クライオ切片による ショウジョウバエ の心臓蛍光染色のための新規で効率的な方法

サマリー

ショウジョウバエの心臓切片作製および蛍光イメージングプロトコルは、心臓の構造と病状の研究を簡素化します。このアプローチには、従来の解剖に必要な技術的専門知識をバイパスして、簡単な切片作成、染色、およびイメージングが含まれます。これにより、アクセシビリティが向上し、ショウジョウバエは、より広範な科学コミュニティ内で心臓関連研究のモデルとしてより広く利用できるようになります。

要約

ショウジョウバエ の心臓モデルは、心臓の老化の研究やヒトの心臓疾患のモデル化に広く使用されています。ただし、イメージング前の ショウジョウバエ の心臓の解剖は、高度なトレーニングと運動能力を必要とする細心の注意を払った時間のかかるプロセスです。これらの課題に対処するために、 ショウジョウバエ の心臓組織の蛍光イメージングにクライオセクショニングを利用する革新的なプロトコルを提示します。このプロトコルは、成虫の ショウジョウバエ の心臓のイメージングで実証されていますが、発達段階に適応できる可能性があります。この方法は、組織の完全性を維持しながら、蛍光染色の効率とアクセス性の両方を向上させます。このプロトコルは、イメージングの品質を損なうことなくプロセスを簡素化し、高度に発達したトレーニングと運動能力を持つ技術者への依存を減らします。具体的には、キャピラリー真空吸引のような複雑な技術を、組織包埋のようなより単純な方法に置き換えています。このアプローチにより、心臓の構造をより簡単かつ再現性よく視覚化することができます。私たちは、主要な心臓マーカーを効果的に検出し、心臓の形態と細胞組織の複雑な詳細を明らかにする高解像度の蛍光および免疫染色イメージングを達成することにより、このプロトコルの有用性を実証しています。この方法は、 ショウジョウバエ の心臓生物学を研究する研究者にとって堅牢でアクセスしやすいツールを提供し、心臓の発達、機能、および疾患モデルの詳細な解析を容易にします。

概要

心血管疾患(CVD)は、世界の主要な死因であり、毎年約1,790万人が死亡しており、世界の全死亡者の約1/3を占めています。 ショウジョウバエ(一般にショウジョウバエとして知られている)は、心臓の発達、生理学、代謝、老化、および心筋症の遺伝的、細胞的、および分子的基盤を研究するためのモデル生物として広く使用されています1,2,3,4,5,6,7,8,9。ショウジョウバエモデルは、心血管疾患の罹患率と死亡率の主要な危険因子である肥満¹⁰の全身調節における心筋の役割を研究するためにも使用されています。ショウジョウバエのゲノムシーケンシング研究¹¹は、心臓を含むさまざまな臓器の発達に関連するものを含む、ヒトの遺伝子の有意な保存を明らかにしました。これらの高度に保存された遺伝子の中には、心筋症やチャネル症などの心機能障害に関与するものもあります³。近年、心臓のパフォーマンスを研究するための効果的な技術の開発により、モデルの応用が拡大し、運動、食事^{、老化などの}要因による成人の心臓生理学の長期的な変化を調査するようになった8。ただし、技術的およびロジスティックな課題が、このモデルシステムの使用を妨げることがよくあります。心臓研究でショウジョウバエを使用する際の課題の1つは、細胞構造と心筋要素を保持する方法で心臓を正確に解剖することです。

ショウジョウバエの心臓または背側血管は、心筋細胞の単層からなる管状構造、心壁に沿って位置し、鼻の筋肉によって支持された心膜細胞、および成人では腹側縦筋細胞¹²の層を伴う。これらの繊細な構造にアクセスするための正確な解剖は、時間と労力のかかるプロセスです。現在の規格では、技術的に困難な解剖と毛細血管真空吸引が含まれており、高度なトレーニングと運動技能^{が必要です}13,14,15,16。通常、解剖は腹側体壁を切開することから始まり、心臓の微細な解剖学的構造、その壊れやすい構造、アクセスしにくい背側の位置など、課題はすぐに現れます。これを従来の解剖技術と組み合わせることで、心臓の構造と機能の正確な分析が可能になり、ショウジョウバエ¹³の心血管疾患の研究に改善されたツールを提供します。例えば、これを使用して、Alayariらはショウジョウバエの心臓構造を蛍光標識するためのプロトコルを提供し、心臓の形態と構造の可視化を促進しました。これらの努力にもかかわらず、従来の心臓の解剖と染色は、組織の完全性を維持することの難しさや、効果的な心臓染色に必要な専門的なトレーニングなど、いくつかの課題に直面しています。

