ここでは、ビニールレコードから作成したPDMSモールドを使用してチャネル型寒天パッドを作製するためのプロトコルを紹介します。このチャンネルにより、ユーザーは 線虫の 向きを細かく調整して、イメージングのコントラストを向上させ、構造の比較を容易にすることができます。これらの機能は、神経再生研究に特に役立ちます。
この記事について
サマリー
要約
Caenorhabditis elegansは 、生物学的プロセスの研究に広く使用されているモデル生物です。その透明性と小型化により、組織、細胞、細胞内構造のイメージングに最適です。 C.エレガンス を画像化するための従来の平らな寒天パッドは、動物の向きの制御を制限し、主に横方向の視点に視野を制限していました。この制限は、背腹構造の視覚化を複雑にし、特に色素沈着が増加し、直径が大きくなる高齢の動物では、画像の鮮明さを低下させます。これらの課題を克服するために、私たちは動物の向きを正確に制御できるチャネリングアガロースパッドを開発しました。これらのチャンネルにより、研究者は 線虫を 回転させて特定の位置に固定することができ、複数の構造の同時イメージングを容易にし、標的細胞を顕微鏡の対物レンズに近づけることで画像の解像度を向上させることができます。これは、従来の平らな寒天パッドでは捉えるのが難しい方向に成長する可能性のある、手術後に再生された神経線維のイメージングに特に役立ちます。チャネリング寒天パッドの製造にはフラットパッドと同じ時間と材料が必要であり、ほとんどの研究室にとって実用的なオプションであるため、この方法はアクセス可能です。
概要
線虫 Caenorhabditis elegans (C.elegans)は、哺乳類の対応物と強く保存された遺伝学により、発生や行動などの生物学的プロセスを研究するために広く利用されているモデル生物です1。研究者は、実験条件を標準化し、結果を実験変数により正確に帰属させることができる、厳密に制御された環境で、線虫増殖培地(NGM)プレート上で 線虫 を培養します。動物は透明であるため、組織、細胞、および細胞内構造の鮮明なイメージングが可能です。 C.エレガンスは 小さく、成体は長さ~1mm、直径80μmであるため、1つのスライドマウントに複数の動物を配置してイメージング1を行うことができます。また、その小さなサイズにより、1つの画像で生物全体を捉えながら個々の細胞を解像することができ、これはニューロン線維の再生を視覚化するために重要です。顕微鏡検査のこれらの利点と相乗的に、 C.エレガンスの 急速な発達、型にはまった解剖学的構造、および容易な遺伝学により、大規模な研究が可能になります1。
C.エレガンスの細胞をイメージングするための典型的な手順は数十年前に確立され、ほとんど変わっていません。研究者は、スライド上の平らな寒天パッドを使用して、動物をマウントおよび固定し、細胞を視覚化します2。パッドの上部にあるカバースリップは、動物を所定の位置に保持し、顕微鏡のレンズを保護します。重要なことに、カバーガラスは屈折率が高いため、取り込まれた光の開口数が増加し、画像の解像度が向上します。さらに、カバースリップは光透過の歪みを低減します。したがって、カバースリップは、標的細胞と構造の視覚化を改善します。
ただし、カバースリップと一緒に使用すると、平らな寒天パッドは動物の向きを制限することがよくあります。 C.エレガンスは 背腹(DV)方向に沿って曲がるため、平らな寒天パッドで横方向を向いています。しかし、固定し、矯正し、DV向きに事前に回転させた後でも、カバースリップの配置により、ほぼすべての動物が横方向の図に戻ります(図1)。この向きの変更は、カバーガラスが突き出た C.エレガンス 外陰部を横に押すために発生すると考えています。外陰部のない若い動物は、よりランダムに向き付けられます。この方向に対する制限された制御は、少なくとも2つの理由で問題があります。第一に、2つの構造を単一の視野(例えば、両側)に配置することを許可しない場合があり、これにより比較が複雑になります。次に、目的の構造は一般に対物レンズに近いときに最もよくイメージングされるため、イメージング品質を最適化するために向きを設定することが重要です。これは、対物レンズがサンプル内の限られた深さ(つまり、作動距離)を画像化するため、およびより深い場所からの光がより多くの散乱と吸収を受けるためです。
C.エレガンスの場合、向きに対する限定的な制御は、一般的に高齢の動物でより深刻です。L1〜L4年齢の動物は直径が小さいため、線虫のより高い割合が画像化できます。また、これらの幼虫は色素沈着が少ないため、可視光の吸収や光子の散乱が減少し、画像の鮮明さと解像度が向上します。逆に、成体動物は直径が大きく、色素沈着が多いため、カバーガラスが初期配向に影響を与えるため、より深いz面でのイメージングには課題が生じます。
