Method Article

海馬錐体ニューロンにおける役割のための位置特異的GABAA 受容体サブユニットミスセンス変異体の同定と分類

DOI:

10.3791/67833

⸱

June 6th, 2025

 , 
1Department of Molecular Biology and Genetics, Faculty of Engineering and Natural Sciences, Üsküdar University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究では、DNAからタンパク質機能、神経挙動までを網羅するマルチスケールのフレームワークを導入しています。これは、GABAA 受容体サブユニットで予測される病原性変異を調査するための新しいアプローチを提示し、病原性として予測されるてんかん原性突然変異と近位突然変異がCA1錐体ニューロンモデルに同様の影響を与える可能性があると仮定しています。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

てんかん関連遺伝子における機能的に未知の変異体の影響を理解することは、疾患の病態生理学を解明し、個別化された治療法を開発するために重要です。DNA配列からタンパク質機能、神経挙動に至るまでのマルチスケールフレームワークを用いて、GABAA 受容体サブユニットのてんかん原性変異とその周辺で予測された変異がCA1錐体ニューロンモデルに同様の影響を与える可能性があると仮定し、病原性突然変異を予測および調査するための新しいアプローチについて説明します。予測される病原性変異と近位てんかん原性変異との間の特徴的な関係を調査することにより、この研究は、てんかん原性突然変異が海馬錐体ニューロンシミュレーションに及ぼす影響に基づいて、予測される突然変異の影響を推定することを目的としています。

この方法論は、GABAA 受容体γ2サブユニットの遺伝データの収集から始まり、その後、カスタムスクリプトを使用してRでデータのクリーニングとフォーマットを行います。次に、アンサンブル予測子を適用して、 γ2 サブユニットの病原性ミスセンス変異体を特定し、優先順位を付けます。てんかん原性突然変異が共有するサブユニット構造ドメインに特定の病原性変異体(予測)をマッピングする方法を、その影響の分子モデリングと進化的保存の考察とともに説明します。次に、バリアント固有のメタアナリシスとパラメーターの正規化が実行され、続いて相関分析が行われ、予測された突然変異と近位てんかん原性突然変異との間の有意な関係が特定されます。Pythonベースの神経シミュレータを用いて、野生型およびてんかん原性変異体の影響を反映したマルチコンパートメントコンダクタンスベースのニューロンモデルについて述べる。てんかん原性GABAA 受容体サブタイプによって生成される神経応答のシミュレーションは、予測された病原性変異が神経応答に及ぼす影響を大まかに推定するために考慮されます。私たちの知る限り、これは、てんかん研究に不可欠な神経行動に対するGABAA 受容体変異体の影響を推定するためのマルチスケールフレームワークを探求する最初のプロトコルです。このプロトコルは、てんかんに関連するGABAA 受容体の潜在的に病原性の変異体によって引き起こされる細胞表現型の予測を強化するための基盤として役立ちます。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ほぼすべてのヒトの疾患において、遺伝的変異は個人の感受性に重要な役割を果たしています。したがって、配列の変動が疾患リスクとどのように関連しているかを理解することは、疾患の発症に関与する主要なプロセスを明らかにし、予防と治療のための新しいアプローチを特定するための貴重な方法を提供します1。これは神経発達障害にも当てはまり、小児プライマリケアで最も一般的な慢性疾患にランクされています2。自閉症スペクトラム障害、知的障害、てんかんなどの状態は、遺伝的変異が発達中の個々の感受性にどのように大きく影響するかを示しています3。

発達中の脳は、興奮と抑制の間の重要なバランスにおける遺伝的にプログラムされた神経発達の不一致により、成人の脳よりもてんかん発作にかかりやすいです4。成体脳の主要な抑制性神経伝達物質であるGABA(γ-アミノ酪酸)は、胚発生時および出生後早期に興奮性であるため、若年脳の発作を予防するために必要な安定性には適していません。K-Cl共トランスポーター5の十分な発現の欠如によって引き起こされるこの一時的な状態は、機能不全のGABAA受容体の存在下での発作活性のリスク増加に寄与し得る。GABAA受容体は、Cl-イオンの細胞内濃度に応じて、GABAの興奮性および抑制性作用を媒介します6。したがって、脳が成熟するにつれて、GABAA受容体をコードする遺伝子や他のイオンチャネルの変異が興奮性を歪め、ニューロン代謝、細胞シグナル伝達、およびシナプス形成に関与する遺伝子の変異7が、小児期の不在てんかん8のような状態を引き起こす可能性があります。

臨床介入では、神経発達障害の治療精度を向上させるために、遺伝子解析をますます活用するようになっています2。小児てんかんにおける遺伝子検査は、精密医療アプローチの潜在的な標的を提示し9、治療決定を導く上での遺伝的変異の重要性を強調しています。さらに、 de novo 変異を有するてんかん患者の~25%は、精密医療の潜在的な標的を特定する遺伝子診断を受けており、治療決定を導く上での遺伝的変異の有意な価値を強調しています10。これは、標的遺伝子パネル、全エクソームシーケンシング、全ゲノムシーケンシングなどの次世代シーケンシング技術の進歩によって促進され、遺伝子発見が劇的に加速しました11。しかし、新たな遺伝子発見の数が増えると、その結果、疾患の病因における変異体の分子的役割に関する矛盾する証拠や不十分な情報を反映した分類である重要性不明の変異体(VUS)が生まれると、課題が伴います。VUSとして分類された多様体は、American College of Medical Genetics and Genomics(ACMG)およびAssociation for Molecular Pathology(AMP)によって提案された5段階の変異分類システム内の1つのカテゴリーに対応する12。