この方法は、 ショウジョウバエ の胸部と腹部の凍結埋埋込とそれに続く免疫染色および蛍光イメージングを利用するより単純なプロトコルに全体の手順を置き換えることにより、この問題に対する革新的な解決策を提供します。この習得しやすいアプローチにより、心臓の構造をより迅速かつ簡単に視覚化し、再現性を高めることができます。さらに、ドライアイスを含む簡単な方法で、 ショウジョウバエ の腹部キューティクルを同じz平面上に均一に整列させ、下流のクライオセクショニングステップを合理化する方法について説明します。私たちは、免疫蛍光顕微鏡法および共焦点顕微鏡法による重要な心臓マーカー、心臓の形態、および細胞組織の検出におけるこのプロトコルの有効性を実証します。このアプローチの容易さと高い有効性は、ハイスループット のショウジョウバエベースの心臓研究に特に役立ちます。

プロトコル

1. 機器の準備

1. クライオスタットの電源がオンになっていて、-20°Cに設定されていることを確認します。 温度がこのポイントに達するのに十分な時間が経過するのを見てください。機械が周囲温度の場合、最適な切断温度への冷却には約5時間かかる場合があります。
2. スライドウォーマーまたはインキュベーターの電源を入れ、37°Cに設定されていることを確認します。 スライドが目的の温度に達するのに十分な時間があることを確認してください。
   注:この段階では、ラベル付けされたスライドをウォーマーまたはインキュベーターに置き、切片化まで無期限に放置することができます。
3. ドライアイスが使用できる状態になっていることを確認します。氷は、ステップ5に到達したら、-80°Cで貯蔵庫から取り出すことができます。

2. 溶液の調製

1. PBSを50mL調製します。PBS中の10 mMエテリングリコール四酢酸10 mLを調製します。PBS中の4%パラホルムアルデヒド溶液を調製し、最終容量が実験グループ数の100μL倍に等しくなります。
2. スプレーボトルに70%エタノールを水に溶かした洗浄液を調製します。すべての蛍光染色溶液を調製します。
   注:このプロトコルでは、単純な蛍光染色または色素を使用して簡単な染色を行う方法について詳しく説明します。この場合、PBSで1x Phalloidin 594を1:250の比率で使用する方法について説明します。蛍光染色濃度は、試薬や実験目標によって異なります。適切な濃度を見つけるために予備テストを行う必要があります。抗体染色についてはここでは詳しく説明しませんが、従来の染色法を使用して適用できるはずです。

3. ティッシュの収集

1. CO₂ フライマットを使用して5〜10匹のハエを麻酔し、顕微鏡下で1倍〜2倍の倍率でハエを視界内に配置します。CO₂ レギュレーターは、_CO2 マットに1〜5kPaで登録する必要があります。
   注:麻酔のための他の方法が利用可能(例えば、FlyNap²)そしてこれらの方法は結果に大きく影響しない。
2. スプリングハサミを使用して、首を切り落とし、翼をクリップし、5〜10匹のハエから脚を取り除きます。残っているのは胸部と腹部で、まとめて体と呼ばれます。
   注:ステップ5でフライボディを適切に位置合わせするには、残りの翼または脚の長さが金型の底に沿った平らな位置合わせを妨げてはなりません。これを達成するには、翼と脚を胸部にできるだけ近づけてクリップします。
3. ブラシを使用して、すべての実験グループが収集されるまで、氷上の標識された1.5mLチューブに体をそっと入れます。

