Method Article

超音波ローカリゼーション顕微鏡を用いたラット脳微小血管系の2次元超解像可視化

DOI:

10.3791/67813

⸱

March 28th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Fudan University, 2Academy for Engineering and Technology, Fudan University, 3School of Information Science and Technology, Fudan University, 4State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Fudan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、ラットの脳微小血管系を画像化するために12.5μmの空間分解能を達成する超音波局在顕微鏡(ULM)のプロトコルについて説明します。血流の方向や速度を詳細に可視化し、脳循環や血管疾患の研究を進めるための強力なツールを提供します。

Abstract

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大脳の微小血管系は、脳の機能を維持するために不可欠な血管の複雑なネットワークを形成しています。脳卒中、アルツハイマー病、神経膠腫、血管性認知症などの病気は、微小血管系を深く混乱させる可能性があります。残念ながら、現在の医用画像モダリティは、このスケールで間接的な観察しか提供していません。光学顕微鏡に着想を得た超音波局在顕微鏡(ULM)は、浸透深さと空間分解能の間の古典的なトレードオフを克服します。注入された個々のマイクロバブル(MB)をサブ波長の精度で位置特定および追跡することにより、血管および速度マップをマイクロメートルスケールで生成できます。ここでは、市販の超音波プラットフォームを使用して、ラットの脳微小血管系を in vivo で超解像イメージングするための堅牢なプロトコルを紹介します。この手法は、12.5μmの空間分解能を達成し、微小血管の構造を再構築し、血流の方向と速度に関する詳細な情報を提供することで、脳の微小循環の理解を大幅に向上させます。このプロトコルはラット疾患モデルに拡張することができ、神経血管疾患の早期診断と治療のための強力なツールを提供します。

Introduction

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大脳の微小血管系は、毛細血管、細動脈、細静脈から構成され、栄養の送達、酸素交換、老廃物の除去を促進することで脳の機能を維持するために不可欠です1,2。このネットワークの混乱は、脳卒中3、アルツハイマー病4、神経膠腫5、血管性認知症6などの神経障害に関与しており、脳生理機能の障害につながります。微小血管の変化は、臨床症状の発症に先行することが多いため、診断および治療介入の重要な標的となっています7,8。血管の変化を構造レベルと機能レベルの両方で包括的に理解することは、研究と治療戦略を進めるための鍵となります。

しかし、脳の微小血管系のイメージングは、脳のサイズが小さく、脳内の部分的に深い位置にあるため、特に困難です。磁気共鳴画像法(MRI)9 やCT(CT)10などの従来の画像診断法は、大規模な血....

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Protocol

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本研究で実施される動物実験は、すべて復旦大学倫理委員会(承認番号:2022JS-004)によって承認されています。このプロトコルは、動物の人道的な扱いを確保するために、復旦大学の動物飼育ガイドラインに厳密に従っています。実験開始に先立ち、ラットには1週間の環境順応期間を与えられ、その間に十分な飼料と水が与えられます。日長は、正常な生理学的状態の維持を確保するために、それらの生物学的リズムに従って慎重に調節されます。実験の終わりに、吸入されたイソフルランの過剰摂取を使用して安楽死が行われます。

注:実験のセットアップを図1A-Hに示します。

1. ULMイメージングのための動物調製

  1. 麻酔
    1. 3.5%イソフルランと100%酸素の混合物を3 L /分の流量で投与することにより、ラットに麻酔を誘発します。約4分後、動物をチャンバーから取り出し、37°Cに予め温めたイメージングプラットフォームに伏せて置きます。 麻酔の深さは、ラットの後肢のしっかりとしたつま先のつま先つまみに離脱反射がないことによって確認されます。
    2. 麻酔システムに接続された呼吸マスクにラットの鼻を置きます。1....

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Results

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図1は、ラットにおける in vivo 脳微小血管ULMイメージングの詳細なセットアップを示しており、各要素は実験のばらつきを最小限に抑え、信頼性の高い超解像イメージング結果を得るために正確なデータ取得を確保するように慎重に設計されています。

図2A は、ラット脳の微小血管系のULM再構成構造を示しており、ブレグマ点から-1mmの位置に位置し、イメージング深度は12mmに近づいています。イメージング面全体の有効スライス厚さは、0.1mmから0.3mmの範囲です。浅い微小血管と深い微小血管の両方がはっきりと見え、奥行きが増しても画質が劣化しません(図2B)。関心領域(ROI)の破線に沿った強度分布の半値全幅(FWHM)を計算することにより、最小の13μm(図2C)を含むさまざまな直径の血管を検出できます。解像度評価にフーリエリング.......