機能的に未知の遺伝的変異の課題に対処するには、臨床診療と研究という2つの主要な側面にわたる取り組みが必要です。臨床的には、VUSを取り巻く不確実性は、患者の管理と意思決定を複雑にする可能性があります13。科学研究の観点からは、重要性が不明な変異体の増加の中から病原性変異を特定し、疾患の病態生理学および表現型への影響におけるそれらの役割を決定することが重要です1。理想的なシナリオの1つは、機能的に特徴付けられていないすべてのバリアントの分子レベル、ニューロンレベル、およびネットワークレベルの影響を正確に予測し、それによって実験室ベースの研究に必要なリソース、時間、および労力を最小限に抑えることです。これらの側面は、遺伝的てんかんの正確な診断を可能にし、個別化治療をサポートし、潜在的な薬理学的標的の発見を促進するために、遺伝的変異を正確に分類することの重要性を強調しています。現在の予測ツール14、15、16、17は比較的正確ですが、典型的には二項分類(病原性対良性)しか提供せず、分子病態生理学、表現型の結果、および根本的なメカニズムに関する疾患固有の洞察を欠いています。本論文では、選択されたGABAA受容体サブユニットコード遺伝子の未知のミスセンス変異に着目し、分子的、進化的、構造的側面などの変異体の文脈的要因を取り入れることによる研究指導の強化と、てんかん関連変異のin vitro生物物理学的データから導き出された神経病理学のシミュレーションを提示する。私たちの方法論は、てんかんの病態生理学に関与する主要なサブユニットであるGABAA受容体のγ2サブユニットの未知の病原性変異体の同定に取り組んでいます18,19,20。これに続いて、これらの予測された変異体と、構造的および電気生理学的データによって特徴付けられるてんかん関連変異との位置特異的なマッチングの調査が行われます。次に、これらのデータを使用して、γ2、α1、およびβ3サブユニット(γ2-GABAA受容体)で構成されるGABAA受容体サブタイプを発現する海馬錐体ニューロンのモデルに対するバリアント効果を推定します6。GABAA受容体は大きなサブユニットプール(α1-α6、β1-β3、γ1-γ3、δ、Ε、θ、π、およびρ1-ρ3)から集合し、サブユニット組成に応じて、GABAA受容体は、その調節、生物物理学的特性、ならびに特定の機能と結合した地域的、細胞的、および細胞内発現パターンが異なることに注意することが重要です6,21,22,23。24、25。したがって、本研究では、γ2-GABAA受容体またはγ2含有GABAA受容体のみに焦点を当てています。

GABAA受容体サブユニットは、長いN末端細胞外ドメイン(ECD)、4つの膜貫通ドメイン(TM1〜TM4)、TM1とTM2をつなぐ細胞内リンカー、TM2とTM3をつなぐ細胞外リンカー、TM3とTM4の間の大きな細胞内ループ(TM3-TM4ループ)、および短い細胞外C末端6,26という特徴的な構造的特徴で構成されています。27.GABAA受容体は、複雑な「ロックアンドプル」メカニズムを介して機能し、GABA結合がβサブユニットとαサブユニットをロックし、サブユニットの細胞外ドメイン(ECD)を引っ張らせ、それらを反時計回りに回転させることが示唆されている27。この動きは膜貫通ドメイン(TMD)を曲げ、それによってイオンチャネル27を開く。したがって、チャネル活性は、GABAA受容体内の構造カセットと共に調整されているように見えます。てんかんの突然変異は、これらの構造カセットの歪みを介してチャネル活動の機能不全を引き起こすことがわかった28。したがって、私たちの研究は、GABAA受容体サブユニットの特定の構造カセットで機能的に同定されたてんかん原性変異に近接する予測された病原性変異が、これらのてんかん原性変異の場合に観察されるように、チャネル機能における電気生理学的または生物物理学的歪みのパターンと同様のパターンを示す可能性があるという考えに基づいています。GABAA受容体サブユニット28におけるてんかん原性構造カセットの存在は、この概念を間接的に支持しているが、我々の研究は、てんかん原性突然変異の生物物理学的パラメータと予測された病原性突然変異のものとを相関させることの複雑さと課題を示している。これらの複雑な関係を明らかにするために、私たちのフレームワークは、DNAからタンパク質機能、てんかん研究に不可欠な神経行動に至るまでのマルチスケールアプローチを強調しているため、重要です。このアプローチは、計算遺伝学を分子モデリングおよび神経シミュレーションと統合すると同時に、大規模なデータセットで学習された機械学習など、チャネル構造、活動、神経興奮性に対する突然変異の影響を捉えることができる補完的な方法の重要性を強調しています。さらに、海馬錐体ニューロンモデル上でのてんかん原性γ2-GABAA受容体活性のシミュレーションにより、GABAA受容体チャネルパチーに関連するin vitro細胞表現型の複製と、ネットワーク機能障害の中心における単一ニューロン応答の変化の実証が可能になります。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 病原性多様体の インシリコ 予測