4. 全組織の固定

1. チューブを氷から取り出した後、100 μLの10 mM EGTA(pH 8)を各チューブに加え、腹部内の心臓組織をリラックスさせます。すべての物体が10分間沈められ、オービタルシェーカーに置かれていることを確認します。卓上型遠心分離機は、遺体を水没させるのを容易にするために使用できます。
2. チューブ内の溶液を取り出して廃棄します。各チューブにPBS100μLをピペットで入れ、組織を10分間洗浄し、オービタルシェーカーに置きます。時間が経過したら取り外して破棄します。
3. PBS溶液中の4%パラホルムアルデヒド100μLを各チューブにピペットで入れます。すべてのボディが溶液に沈んでいることを確認します。
4. オービタルシェーカーに15分間置き、速度を約100単位に設定します。設定が溶液と接触しないように組織を攪拌しないことを確認してください。.
5. この時間が経過したら、PFAを廃棄し、1x PBSと10分間交換し、すべての物体が溶液に接触していることを再度確認します。残りの洗浄ごとに、ステップ4.4と同様の速度でチューブをオービタルシェーカーに戻します。
6. 毎回前の溶液を捨てて、ティッシュをPBSで2回、それぞれ10分間、合計3回洗浄します。
7. 最終洗浄を廃棄した後、体をPBS溶液中の10%スクロースに移し、チューブ内の溶液に接触するようにします。最適な飽和状態を得るには、一晩または体が底に沈むように十分に長く放置します。
   注:一晩の凍結保護が望ましいですが、同日のイメージングが必要な場合は、凍結保護剤が組織に浸潤するまでできるだけ長くしてください。

5.金型の準備

1. この時点で、保管場所からドライアイスを取り出し、小さな金属またはプラスチックのトレイに置くためにいくつかのピースを選択します。トレイの寸法は、型を挿入できるようにし、1 つの大きな、できれば平らなドライアイスの上に直接置くことができるようにする必要があります。
2. ラベル付けされた金型に約50%を最適切削温度(OCT)コンパウンドを充填します。コンパウンドをゆっくりと流すことで、気泡の導入を減らすようにしてください。
3. ブラシを使用して、本体を金型内のOCTの表面に慎重に配置します。この段階では、複数の実験グループを明確に分離する必要があります。
   注:ブラシによるショ糖溶液の汚染によるOCT化合物の希釈を防ぐことが重要です。また、ブラシを使ってOCTの奥深くに配置すると、気泡が多く発生することがあります。これらの間違いを避けて、後でセクショニングの問題を防ぎます。
4. 鉗子を使用して、胸部と腹部の背壁を通常は底に沿って、各体を型の底に押し込みます。次に、腹部が金型の底に沿って平らになるように本体を調整します。すべてのボディをX、Y、Z寸法に位置合わせして、各セクションにすべての被写体が同時に含まれるようにします。
5. 腹部、特に男性に湾曲があるかもしれません。これを技術者の能力を最大限に発揮して平らにします。これは、冠状面に長い切片を収集するために不可欠です。このプロセス中は、ボディを金型の底に穴を開けたり押しつぶしたりしないでください。各主題を正しく位置合わせるために系統的に作業します。
6. すべての被写体が所定の位置に配置されたら、型を取り、ドライアイスの上に底を直接置きます。接触後しばらくするとOCTがフリーズし始めるかどうかを確認します。すべての被写体が金型の凍結部分に包まれるまで、これを続けます。
7. この段階に達したら、金型を-20°Cに移して全体を凍結します。最初の部分が完全に固まったら、金型の残りの部分を充填します。その後、金型は-80°Cで保管し、アルミホイルで包むか、すぐにカットして後で使用できます。
   注意: 2つの凍結ステージの間に-20°Cと-80°Cの空気に開放的にさらされることは避けてくださいtages。これにより、層間に湿気が発生する可能性があります。

6. 金型のクライオセクショニング

注:一般的に、実験グループの型を切断する前に、ブランク型の準備をして切断することをお勧めします。これにより、組織切片を切片化する直前に、ホイール、ブレード、およびアンチロールガラスの適切な機能を確保できます。さらに、低温の保管から来た金型をクライオスタットに30分間順応させます。