2008年には、動物の向きを維持することでこれらの課題を克服するために、チャネル付き寒天パッドを用いた戦略を導入した3,4。以下に説明するように、ユーザは、解剖学的ランドマークに注意することにより、チャネル内の固定された動物を所望の向きに回転させる。チャネルは、隆起した寒天表面の間のくぼみに動物を保持し、カバースリップの配置中に動物にかかる力を最小限に抑え、動物の回転を排除します。チャネリングパッドと一般的なフラットパッドの製造はほぼ同じ手順に従い、同じ時間を必要とするため、当社の技術は非常にアクセスしやすいものです。多くの研究室では、解剖学的特徴の研究、発達の観察、および行動5,6,7,8へのニューロンの寄与の分析のために、C.エレガンスを固定するために私たちの技術を利用しています。次のセクションでは、ホットナイフを使用して4分の1にカットされたビニールレコードから始まる、チャネリング寒天を作るための全プロセスについて説明します。まず、チャネル型寒天のキャストに使用されるポリジメチルシロキサン(PDMS)モールドの作製について説明します。次に、チャネル化された寒天を段階的に作製する方法を示します。全体の手順には、専門知識がなくても3時間かかると予想されます。PDMSの作製手順に従い、金型で作製したパッドは、一般的な寒天パッドと同じ時間(数分)で作製します。
プロトコル
1. ポリジメチルシロキサン(PDMS)の作製
- 1:10の比率の速硬化剤をベースに注ぎ、使い捨ての計量皿に注ぎます。未硬化の液体を完全に統合して泡でいっぱいになるまで、未硬化の液体を45秒間混合します。
- トレイを真空デシケーターに傾けて置きます。圧力を-0.09〜-0.1 kPa 3xの間で循環させ、気泡が表面化するようにします。
- -0.09〜-0.1kPaの圧力範囲で約1時間真空状態に保ち、目に見える気泡が少なくなるまで、手動で除去できます。
2. ビニールレコードのPDMS金型の作製
- ビニールレコードとガラス板を脱イオン(DI)水ですすいでください。ほこりがないことを確認して、最適な金型を入手してください。ビニールレコードは使用するまで風乾させます。
- ホットプレートの上にアルミホイルのシートを置き、余分なPDMSをキャッチします。
- ビニールレコードの両端にスライドガラスを置き、型の厚さをスライドガラスの幅に設定します。これにより、ガラス板を未硬化のPDMSに押し付ける際に均一な高さが確保されます。
- 未硬化のPDMS液をビニールレコードの片面に注ぎます。
- 液体表面からの光の反射を使用して気泡を観察し、ピペットチップで泡を取り除きます。ガラス板を傾けてゆっくりと下げ、空気を逃がして気泡の発生を防ぎます。
- PDMSを80°Cで35分間硬化させます。
- ビニールレコードをホットプレートから取り出し、冷まします。破れないように、ビニールレコードからPDMSを慎重に剥がします。
- 新しいスライドガラスをガイドとして使用して、鋭利なカミソリでPDMSを切断し、チャネル状の寒天型を作成します。
3. NaN3によるチャネリング寒天パッドの作製
注:平らな寒天パッドの手順と材料は以前に確立されていました9。この手順は非常に似ています。
- 0.6 gの寒天と30 mLのNGM液体9 ストックをフラスコに加えます。攪拌子を加え、ホットプレートで120°Cに加熱します。
- ゲルを溶かした後、NaN3 ストック(ストック濃度1 M)120 μLを加えます。
- PDMS型を水で洗い、自然乾燥させます。PDMSモールドを2セットのスライドペアの間に置きます。
- 寒天を上下に動かして、ピペットの先端を温めます。300 μLの溶融した寒天をPDMS型にピペットで移し、手動で寒天をチャネル全体に広げます。スライドを配置すると、チャネルに沿って寒天が広がります。
- 顕微鏡スライドを寒天上に直接置き、側面のスライドに載せます。寒天が冷めたらスライドを取り外してください。
4. C.エレガンスの取り付け
- スライドが冷めたら、スライドをせん断せずに金型からまっすぐ持ち上げます。
- 動物をNaN3で固定した後、チャネルに移動させます
- 動物を希望の向きに回転させます。
- パッドにカバースリップを置きます。パッドを傾けて、片側から反対側に軽く押し下げて、空気を横に押し込み、気泡が発生しないようにします。
結果
PDMS金型の作製
金型製造中に真空圧力を循環させると、未硬化のPDMSから穿刺され、気泡が除去されるため、気泡のない金型が得られます。 図3D に示すように、気泡は表面に上昇して穴を開けます。気泡のない金型は、きれいなチャネルを生成できます。
PDMS金型の凝固
ビニールレコードにガラス板を置くときは、エアギャップを作らないようにしてください。これらのギャップは、不均一な厚さや表面の欠陥につながる可能性があります。気泡が存在する場合は、視覚的に検出できます。ガラス板を一方の側からもう一方の側に押すと、空気が移動し、気泡の形成が最小限に抑えられ、 図4Aに示す均一な金型の厚さが確保されます。
C.エレガンスの細かい配向のためのチャネル化された寒天パッドの使用
チャネリングされた寒天パッドにより、C.エレガンスの正確な向き付けが可能になります。動物の向きは、プラチナワイヤーピックで動物を軽く転がして設定しますが、外陰部やS字腸などの目印で向きを確認します(図5A、C)。蛍光解剖顕微鏡で向きを確認した後、図5B,Dに示す倒立顕微鏡に動物を移します。