  1. バリアント データ収集
    1. ClinVarデータベース29を使用して、ウェブサイトを通じて、目的の遺伝子のコード領域における有意性不明(VUS)の変異体を検索する:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/。検索バーに遺伝子記号( GABRG2など)を入力し、結果をフィルタリングして、一塩基やミスセンスバリアントなど、意義が不明な目的のタイプのバリアントのみを含めます。 data.xlxs (補足ファイル4:補足表S1)をダウンロードして保存します。ダウンロードしたデータの日付を記録します。
      注:現在のプロトコルでは、GABAA 受容体のヒトγ2サブユニット、特に ホモサピエンス γ-アミノ酪酸A型受容体サブユニットγ2(GABRG2)、転写産物バリアント1、mRNA(NCBI参照シーケンス:NM_198904.4)、γ2Lとしても知られています。計算方法が異なれば識別子も異なる場合があるため、目的遺伝子の参照転写産物と他の対応する識別子を異なるデータベース(UniProt、ENSEMBL、PDB)に記録することが重要です(補足ファイル4:補足表S2)。データベースまたは計算ツールがシーケンス識別子のバージョン番号を認識しない場合は、バージョン番号のある ID (NM_198904.4) とバージョン番号のない ID (NM_198904) の両方を試してください。
    2. 参照タンパク質の基本情報
      1. NCBIデータベース https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ で、検索オプションからNucleotideを選択し、目的遺伝子のNCBI Ref. seq. ID(NM_198904.4)を入力します。次に、右側の列を下にスクロールして、関連情報カテゴリの下のタンパク質をクリックして、転写産物NM_198904.4によってコードされたタンパク質(NP_944494.1)を見つけます。NP_944494.1のタンパク質について与えられた情報を用いて、特定の領域の配列位置を表の形で記録します(Supplementary File 4: Supplementary Table S3)。
        注:機能的および構造的に重要な領域、モチーフ、またはタンパク質ドメイン、リン酸化部位、リガンド結合部位、および分子相互作用インターフェースなどの残基の配列位置に関する予備的な既知の情報を決定することが重要です。これは、データベース(NCBI、ENSEMBL、UniProtなど)と文献検索を組み合わせることで実現できます。
  2. バリアント データ編成
    1. 選択した予測子の入力要件を満たすようにデータを整理します。取得されるデータの形式が、dbNSFP サーバ http://database.liulab.science/dbNSFP の要件に一致するように編成されていることを確認します。これを行うには、data.xlsx ファイル (ステップ 1.1.1 の補足ファイル 4: 補足テーブル S1 ) から不要な列を削除し、次の列のみを指定した順序で保持します。
      「GRCh38染色体」、「GRCh38場所」、「名前」、「タンパク質の変化」。
    2. 新しいファイル名「data1.xlsx」(補足表S4)でファイルを保存します。コードを実行して 、data1.xlsx ファイルをRでフォーマットします(補足ファイル1:Data_GABAA。R) は、書式設定されたデータを data1_output.xlsx (補足ファイル 4: 補足表 S5) として R プロジェクトに関連する作業ディレクトリに保存します。
      注:計算方法が異なれば、必要なデータタイプと形式も異なります。特定の形式要件に従ってデータを収集および整理すると、たとえ 12 個のバリアントであっても、エラーが発生しやすく、時間がかかる可能性があるため、バリアント プールが少数のバリアントのみで構成されていない限り、この手順は重要です。そうすれば、手動でのデータ整理が可能になるかもしれません。
  3. 病原性予測
    1. data1_output.xlsxファイルの内容を、http://database.liulab.science/dbNSFP 経由でアクセスするアカデミックバージョンのdbNSFPサーバー30,31に転送します。これを行うには、ファイルをコピー/貼り付けるか、.txt形式で直接アップロードします。
    2. 送信前に、HG38 (ゲノムビルド)、ClinPred32、BayesDEL33 の各オプションが事前に選択され、サーバーで確認されていることを確認してください。数分以内に、サーバーが結果を生成します。
      注:本プロトコルでは、2つのアンサンブル予測器、すなわちBayesDEL33およびClinPred32が、高精度34および実用性のために選択された。しかし、dbNSFPデータベース30,31で利用可能なAlphaMissenseのような他の予測子も選択することができる。インシリコツールの選択は、強力な予測12のための十分な複数行の計算証拠の生成など、いくつかの要因に依存する。複数の予測アルゴリズムの分析を統合したアンサンブル予測子は、この目的を果たすことができます。
    3. 出力ファイル(.txt形式)をダウンロードし、data2.xlsx(補足ファイル4:補足表S6)として保存します。
    4. data2.xlsx(補足ファイル4:補足表S6)でフィルターを設定するには、メニューのフィルターオプションをクリックし、Dをフィルタリングして両方の列のコンセンサスバリアントを決定します。これにより、最も病原性の高い変異体のリストが表示されます。保存します(補足表S6[補足ファイル4]の「コンセンサス」タブを参照)。
  4. バリアント選択