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Discussion

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このプロトコルは、ULMを利用して、in vivoラット脳微小血管系の超解像イメージングに成功しました。他のイメージングモダリティと比較して、ULMは空間分解能と透過深度の両方に同時に対応します。ばく露したラットの脳は、頭蓋骨ではなく画像化されたため、骨の存在による減衰や歪みが回避されました。中心周波数15.625MHzのトランスデューサーの下で、約12mmの深さの血管構造が最大12.5μmの空間分解能で捕捉されました。血流の方向は、小さな動脈や静脈の特定の領域の分化を促進しました。さらに、この技術は、広範囲の流速測定(1-80 mm/s)をサポートします。

ラットに対して行われる開頭術は、このプロトコルで重要です。手術中は、過度の出血を最小限に抑えることが不可欠です。一方では、過度の出血は血液循環に影響を与える可能性があり、典型的な症状は皮質領域の血管再建の欠如です。一方、実験動物に生理的な変化を引き起こしたり、死に至らしめたりする可能性もあります。この手術で使用される定位装置は、自動化された開頭術プログラムを備.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示していません。

Acknowledgements

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この研究は、Grant 2023YFC2410903 に基づく National Key Research and Development Program of China、National Natural Science Foundation of China (Grants 12274092, 12034005)、Explorer Program of Shanghai (Grant 21TS1400200)、International Science and Technology Cooperation Program of Shanghai (Grant 24490710400)、および AI for Science Foundation of Fudan University (Grant FudanX24AI016) の支援を受けました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
アルコールDICHANGhttps://www.dehsm.com/goods-17187.html75%
ビームフォーミングプログラムモントリオール大学生物医工学研究所Matlab 超音波ツールボックス 3.4 バージョン
体温維持装置RWD Life Science Co., Ltd.69026
脳定位固定装置RWDライフサイエンス株式会社71000-R呼吸マスクに適応可能
頭蓋マイクロインジェクション手術器具キットRWD Life Science Co., Ltd.SP0005-R
デジタルマイクロスコープRWDライフサイエンス株式会社DOM-1001
ドラッグデリバリーカテーテルRWD ライフサイエンス株式会社https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/administration/draw-blood
エリスロマイシン軟膏Renhe PharmaH360200181%×15g
ガス麻酔機RWD Life Science Co., Ltd.R500IEは呼吸マスクを含む
ヘルド電動クリッパーGUAZHOUMUMJD-DTJ02
ヘルドミニ頭蓋ドリルRWDライフサイエンス株式会社78001
置針親切な企業開発グループ株式会社陽圧モデル 26グラム
ヨウ素溶液HYNAUThttps://www.hainuocn.com/index/detail/524.html4.5–5.5 g/L
IQ復調プログラムモントリオール大学生物医工学研究所Matlab 超音波ツールボックス 3.4バージョン
ソフルランRWDライフサイエンス株式会社R510-22-10
MATLABソフトウェアMathWorksバージョン R2021a
マイクロインジェクションポンプRWDライフサイエンス株式会社R462
化ナトリウム注射SHENG'AO動物製薬有限公司2700714600.90%
SonoVueBraccohttps://www.bracco.com/en-se/product/sonovue
球面ドリルビットRWD Life Science Co., Ltd.HM1027/HM1010
サポート測位ソフトウェアRWDライフサイエンス株式会社V2.0.0.30400
シリンジKindly EnterpriseDevelopment Group Co., Ltd.RWLB1 mL
トラッキングプログラムJean-Yves Tinevez2016年版
ゲルJunkang Medical Equipment Co., Ltd.モデルDS-1
プローブVERASONICS, INC.L22-14vX LF
ベラソニックス超音波装置ベラソニックス株式会社Vantage-256プラットフォーム
ハンドハンド留 イ塩超音波超音波超音波

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sweeney, M. D., Ayyadurai, S., Zlokovic, B. V. Pericytes of the neurovascular unit: Key functions and signaling pathways. Nat Neurosci. 19 (6), 771-783 (2016).
  2. Wardlaw, J. M., Smith, C., Dichgans, M. Mechanisms of sporadic cerebral small vessel disease: Insig....

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