1. ブロックにOCTをたっぷりと塗り、ビットを上に置き、平らに押して、チャックビットを金型に取り付けます。これをクライオスタットで完全に凍結させます(通常は5分以内)。
2. ビットとOCTブロックを金型から外してチャックに入れ、ブロックが上から下に適切な向きに保たれるようにします。ビットが固定されるまでチャックキーを締めます。
3. 調整ノブとチャック深さコントロールを使用して、ブロックをブレードに合わせます。切片幅を20μM以下に設定してください。
   注:収集可能なセクションの数を増やすには、セクションが薄い方が望ましいです。各被験者の最初の2〜6つのセクションには、向きとセクションの幅の関数である心臓の望ましい遮るもののない部分が含まれている必要があります。重要な2〜6セクションをカットする前に、チャックの向きを正しく把握する必要があります。
4. ゆっくりとした一貫した動きで各スライスをカットし、アンチロールガラスが各スライスをキャプチャできるようにします。温めたスライドを使用してセクションを収集します。スライドを室温で少なくとも30分間、ただし最初の洗浄ラウンドの1時間前に乾燥させます。

7. 蛍光染色

1. 乾燥期間の直後に、かみそりの刃を使用してセクションを囲む余分なOCTを取り除きます。この段階で組織に遭遇しないように注意してください。スライドを後の時点で染色する予定の場合は、-80°Cで保管してください。
2. 疎水性マーカーを使用して、各スライドでこの境界線の輪郭を描きます。この境界線は、洗浄液と染色液をティッシュに保持するのに役立ちます。
   注:このプロトコルでは、ピペット法を使用して染色と洗浄を行う方法の概要を説明しており、スライドバケツとラックも使用できます。スライド上部の溶液をピペッティングする方法を、スライドをそれぞれの新鮮な溶液に沈めるだけでいいのです。最近、脳イメージング¹⁷で行ったように、免疫染色法は心臓染色にも適用できる。
3. すべてのスライドをPBSでそれぞれ5分間3回洗浄し、スライドの上部で優しくピペッティングし、可能な限りティッシュの上で直接ピペッティングしないようにします。これは、1000 μLピペットと関連するチップを使用して行います。溶液を急激に噴射すると、スライドの表面から組織が放出される可能性があるため、避けてください。
4. 最終洗浄液を廃棄し、蛍光染色液(1:250、1x Phalloidin)を組織にピペットで移します。これを暗所で室温で1時間インキュベートします。
5. この時点以降、被験者は光過敏性になります。その後のすべての手順は、暗闇の中で、またはスライドを覆って実行します。蛍光染色を捨て、1000 μLピペットを使用して、PBSで5分間3回洗浄します。

8. イメージングのマウントと準備

1. 最終洗浄を廃棄し、スライドに少量のPBSを残します。1000 μLピペットを使用して、1000 μLピペットを使用して、封入剤をスライド上に3〜5滴し、組織に直接展開しないようにします。
2. カバーガラスをスライドに置き、気泡の発生を最小限に抑えます。簡単にするために、鉗子を使用してカバースリップを一方の端に置き、スライドと同じ高さになるまでもう一方の側を徐々に下げます。取り付けたばかりのスライドは取り扱いに注意し、4°Cで少なくとも24時間平らに保管してください。
3. スライドはマニキュアでシールするか、封入剤が硬化している場合は避けてください。ネオンやグリッターを含むマニキュアは使用しないでください。蛍光染色によっては、すぐにイメージングを行うか、後でキャプチャするためにスライドを保存することができます。

9. イメージング

注:画像キャプチャには、10倍、40倍、および60倍のレンズを備えたオリンパスBX63顕微鏡を使用しました。DAPI、脂質スポット488、およびファロイジン594の適切なフィルターも使用しました。