    1. コンセンサス病原性予測の中で、文献から得られたてんかん原性突然変異の近接性における変異体を決定します。後者がニューロンモデリングに適した構造的および生物物理学的パラメータを持っていることを確認します。
      注:このステップは探索的であり、その構造的、物理化学的、および生物物理学的パラメータの観点から目的のタンパク質を調査することにも関連しています。本研究では、これらのデータは、てんかんに関連する突然変異の調査に加えて、Brüngerら35およびGuoら36から取得されました。また、オプションとして、AlphaMissense37のスコアは、dbNSFPデータベース30,31からステップ1.3(補足ファイル4:補足表S7)を繰り返してアクセスした。詳細については、プロトコールのセクション2.1.1および2.1.2、および結果(「構造的および生物物理学的パラメータのクラスタリングバリアント」を参照)に記載されています。
    2. 基本的な可視化のために、Protter38 ((https://wlab.ethz.ch/protter/start/)およびHOPE39 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/)サーバーを使用して、選択したGABRG2 遺伝子変異(P302L40 およびK328M)(または39残基シグナルペプチドを除く場合はK289M41)のコンテキストで前のステップのバリアントを調べます。
      注:非常に複雑なため、バリアント効果の構造評価は、複数の分析レベルで実施する必要があります。Protter38 のようなツールを使用すると、タンパク質のトポロジカル特性のコンテキストでバリアントを明確に視覚化でき、HOPE39 などのユーザーフレンドリーなサーバーを使用すると、分子モデリングによってバリアントの影響に関する洞察が得られます。さらに、てんかんに関連する突然変異に関する情報を特定し、統合するためには、目的のタンパク質の包括的な文献レビューが重要です。
    3. 進化的保存と構造的洞察の解析
      1. Open Jalview 42,43,44は、タンパク質の編集、視覚化、および分析のためのオープンソースプログラムです。
      2. アラインメント用のシーケンスをインポートします。トップメニューの 「ファイル 」をクリックします |シーケンスをフェッチします。ダイアログボックスで データベース を選択します(UniProtなど)。 「IDの取得 」タブをクリックします。ダイアログボックスの説明に従って、ヒトおよび他の脊椎動物種由来の目的の遺伝子(GABRG2)のUniProtアクセッションIDを入力します:P18507、P22723、Q6PW52、A0A2I3TKX0、F1RR72、A0A8I3MDZ2、A0A8M1P4D6。 [OK] をクリックします。
        注:GABRG2によってコードされるタンパク質のUniProtアクセッション番号は、ホモサピエンスのP18507(P18507-2)、Mus musculusのP22723、Pan troglodytesのA0A2I3TKX0、Sus scrofaのF1RR72、Canis familiarisのA0A8I3MDZ2、Danio rerioのA0A8M1P4D6です。
      3. 目的の遺伝子によっては、一部の配列にアノテーションが付かない場合があります。したがって、BLAST 検索を実行して関連情報と潜在的な同族体を特定し、文脈の理解を深めます。この場合、FileメニューのAdd Sequences/FromテキストボックスオプションからFASTA形式のタンパク質配列をアップロードし、目的の配列の複数の配列アラインメントを作成します。
      4. アラインメントが読み込まれたら、表示されたシーケンスを観察して、複数のシーケンスを比較します。各行はシーケンスを表し、各列は整列内の位置を表します。最適な位置合わせ方法を決定するには、さまざまな方法を使用します。たとえば、シーケンスメニューのWebサービスをクリックし、プリセットでT-Coffeeを実行するオプションを選択すると、最適なアライメントが可能になります。
      5. 配列 P18507 Homo sapiens (本研究の参照配列)を右クリックし、 参照配列として設定します。上部メニューで[ フォーマット ]を選択し、[ 折り返し ]をクリックして、画面内の完全な配置を視覚化します。同じフォーマットメニューで、 上のスケール をクリックして、特定の残留物番号の視覚化を強化します。視覚化をさらに強化するには、[ 色 ]に移動し、さまざまなオプション(例:Clustal Color、Chemical Property)を選択して配色を調整します。必要に応じてフォントサイズを変更します。
      6. メニューバーの 「計算 」をクリックし、「 コンセンサスの自動計算 」を選択して、保存された領域を強調表示します。
      7. インシリコ予測ステップで特定された関心のあるバリアントの位置に焦点を当て、特定のバリアントの位置を調べます。特定の残基に注釈を付けるには、それらを右クリックして [注釈の追加] を選択します。ラベル(バリアントIDなど)に適切なカラーコードを記入して保存します。
        注:本解析では、P302L(紫)とA303T(赤)を選択し、構造データとともにマルチプルシーケンシングアラインメントで可視化しました(次項参照)。
    4. 選択された保存された残基を示す全タンパク質の三次元再構成
      1. 前の手順で取得したファイルで、参照配列(GABRG2 ヒト)を右クリックし、 3D構造データを選択します。
      2. ドロップダウンメニューから適切な構造データ(7QNE、Chain C)26 を特定し、 Jmolで新しい構造ビューを開くを選択します。
        注:これにより、3D化学構造のオープンソースのJavaベースのビューアであるJmolによって、マルチプルシーケンスアラインメントで選択された残基を構造データに組み込むことができます。