チャネル型寒天パッドによるニューロン線維の再生の評価
チャネリング寒天パッドは、動物を最適に配向させることにより、ニューロン再生のイメージング品質を向上させます。再生したニューロンファイバーを対物レンズの近くに配置することで、光の散乱と吸収が減少し、画像の鮮明さが向上します。 図5E、Fは、 再生部位を対物レンズに近づけると、イメージング品質が向上し、ニューロンの再成長のより正確な解析が容易になることを示しています。
図1:平らなパッドとチャネルパッド上の線虫Caenorhabditis elegans 。 (A)DV向きの平らな寒天パッド上の動物。外陰部はカバースリップに直面しています。(B)カバースリップの導入により、外陰部が横に押し出され、動物が横向きになります。(C)DV向きのチャネリング寒天パッド上の動物。(D)カバースリップ導入後も動物はDVオリエンテーションのままです。(E)DV方向のチャネリング寒天パッド上のローラー変異体の明視野画像。(F)カバースリップ付きの明視野画像、 E と同じ動物はDV向きのままです。略語:DV =背腹側;lat = 横方向。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:PDMS製造用材料・装置(A)SYLCAP 284-Fシリコーンエラストマーキット。(B) スケール。(C)プラスチック注射器。(D)真空デシケーター。(E)ホットプレート。(F)12インチの長時間再生ビニールレコード、必要に応じて分解します。(G)ガラス板。略語:PDMS = ポリジメチルシロキサン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:未硬化のPDMSの混合と吸引。 (A)トレイにベースと硬化剤を混ぜます。(B)トレイを真空チャンバーに入れます。(C)バキュームを3回回して、気泡が浮かび上がるようにします。(D) 1時間後、ほとんどの泡がはじけた。PDMS による伝送が改善されたことに注意してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:気泡のない未硬化PDMSへのガラス板の導入。 (A)気泡のないビニールレコードへのガラス板の導入。(B)固化したPDMS型をレコードから取り除き、インセット詳細チャネル付き。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:チャネリング寒天にマウントされたC.エレガンスの明視野および蛍光画像(A)両側DV方向の動物の明視野画像。DVオリエンテーションの解剖学的ランドマーク:鼻から尾までの距離の正中線~60%を横切るらせん状のS字型腸(矢印で示される暗い組織)。(B)Aと同じ動物、DV配向のニューロンの蛍光画像。(C)緯度方向の動物の明視野画像。緯度の向きのための解剖学的ランドマーク:外陰部は側面に面しています。(D)Cと同じ動物の緯度方向のニューロンの蛍光画像。(E)動物のより深い(遠い)側での再生(矢印)を伴う向き。(F)目的に近い浅い側の動物での再生を伴う向き。再生がクリアー(矢印)。スケールバー = 20 μm。略語:DV =背腹側;lat = 横方向。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ディスカッション
チャネリング寒天パッドの主な利点は、イメージングのために動物の向きを維持できることです。チャネルは成体動物にフィットし、カバースリップの導入時に維持される制御された回転を可能にします。野生型、ローラー型、ダンプ状の動物の画像化に成功しています。解剖学的ランドマークを使用して動物を適切に向き付け、1つの視野で複数の構造をイメージングして比較し、標的細胞を表面に近づけることができます。特に、この回転により、背側または腹側(両側図)での視覚化が容易になり、動物の左側と右側を比較できます。
これまで、これらの両側構造の可視化と比較には、3D zスタックと、より深い深さでの透過の減少を説明するための信号の潜在的な正規化が必要でした。したがって、チャネリングされた寒天によって可能になる定義された向きにより、複数の線虫間でより一貫したイメージングが可能になり、測定が改善されるはずです。これは、再生された神経線維の術後評価に特に役立ち、円周方向2など、画像化が困難な方向に成長する可能性があります。
さらに、チャネリングされた寒天は、動物がくぼみに置かれ、カバースリップの圧力を軽減し、正常な生理機能を促進するため、動物へのストレスを軽減します5。弛緩性株は装着時にねじれることがありますが、チャネルは動物全体の直線的な動物構成と回転を促進します。別の実装では、パターニングは、動物を画像化または観察するために必要な麻酔薬の量を減らすために、動物の動きを制約することもできる8。
