物を室温で30分間インキュベートしてから使用してください。
    8. 二次抗体のインキュベーションが完了したら、切片をTBSで3回、各5分間洗浄し、調製した試薬Aと試薬Bの混合物(300 μL/slide)で室温で1時間インキュベートします。
    9. 切片を0.1 M Tris-HCl pH 8.0で5分間、1時間かけて3回洗浄します。次に、0.05% 過酸化水素を添加した 0.1 M Tris-HCl pH 8.0 (500 μL/slide) に 0.05% DAB を 30 分間から 3 時間かけて発色します。反応を止める前に、顕微鏡で色の変化を観察してください。
    10. 切片を0.1 M Tris-HCl pH 8.0で5分間3回洗浄し、切片を15分間風乾します。その後、切片を95%エタノールに2分間2回浸し、続いて100%エタノールを2分間2回浸して脱水します。キシレンの切片を5分間2回クリアします。水に溶けない封入剤を使用して切片を覆い、乾燥させます。顕微鏡を使用して、対物レンズを20倍にして切片画像を撮影します。
  2. グリア細胞の刺し傷脳切片の免疫蛍光染色
    1. 脳切片の準備:手順2.1.1-2.1.9で説明されているように、脳切片を取り付けたスライドグラスを作成します。
    2. グリア染色:刺し傷のある大脳皮質切片を1時間風乾した後、切片を再度4%PFA(500μL/slide)で30分間固定します。次に、切片をPBS(500 μL/スライド)で5分間洗浄し、続いてTBS(500 μL/スライド)で2回、それぞれ5分間洗浄します。ブロッキングバッファー(500 μL/slide)を用いて室温で1時間ブロッキングを行い、抗体の非特異的結合を防止します。
    3. 切片を一次抗体(300 μL/スライド)と一晩インキュベートします。一次抗体には、Iba1に対して1:3,000、GFAPに対して1:1,000に希釈し、ブロッキングバッファーで希釈してください。
    4. 切片をTBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。次に、蛍光標識二次抗体(ブロッキングバッファーで1:300希釈、300 μL/スライド)と室温で1時間インキュベートします。
    5. 切片をTBSで3回、各5分間洗浄し、切片を0.4 μg/mL DAPI溶液とTBS(500 μL/スライド)で室温で5分間インキュベートします。
    6. 切片をTBS(500 μL/スライド)で5分間、蒸留水(500 μL/スライド)で5分間洗浄します。切片を15分間風乾した後、水性封入剤で覆い、乾燥させます。20倍対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用して切片画像をキャプチャします。
  3. グリア細胞マーカーおよび炎症性サイトカインのリアルタイムqPCR
    注:提示されたプロトコルで使用されたプライマー配列16、20、21、22 を 表1にリストアップする。
    1. 新鮮な脳組織の調製:ステップ2.1.1-2.1.4で説明されているように、マウスにPBSを灌流します。次に、新鮮な脳を抽出し、脳スライサーを使用して厚さ1mmの厚さにスライスします。グラフ用紙によると、4つのスライスを選択し、大脳皮質の反対側の刺し傷領域または無傷の領域を含む脳片(各1mm2 正方形)を切り取ります。中央の病変を含む、切り取る領域を決定します(図1D)。
    2. RNA抽出:4つの脳片を1.5 mLのチューブに集め、ピペッティングで1 mLのTRIzol試薬でホモジナイズします。混合物を室温で5分間インキュベートします。次に、200 μLのクロロホルムを加え、ボルテックスウェルでボルテックスウェルし、室温でさらに2分間インキュベートします。混合物を12,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。 上部の透明な層を新しい1.5 mLチューブに慎重に移し、DNAとタンパク質を含む白い沈殿物を避けます。
    3. 回収した上層に500 μLのイソプロパノールを加え、よく混合し、室温で10分間インキュベートします。12,000 x g で4°Cで10分間遠心分離した後、上清を除去し、70%エタノール1 mLを加えてRNAペレットを洗浄します。7,500 x g 、4°Cで5分間遠心分離し、上清を完全に除去し、ペレットを10分間風乾します。RNAペレットを15 μLのRNaseフリー水に溶解し、55°Cで10分間RNAを変性させます。
    4. 微量分光光度計を使用してRNA濃度を測定します。RNAはすぐに-80°Cで保存してください。
    5. cDNA合成:cDNA合成には、市販のDNA合成キットを使用してください。各サンプルにつき、1.5 μLのチューブに合計10 μLの反応バッファーを調製します。これには、2 μLの5 x RTバッファー、0.5 μLのRT酵素ミックス、0.5 μLのプライマーミックス、1 μgのRNA、およびヌクレアーゼフリーの水が含まれています。逆転写反応の場合は37°Cで15分間、酵素不活性化反応の場合は98°Cで5分間インキュベートします。次に、90 μLのヌクレアーゼフリー水をバッファーに加え、よく混合します。cDNA溶液を-20°Cで保存します。
    6. RNA発現の定量:リアルタイムのqPCR解析には、市販のqPCRマスターミックスキットを使用してください。5 μL の KOD SYBR qPCR Mix、0.4 μL の 5 μM フォワードプライマー、0.4 μL の 5 μM リバースプライマー、0.2 μL の 50 x ROX を 2 μL のヌクレアーゼフリー水に混ぜ合わせて、各サンプルの Mix 溶液を調製します。
    7. 2 μL の cDNA 溶液と 8 μL の Mix 溶液を 8 ストリップチューブに混合し、よく混合してスピンダウンします。
    8. 次のサイクリング条件でPCR反応を開始します:98°Cで2分間、続いて98°Cで10秒間、60°Cで10秒間、68°Cで30秒間のサイクルを40サイクルします。融解/解離曲線解析ステップをリアルタイムqPCR装置で実施します。
    9. mRNA発現解析:ハウスキーピング遺伝子 Gapdhによるノーマライゼーション、次いで対側23のノーマライゼーションにより行う2-Delta-Delta-Ct法を用いてmRNA発現量を解析する。