2. パラメータ選択と生物物理学的モデリング

  1. バリアント固有のメタアナリシスとパラメーターの正規化
    1. 現在の文献を調査して、電気生理学的データチャネルコンダクタンス(gGABAA)、不活性化時間(τ不活性化)、立ち上がり時間(τ立ち上がり)、および最大電流振幅(Imax)で特定されたサブユニットバリアントを収集します。各ケースのサブユニット組成、細胞型、および野生型の測定値を提供します。バリアントとそのコントロールをそれに応じてラベル付けします(たとえば、生物物理学的特性が特定されたバリアントで知られており、各バリアントの野生型測定値の既知のコントロール)。
    2. 同定された生物物理学的特性を持つバリアントの AlphaMissense 病原性スコアを取得します。
      注: 詳細については、プロトコルのセクション 1.3 を参照してください。
    3. 各バリアントのサブユニットとアミノ酸の位置、元のアミノ酸と変更されたアミノ酸、病原性スコア、および文献から得られた生物物理学的パラメーターを含むデータフレームを作成します。実験の不一致を避けるために、同定されたバリアントの生物物理学的パラメータを野生型測定値のx倍変化として正規化します。
  2. 構造特性と機能特性による比較バリアント解析
    1. 予測されたバリアントをデータ フレームに整理します。それに応じてラベルを付けます(たとえば、生物物理学的特性に関する文献がない変異体について予測されます)。
    2. アミノ酸配列と三次構造における位置によってバリアントを分類します。データフレームに構造分類パラメータ(アルファヘリックス、コイル、ベータシート、細胞外ドメイン、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、細孔内ライニング、アゴニスト結合、タンパク質間相互作用など)を追加し、各バリアントのアミノ酸位置に関する情報を提供します。
    3. メンブレンの中心と細孔軸までの距離によってバリアントを分類します。データフレームの細孔軸に距離を追加し、メンブレンの中心パラメーターまでの距離を追加します。
    4. 既知のバリアントに対する構造的および生物物理学的パラメータ間の相関関係を解析します。可能であれば、得られた相関関係に対して予測されたバリアントを評価します。
  3. Synapseおよびニューロンモデルの構築
    1. Pythonで開発されたオープンソースのニューラルシミュレータであるBrian245を使用して、スパイクニューラルネットワークのモデリングとシミュレーションを行い、マルチコンパートメントコンダクタンスベースの海馬錐体ニューロン上のGABA作動性シナプスのマルチコンパートメント生物物理学モデルを構築します。
    2. イオンチャネルゲーティング速度論、パッシブ パラメーターとアクティブ パラメーター、シナプス後コンダクタンスを定義することで、コンダクタンスベースのモデルを設計します。モデルで使用される方程式を記述した 補足ファイル2に示されているように、コンダクタンスベースのモデルを定義します。
      1. 膜容量(Cm)を1 μF/cm2 、細胞内抵抗(RA)を200 Ω.cmに設定します。
      2. 海馬錐体ニューロン39 の修正ホジキン・ハクスリー型コンダクタンスをgL= 0.0003 S/cm2、gK= 0.036 S/cm2、EL = -76.5 mV、ENa = 50 mV、EK = -90 mVで使用します。
      3. gNa 上の NaV チャネルの密度分布を、体細胞で 0.05 S/cm2、軸索初期セグメント (AIS) およびランビエ節 (NR) で 0.5 S/cm2、樹状突起で 0.005 S/cm2 に調整します。有髄セグメントでgKとgNaを0とします。
      4. NaV およびKV のイオンチャネルゲーティング速度論を、 補足ファイル2に記載のとおりに構築します。
      5. コンパートメント内のすべてのグルタミン酸作動性シナプスとGABA作動性シナプスの合計としてシナプス電流(Isyn)を導入します。グルタミン酸作動性電流(Iglu)には、高速AMPA受容体媒介電流(IAMPA)と低速NMDA受容体媒介電流(INMDA)の両方を含めます。GABA作動性電流(IGABA)には、高速のGABAA受容体媒介電流のみを含めます。シナプス前スパイクごとに一定量のグルタミン酸がシナプスに放出されると仮定します。したがって、受容体の活性化はスパイク時間に依存し(sAMPAおよびsNMDA)、総受容体コンダクタンス(gAMPAおよびgNMDA)は、すべてのイベントによって放出されるグルタミン酸の量を反映します。
      6. 補足ファイル2で説明されているように、シナプスモデルを使用します。
        注: 方程式の詳細な説明については、モデルで使用される方程式について説明している 補足ファイル 2 を参照してください。
    3. 体細胞と神経突起の実験的に測定された直径、および各神経突起コンパートメントの長さと分岐パターンを以前の文献46,47から取得します。細胞を複数のコンパートメントに分割することにより、実際のニューロンの形態をマルチコンパートメントモデルに縮小し、主要な分岐構造を正確に保持し、両側の対称性を維持します。
    4. 形態を設定します(セグメントの長さと直径、つまり、d_soma:30μm、l_AH:5μm、d_AH_i:1.5μm、d_AH_f:1.3μm、l_AIS:40μm、d_axon:1μm、l_myseg:100μm、l_NR:2μm、l_AxTer:4μm、d_AxTer:2μm、l_approx:100μm、l_apmed: 100μm;l_apdis:200μm;d_approx_i:4μm;d_approx_f:3μm;d_apmed:2μm;d_apdis:2μm;l_apLM:70μm;d_apLM:2μm;l_nAcDbasal:400μm;d_nAcDbasal:1.4μm;l_nAcDbasal_stem:20μm;d_nAcDbasal_stem:1.5μm)およびPythonスクリプト(補足ファイル3:GABAAvar.py)にも詳述されているように、ピラミッドニューロンモデル46,47の各コンパートメントの生物物理学的パラメータ(セクション2.3.2で与えられているように)。
    5. ステップ2.1.1で得られた野生型制御測定値を評価することにより、GABA作動性シナプスモデルの生物物理学的パラメータを決定します。
  4. ニューロンモデルのトポロジーを設計し、以前に取得した形態学的および分岐情報に基づいて、コンパートメントの空間的配置と相互接続の指定を含む形態学的および生物物理学的パラメータを割り当てます。 補足ファイル3:GABAAvar.py で概説されているように、適切な形態学的パラメータ(セグメントの長さと直径など)と生物物理学的パラメータ(セクション2.3.2)をモデルの各コンパートメントに割り当てます。
  5. シナプスの構築と電流注入
    1. 「GABAAvar.py」(補足ファイル3)に記載されているように、SpikeGeneratorGroup(Brian2ライブラリのクラス)を使用してシナプス前アクティビティを作成します。Synapses クラスを使用して、スパイク ジェネレーターをモデル ニューロンのターゲット コンパートメントに接続し、シナプス結合をモデル化します。
    2. 持続定電流(Iinj)を0.85 nAに設定し、 補足ファイル3:GABAAvar.py で概説されているように、特定の時間にベースラインイオン電流負荷によって駆動されるサブスレッショルド活動を模倣するように体細胞に配置します。
  6. 記録モニターを構築するには、StateMonitor を使用してターゲット コンパートメントから電圧トレースを記録します。
  7. ネットワークを構築して実行します。
    1. Network を使用して、モデル ニューロン、接続、およびモニターを使用してネットワークを構築します。
    2. defaultclock.dt でシミュレーションのタイム ステップを設定します (例: 0.01 ms)。
    3. network.run(T*ms) を使用してネットワーク上でシミュレーションを実行します (この例では T を 1,000 ミリ秒に設定)。
  8. GABAA 受容体ミスセンス変異の影響の検証
    1. ステップ2.1.1で収集した生物物理学的パラメータを通じて、各ミスセンス変異がチャネル動態に与える影響を定義します。
    2. これらのパラメータを変更してスティミュレーションを実行し、"GABAAvar.py"(補足ファイル3)に示されているように"matplotlib.pyplot"を使用して結果をプロットします。
  9. パラメータの組み合わせをテストして、発砲パターンと発射率の変化を分析します。比較のために結果をプロットします。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究では、てんかんの病態生理学における重要な構成要素であるGABAA 受容体のγ2サブユニットの病原性変異を予測および特徴付けるために、マルチスケールアプローチを利用しています。このアプローチは、予測モデル、分子モデリング、進化保存、構造検査、相関分析、および神経シミュレーションの使用を通じて、てんかん研究やおそらく臨床使用に重要な関連性を持つ変異の分類を強化します。方法論の全体的な要約を 図 1 に示します。