1. イメージングする前に、スライドを検査し、ティッシュペーパーと水溶液中の70%エタノールを使用してスライドを洗浄します。取り付け直後にスライドが写っている場合は、カバースリップを邪魔しないよう清掃に十分注意してください。
2. 実験全体の中で最も明るい蛍光を発する被験者に基づいて、各チャンネルの適切な露光時間を選択します。彩度が高すぎるのを避けながら、できるだけ明るい画像を生成し、背景を減らします。各チャネルのライブビューを使用して各実験グループを迅速に調査し、曝露が適切に設定されていることを確認します。
3. 一貫性を保つために、すべての科目で同じチャネルを使用して、各科目に焦点を当てます。次に、各被写体をキャプチャします。比較に使用したすべての実験グループを同じ日にキャプチャして、比較したグループ間の蛍光減衰の違いを回避します。
4. イメージング後、スライドを4°Cの暗所で保存し、後で画像を再取得します。

結果

上記の方法は、面倒な解剖をせずに蛍光イメージングを使用して ショウジョウバエ の心臓の研究を容易にします。これがこの方法の主な利点であり、従来の心臓解剖法では複雑な運動能力の発達が必要です。 図1に示すように、この方法は新しい研究者にとって心臓解剖よりも親しみやすく、実験の柔軟性を可能にします。あるいは、OCT金型段階で-80°Cの保管を使用することで、試料を何週間も後で使用するために保管することができます。技術者は、簡単な解剖と埋め込みの技術を学ぶのに十分な期間訓練を受ける必要がないため、この方法は非常に利用しやすくなっています。

オスティア、弁、縦線維(支持線維)、円周線維(収縮性線維)などの ショウジョウバエ の心臓の顕著な特徴は、 図2でこの方法を使用して保存されていることが見られます。心臓の中核的な構造成分の保存は、老化や病的な状態において最も重要です。心臓の収縮構造を超えて、私たちの方法は、人間の肝臓

ディスカッション

私たちは、蛍光イメージングまたは共焦点イメージングを使用して視覚化するためのショウジョウバエ心臓管を準備するための効率的なプロトコルを開発しました。これに先立って、ショウジョウバエの心臓の細胞学的完全性にアクセスし、モニタリングするために一般的に使用されるが時間と労力のかかる方法について議論します。当社の革新的で効率的な方法は、ショウジョウバエの心臓管の構造的完全性を維持する直接クライオ埋め込み法を利用することにより、従来のアプローチに代わる簡潔で効率的な方法を提供します。ショウジョウバエの解剖学的構造を視覚化するための顕微鏡技術を使用する際には、構造的完全性を維持することが重要な段階であり、関心のある特定の組織または器官に適合させる必要があります。以前の方法には、顕微鏡による解剖とそれに続く固定と染色が含まれますが、これは面倒で特定の専門知識が必要です^2,13,15

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1000 &マイクロ;L ピペット	Eppendorf	3123000063
1000 & micro;L ピペットチップ	Olympus Plastics	23-165R
10X リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	Fisher	J62036.K7	ph=7.4
200 プルーフ エタノール	Decon Laboratories	64-17-5
20X Tris Buffered 生理食塩水	Thermo Scientific	J60877.K2	pH=7.4
アンチロールガラス	IMEB	AR-14047742497
ウシ血清アルブミン	フィッシャー	9048-46-8
遠心チューブ 1.5 mL	フィッシャー	05-408-129
チャージスライド	グローブサイエンティフィック	1415-15
クライオセクショニングモールド	フィッシャー	2363553
クライオスタット	ライカ	CM 3050 S
クライオスタット ブレード	C.L. スターキー	DT554N50
ドライアイス
ファイン フォーセプス	ファイン サイエンス ツール	11254-20
フライ パッド	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
Vectashield	H-1800
Kimwipes		34120
顕微鏡	リンパス	SZ61
最適な切断温度コンパウンドフィ	ッシャー4585
パラホルムアルデヒド20%	電子顕微鏡科学	15713
ロイジン594	アブノバ	U0292
ミソリの刃グレイ	ビー	#40475
春はさみ	ファインサイエンスツール	15000-10
ショ糖	フィ	ッシャーS5-500