最後に、チャネリング寒天培地技術も非常に利用しやすいです。金型製作後、チャネリング寒天パッドの作成には、通常のフラット寒天パッドの作成とほぼ同じ時間、専門知識、およびコストが必要です。PDMSモールドの作成に必要なすべてのコンポーネントは、多くの学術ラボで共通しているか、オンラインで購入しています。PDMS金型の耐久性は、ラボにとって費用対効果の高いオプションであり、長期間にわたる広範な使用に耐えることができます。PDMS金型は、何年も何百回も使用できます。17年前のカビを緩やかに劣化させたものを引き続き使用しています。金型は、必要に応じて脱イオン水で洗い流すことができる破片が入らないように、室温で容器に保管することをお勧めします。
これらの利点にもかかわらず、私たちの技術にはいくつかの制限があります。パッドに動物を配置するために使用されるピックの力は、チャネルを変形させ、動物の位置決めに影響を与える可能性があります。他の細かい操作と同様に、動物を目的の方向に配置して回転させるには時間がかかる場合があり、これにより動物の麻酔薬への曝露が増加し、ストレスが誘発される可能性があります。また、チャネルはカバースリップの配置中に空気を閉じ込めて気泡を形成することもあり、光を散乱させることでイメージングの明瞭さを妨げる可能性があります。プロトコルでバブルを最小限に抑える方法について説明します。私たちの経験では、チャネリング寒天の欠点のほとんどは、わずかなトレーニングと実践によって大幅に回避されます。
これらのチャネルを最適化するための将来の方向性には、 C.エレガンスの異なる年齢や表現型に対する異なるサイズと形状を含む、特定の実験ニーズに合わせたデザインの開発が含まれます。ナノファブリケーション10 によってカスタマイズされたチャネルサイズを作製すると、一般的なチャネル5と比較して動物への生理学的影響が軽減される可能性があります。結論として、チャネリング寒天パッドの実装により、高齢動物の不明瞭な構造の高解像度イメージングが可能になります。これらのパッドは 、C.エレガンスの配向性を維持し、イメージング品質の向上と詳細な視覚化を実現すると同時に、チャネルの支持構造による動物へのストレスを軽減します。
開示事項
著者には、開示すべき利益相反はありません。
謝辞
資金はNIH R56NS128413によって提供されました。ノア・ジョセフ(ノースイースタン・バイオエンジニアリング部門)には、ビニールレコードの処理を支援していただいたことに感謝します。この原稿について洞察に満ちたコメントをいただいたChung Laboratoryのメンバーに感謝します。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 125 mL Erlenmeyer フラスコ | Corning | 4980-125 | |
| 33 1/2 RPM または 12 インチ ロング プレイング (LP) ビニール レコード | N/A | N/ | A 個々のチャネルの深さ:50 & マイクロ;メートル、幅:200&マイクロ;m |
| 30 mLプラスチックシリンジ | Fisher Scientific | 50-793-817 | |
| 90% Platinum, 10% Iridium Wire | Tritech Research | の作成に使用される | PT-9010 |
| アマゾン | N/A | ||
| 塩化カルシウム | ッシャーサイエンティフィ | AAL131910B | |
| ガラス板 | N/A | N/A | 7 in x 5 in glass pane からフレーム |
| ガラスピペット | フィッシャーサイエンティフィック | 13-678-20A | の作成に使用 |
| Thermofisher | SP88857104 | ||
| Magnesium Sufeate | Fisher Scientific | AA3333736 | |
| 顕微鏡スライド | マッケソン | 938360 | |
| 分子生物学グレードの寒天 | ベンチマークサイエンティフィック | A1705 | |
| リン酸カリウム二塩基性 | フィッシャーサイエンティフィック | P290-500 | |
| リン酸カリウム一塩基性 | フィッシャーサイエンティフィ | P285-500 | |
| ジ化ナトリウム | フィッシャーサイエンティフィック | AAJ2161022 | |
| 塩化ナトリウム | フィッシャーサイエンティフィック | BP358-212 | |
| スクエアカバーガラス | フィッシャーサイエンティフィック | 12-541-016 | |
| キャップ284-F(ファストキュア)シリコーンエラストマー封止剤キット、透明、光学的に透明、10:1ミックス、500 gm / ML(0.5 kg)、シルガード184および類似のものよりも速い | MicroLubrol | N/A | |
| 真空デシケーター | フィッシャーサイエンティフィック | 08-648-100 | |
| 計量皿 | フィッシャーサイエンティフィック | 01-549-750 |
参考文献
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