隣接する2つのγ2サブユニット変異の比較評価

GABAA 受容体サブユニットのてんかん原性変異に隣接する予測された病原性変異が、チャネル機能と神経行動に同様の電気生理学的影響をもたらす...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この論文で紹介したアプローチは、計算遺伝学、分子モデリング、神経シミュレーションの組み合わせを適用することで、GABAA受容体変異体の分類を改善する可能性を秘めており、てんかん研究と臨床応用の両方に貴重な洞察を提供します。予測される病原性変異の同定と優先順位付けのための包括的な分析が提示され、タンパク質に対するバリアント効果と細胞表現型との間のギャップを埋める可能性のあるフレームワークに拡張されます。てんかん原性GABAA受容体活性が海馬錐体ニューロンシミュレーションに与える影響を評価することで、GABAA受容体機能障害に関連するin vitro表現型の再現と、ネットワーク機能障害の根本における単一ニューロン応答変化の実証が可能になります。てんかん原性突然変異によって生成される神経応答のこれらのシミュレーションに基づいて、構造的に近位に予測された突然変異の機能的影響の大まかな推定が検討されました。予測された突然変異がチャネル動態に及ぼす影響を予測するには、既知のバリアントセットによる徹底...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての著者は、この作品に関連する利益相反がないことを宣言します。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

モデルニューロンの構築に協力してくれたÇağlaKocaに感謝します。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ブライアン2 ソルボンヌ大学、INSERM、CNRS、Institut de la Vision、フランス。インペリアル・カレッジ・ロンドン、イギリス2.8.0.4Stimberg et al., 2019 (https://pypi.org/project/Brian2/ )
dbNSFP サーバー  Genos Bioinformatics LLC、米国v3.0Liu et al., 2020 (http://database.liulab.science/dbNSFP) (https://sites.google.com/site/jpopgen/dbNSFP)
希望  分子および生体分子情報学センター CMBI、ラドバウド大学、オランダ 1.1.1Venselaar et al., 2010 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/)
ジャルビュー  ダンディー大学、英国JV2Waterhouse et al., 2009 (https://www.jalview.org/)
Jupyter Notebookプロジェクト・ジュピター(米国)https://jupyter.org/install 
フィトンPython Software Foundation、米国3.13https://www.python.org/downloads/
プロッター  チューリッヒ工科大学(スイス)バージョン 1.0Omasits, et al., 2014 (https://wlab.ethz.ch/protter/start/)
R R Foundation for Statistical Computing、米国Rバージョン4.3.2  https://www.r-project.org/ 
RStudioPosit software、PBC、米国RStudio 2023.12.1+402 「オーシャンストーム」リリースhttps://posit.co/downloads/