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結果

BBB破壊からの回復を分析するために、脳損傷の1、3、5、および7日後の血清IgGの血管外漏出レベルを測定することにより、刺し傷を負った大脳皮質の出血レベルを評価しました。マウスIgG染色画像からは、脳損傷後の大脳皮質への血液漏れと沈着が明らかになりました。これは、BBBが回復し、IgGタンパク質が分解されたため、7日以上後に減少しました(図2B)。IgG血管外漏出レベルは、刺し傷領域周辺のIgG染色の強度を測定することによって定量化され、これはIgG血管外漏出が脳損傷の1日後にピークに達したことを示しました(図2C)。BBBの破壊からの回復を確認することに加えて、刺し傷後に脳実質へのエバンスブルーの漏出が定量化されました。無傷の脳では、BBBがエバンスブルーが血管から脳に漏れるのを防ぎます。しかし、脳損傷後、BBBの破壊により、創傷部位の周囲にすぐにエバンスブルーの漏出が発生しました(図2D)。蛍光強度に基づくエバンスブルー濃度の定量化では、刺し傷後1時間以...

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ディスカッション

ここでは、針を用いてTBIマウスモデルを作成するためのプロトコルを紹介しました。このプロトコルは、組織学的および分子生物学的アプローチを使用して、脳損傷後のBBBおよび炎症の崩壊からの回復を定量的に評価することを可能にします。反復脳震盪性TBIモデルやウェイトドロップTBIモデルなどの代替プロトコルも、BBBの分解と炎症の分析に使用できます。これらのモデルは、特殊な機械を使用して、衝撃強度、範囲、脳領域の特定のパラメーターを含む、制御された条件下でTBIの病理を再現します。さらに、それらは無傷の頭蓋骨で閉鎖性脳損傷を引き起こす可能性があります。逆に、提案された刺し傷TBIモデルは、頭蓋骨と脳の損傷による貫通性脳損傷の両方を模倣しています。さらに、提示されたプロトコルは狭い範囲内で脳の損傷を誘発する可能性があるため、BBBの分解と炎症を分析するための観察領域を明確に定義することが重要です。これは、通常の25,26よりも細い針を使用することで可能になったこの...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

免疫組織化学とリアルタイムqPCRに協力してくださった濱野彩奈さん、山下みのりさん、遠藤さん、小林博乃さん、中平仁藤さんに感謝します。本研究は、日本学術振興会科研費19K16122、武田科学振興財団、アステラス代謝障害研究財団、三菱財団、脳科学振興財団、上原記念財団の協力を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
19 G x 1&ブル;1/2インチ針テルモNN-1938R 
27 G x 3/4インチ針テルモNN-2719S
抗GFAP抗体Sigma-AldrichG9269
抗Iba1抗体和光019-19741
アチパメゾール塩酸塩日本全薬工業製品名:アンチセダン
ビオチン標識マウスIgG抗体ベクターラボラトリーズBA-9200
ビオチン標識ウサギIgG抗体ベクターラボラトリーズBA-1000
ウシアルブミンナカライ テスク01860-07
ブレインスライサーVisikolBSLM-2
酒石酸ブトルファノール明治アニマルヘルス製品名:Vetorphale 5 mg
共焦点顕微鏡ツァイスLSM700
クライオスタット ライカCM1520
DABSigma-AldrichD5637-1G
DAPIRoche10236276001
Evans blue和光056-04061
蛍光標識ウサギ IgG 抗体InvitrogenA-21206
Fluoromount-GInvitrogen4958-02水性封入剤
イソフルラン吸入液Viatrisv002139
KOD SYBR qPCR Mix東洋紡QKD-201qPCR マスターミックスキット
メデトミジン日本全薬工業製品名 ドミトール
顕微鏡オリンパスFSX100
微量分光光度計サーモフィッシャーサイエンティフィックNanoDrop One
ミダゾラム 10 mg/2 mLサンド1124401A1060
MOUNT QUICK大同産業DM01水不溶性封入培地
新生仔牛血清ギブコ16010159
O.C.T.コンパウンドさくらファインテックジャパン45833埋込培地
Peel-A-Way, Truncated 22 mm Square TopTed Pella27118ティッシュ包埋型
蠕動灌流ポンプATTOSJ-1211
プレートリーダーフィッシャー・サイテーション Cytation 3
リアルタイムqPCR装置サーモフィッシャーサイエンティフィックStepOne Plus
ReverTra Ace qPCR RTキット東洋紡FSQ-101cDNA合成キット
スーパーフロストプラス スライドグラスフィッシャーサイエンティフィック12-550-15針付き正電荷スライドガラス
縫合糸 AlfresaHT2003NA75-KF2
TRIzol ReagentInvitrogen15596026
VECTASTAIN ABC Standard KitベクターラボラトリーズPK-4000アビジン/ビオチン系ペルオキシダーゼシステムキット

参考文献

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