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Claussnitzer, M., et al. A brief history of human disease genetics. Nature. 577 (7789), 179-189 (2020).
  2. Savatt, J. M., Myers, S. M. Genetic testing in neurodevelopmental disorders. Front Pediatr. 9, 526779(2021).
  3. Hoischen, A., Krumm, N., Eichler, E. Prioritization of neurodevelopmental disease genes by discovery of new mutations. Nat Neurosci. 17, 764-772 (2014).
  4. Holmes, G., Ben-Ari, Y. The neurobiology and consequences of epilepsy in the developing brain. Pediatr Res. 49, 320-325 (2001).
  5. Rivera, C., Voipio, J., Kaila, K. Developmental switches in GABAergic signalling: the K+-Cl- cotransporter KCC2 and carbonic anhydrase CAVII. J Physiol. 562, 27-36 (2005).
  6. Goetz, T., et al. GABA(A) receptors: structure and function in the basal ganglia. Prog Brain Res. 160, 21-41 (2007).
  7. Guerrini, R., et al. Monogenic epilepsies: disease mechanisms, clinical phenotypes, and targeted therapies. Neurology. 97 (17), 817-831 (2021).
  8. Matricardi, S., et al. Current advances in childhood absence epilepsy. Pediatr Neurol. 50 (3), 205-212 (2014).
  9. Sands, T. T., Choi, H. Genetic testing in pediatric epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 17 (5), 45(2017).
  10. Møller, R. S., et al. The contribution of next generation sequencing to epilepsy genetics. Expert Rev Mol Diagn. 15 (12), 1531-1538 (2015).
  11. Møller, R. S., et al. From next-generation sequencing to targeted treatment of non-acquired epilepsies. Expert Rev Mol Diagn. 19 (3), 217-228 (2019).
  12. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 17 (5), 405-424 (2015).
  13. Rehm, H. L., et al. The landscape of reported VUS in multi-gene panel and genomic testing: time for a change. Genet Med. 25 (12), 100947(2023).
  14. Katsonis, P., et al. Genome interpretation using in silico predictors of variant impact. Hum Genet. 141 (10), 1549-1577 (2022).
  15. Arslan, A. Pathogenic variants of human GABRA1 gene associated with epilepsy: a computational approach. Heliyon. 9 (9), e20218(2023).
  16. Abdullah, N. K., Arslan, A. Integrated bioinformatic approach for precision medicine: prediction of human GABRG2 gene pathogenic variants, characterized with cellular pathology and epilepsy phenotype severity. SDU J Nat Appl Sci. 28 (33), 300-315 (2024).
  17. Arslan, A. Algorithmic assessment reveals functional implications of GABRD gene variants linked to idiopathic generalized epilepsy. Int J Neurosci. 135 (5), 533-543 (2025).
  18. Kang, J. Q., Macdonald, R. L. Molecular pathogenic basis for GABRG2 mutations associated with a spectrum of epilepsy syndromes, from generalized absence epilepsy to Dravet syndrome. JAMA Neurol. 73 (8), 1009-1016 (2016).
  19. Komulainen-Ebrahim, J., et al. Novel variants and phenotypes widen the phenotypic spectrum of GABRG2-related disorders. Seizure. 69, 99-104 (2019).
  20. Lorenz-Guertin, J. M., et al. γ2 GABA(A)R trafficking and the consequences of human genetic variation. Front Cell Neurosci. 12, 265(2018).
  21. Korpi, E. R., Gründer, G., Luddens, H. Drug interactions at GABA(A) receptors. Prog Neurobiol. 67 (2), 113-159 (2002).
  22. Rudolph, U., Möhler, H. GABA-based therapeutic approaches: GABAA receptor subtype functions. Curr Opin Pharmacol. 6, 18-23 (2006).
  23. Whiting, P. J. GABAA receptors: a viable target for novel anxiolytics. Curr Opin Pharmacol. 6, 24-29 (2006).
  24. Arslan, A. Extrasynaptic δ-subunit containing GABAA receptors. J Integr Neurosci. 20 (1), 173-184 (2021).
  25. Arslan, A. Distinct roles of gamma-aminobutyric acid type A receptor subtypes: a focus on phasic and tonic inhibition. J Neurobehav Sci. 2, 72-76 (2015).
  26. Sente, A., et al. Differential assembly diversifies GABAA receptor structures and signalling. Nature. 604 (7904), 190-194 (2022).
  27. Masiulis, S., et al. GABAA receptor signalling mechanisms revealed by structural pharmacology. Nature. 565 (7740), 454-459 (2019).
  28. Hernandez, C. C., Macdonald, R. L. A structural look at GABAA receptor mutations linked to epilepsy syndromes. Brain Res. 1714, 234-247 (2019).
  29. Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Res. 46 (D1), 1062-1067 (2018).
  30. Liu, X., Jian, X., Boerwinkle, E. dbNSFP: a lightweight database of human non-synonymous SNPs and their functional predictions. Hum Mutat. 32 (8), 894-899 (2011).
  31. Liu, X., et al. dbNSFP v4: a comprehensive database of transcript-specific functional predictions and annotations for human nonsynonymous and splice-site SNVs. Genome Med. 12 (1), 103(2020).
  32. Alirezaie, N., et al. ClinPred: prediction tool to identify disease-relevant nonsynonymous single-nucleotide variants. Am J Hum Genet. 103 (4), 474-483 (2018).
  33. Feng, B. J. PERCH: a unified framework for disease gene prioritization. Hum Mutat. 38 (3), 243-251 (2017).
  34. Tian, Y., et al. REVEL and BayesDel outperform other in silico meta-predictors for clinical variant classification. Sci Rep. 9 (1), 2204(2019).
  35. Brünger, T., et al. Conserved patterns across ion channels correlate with variant pathogenicity and clinical phenotypes. Brain. 146 (3), 923-934 (2023).
  36. Guo, F., et al. Identifying protein-protein interface via a novel multi-scale local sequence and structural representation. BMC Bioinformatics. 20 (Suppl 15), 483(2019).
  37. Cheng, J., et al. Accurate proteome-wide missense variant effect prediction with AlphaMissense. Science. 381 (6664), eadg7492(2023).
  38. Omasits, U., et al. Protter: interactive protein feature visualization and integration with experimental proteomic data. Bioinformatics. 30 (6), 884-886 (2014).
  39. Venselaar, H., et al. Protein structure analysis of mutations causing inheritable diseases: an e-Science approach with life scientist friendly interfaces. BMC Bioinformatics. 11 (548), 548(2010).
  40. Hernandez, C. C., et al. Altered channel conductance states and gating of GABAA receptors by a pore mutation linked to Dravet syndrome. eNeuro. 4 (1), (2017).
  41. Baulac, S., Huberfeld, G., Gourfinkel-An, I. First genetic evidence of GABA(A) receptor dysfunction in epilepsy: a mutation in the γ2-subunit gene. Nat Genet. 28 (1), 46-48 (2001).
  42. Waterhouse, A. M., et al. Jalview version 2-a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics. 25 (9), 1189-1191 (2009).
  43. Troshin, P. V., et al. Java bioinformatics analysis web services for multiple sequence alignment-JABAWS:MSA. Bioinformatics. 27 (14), 2001-2002 (2011).
  44. Troshin, P. V., et al. JABAWS 2.2 distributed web services for bioinformatics: protein disorder, conservation and RNA secondary structure. Bioinformatics. 34 (11), 1939-1940 (2018).
  45. Stimberg, M., Brette, R., Goodman, D. F. M. Brian 2, an intuitive and efficient neural simulator. eLife. 8, e47314(2019).
  46. Traub, R. D., et al. A model of a CA3 hippocampal pyramidal neuron incorporating voltage-clamp data on intrinsic conductances. J Neurophysiol. 66 (2), 635-650 (1991).
  47. Hodapp, A., et al. Dendritic axon origin enables information gating by perisomatic inhibition in pyramidal neurons. Science. 377 (6613), 1448-1452 (2022).
  48. Abdulzahir, A., et al. Changes in memory, sedation, and receptor kinetics imparted by the β2-N265M and β3-N265M GABAA receptor point mutations. Int J Mol Sci. 24 (6), 5637(2023).
  49. Fisher, J. L. A mutation in the GABAA receptor alpha1 subunit linked to human epilepsy affects channel gating properties. Neuropharmacology. 46 (5), 629-637 (2004).
  50. Gallagher, M. J., et al. The juvenile myoclonic epilepsy GABAA receptor alpha1 subunit mutation A322D produces asymmetrical, subunit position-dependent reduction of heterozygous receptor currents and α1 subunit protein expression. J Neurosci. 24 (24), 5570-5578 (2004).
  51. Hernandez, C. C., et al. Dravet syndrome-associated mutations in GABRA1, GABRB2 and GABRG2 define the genetic landscape of defects of GABAA receptors. Brain Commun. 3 (2), fcab033(2021).
  52. Lin, S. X. N., et al. Correlations of receptor desensitization of gain-of-function GABRB3 variants with clinical severity. Brain. 147 (1), 224-239 (2024).
  53. Krampfl, K., et al. Molecular analysis of the A322D mutation in the GABA receptor α-subunit causing juvenile myoclonic epilepsy. Eur J Neurosci. 22 (1), 10-20 (2005).
  54. Shen, D., et al. De novo GABRG2 mutations associated with epileptic encephalopathies. Brain. 140 (1), 49-67 (2017).
  55. Janve, V. S., et al. Epileptic encephalopathy de novo GABRB mutations impair γ-aminobutyric acid type A receptor function. Ann Neurol. 79 (5), 806-825 (2016).
  56. Scheller, M., Forman, S. A. Coupled and uncoupled gating and desensitization effects by pore domain mutations in GABAA receptors. J Neurosci. 22 (19), 8411-8421 (2002).
  57. Hernandez, C. C., et al. GABAA receptor coupling junction and pore GABRB3 mutations are linked to early-onset epileptic encephalopathy. Sci Rep. 7 (1), 15903(2017).
  58. Homanics, G. E., et al. A gain-of-function mutation in the GABA receptor produces synaptic and behavioral abnormalities in the mouse. Genes Brain Behav. 4 (1), 10-19 (2005).
  59. Jatczak-Śliwa, M., et al. GABAA receptor β2E155 residue located at the agonist-binding site is involved in the receptor gating. Front Cell Neurosci. 14 (2), 2(2020).
  60. Đurišić, N., et al. SAHA (vorinostat) corrects inhibitory synaptic deficits caused by missense epilepsy mutations to the GABAA receptor γ2 subunit. Front Mol Neurosci. 11, 89(2018).
  61. Bai, Y. F., et al. Pathophysiology of and therapeutic options for a GABRA1 variant linked to epileptic encephalopathy. Mol Brain. 12 (1), 92(2019).
  62. Macdonald, R. L., et al. Mutations linked to generalized epilepsy in humans reduce GABA(A) receptor current. Exp Neurol. 184 (Suppl 1), S58-S67 (2003).
  63. Buhr, A., et al. Functional characterization of the new human GABA(A) receptor mutation β3(R192H). Hum Genet. 111 (2), 154-160 (2002).
  64. Jumper, J. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  65. Sperk, G., et al. GABA(A) receptor subunits in the rat hippocampus I: immunocytochemical distribution of 13 subunits. Neuroscience. 80 (4), 987-1000 (1997).
  66. Connor, J. X., et al. A GABAA receptor α1 subunit tagged with green fluorescent protein requires a β subunit for functional surface expression. J Biol Chem. 273 (44), 28906-28911 (1998).
  67. Kittler, J. T., et al. Analysis of GABAA receptor assembly in mammalian cell lines and hippocampal neurons using γ2 subunit green fluorescent protein chimeras. Mol Cell Neurosci. 16 (4), 440-452 (2000).
  68. Oflaz, F. E., Son, ÇD., Arslan, A. Oligomerization and cell surface expression of recombinant GABAA receptors tagged in the δ subunit. J Integr Neurosci. 18 (4), 341-350 (2019).
  69. Arslan, A., et al. Cytoplasmic domain of δ subunit is important for the extra-synaptic targeting of GABAA receptor subtypes. J Integr Neurosci. 13, 617-631 (2014).
  70. Lombardi, J. P., et al. Visualizing GABAA receptor trafficking dynamics with fluorogenic protein labeling. Curr Protoc Neurosci. 92 (1), 97(2020).
  71. Gadhia, A., et al. Functional analysis of epilepsy-associated GABAA receptor mutations using Caenorhabditis elegans. Epilepsia Open. 9 (4), 1458-1466 (2024).
  72. Ritter, D. M., et al. In silico predictions of KCNQ variant pathogenicity in epilepsy. Pediatr Neurol. 118, 48-54 (2021).
  73. Holland, K. D., et al. Comparison and optimization of in silico algorithms for predicting the pathogenicity of sodium channel variants in epilepsy. Epilepsia. 58 (7), 1190-1198 (2017).
  74. Leong, I. U., et al. Assessment of the predictive accuracy of five in silico prediction tools, alone or in combination, and two metaservers to classify long QT syndrome gene mutations. BMC Med Genet. 16, 34(2015).
  75. Tang, B. Optimization of in silico tools for predicting genetic variants: individualizing for genes with molecular sub-regional stratification. Brief Bioinform. 21 (5), 1776-1786 (2020).
  76. Dong, C., et al. Comparison and integration of deleteriousness prediction methods for nonsynonymous SNVs in whole exome sequencing studies. Hum Mol Genet. 24 (8), 2125-2137 (2015).
  77. Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nat Genet. 46 (3), 310-315 (2014).
  78. Anderson, D., Lassmann, T. An expanded phenotype centric benchmark of variant prioritisation tools. Hum Mutat. 43 (5), 539-546 (2022).
  79. Roy, R., Al-Hashimi, H. M. AlphaFold3 takes a step toward decoding molecular behavior and biological computation. Nat Struct Mol Biol. 31, 997-1000 (2024).
  80. Hollingsworth, S. A., Dror, R. O. Molecular dynamics simulation for all. Neuron. 99 (6), 1129-1143 (2018).
  81. Imrie, F., et al. AutoPrognosis 2.0: democratizing diagnostic and prognostic modeling in healthcare with automated machine learning. PLOS Digit Health. 2 (6), e0000276(2023).
  82. Zhu, S., et al. Structure of a human synaptic GABAA receptor. Nature. 559 (7712), 67-72 (2018).
  83. Sun, C., Zhu, H., Clark, S. Cryo-EM structures reveal native GABAA receptor assemblies and pharmacology. Nature. 622, 195-201 (2023).
  84. Scott, S., Aricescu, A. R. A structural perspective on GABAA receptor pharmacology. Curr Opin Struct Biol. 54, 189-197 (2019).
  85. Kim, J. J., et al. Shared structural mechanisms of general anaesthetics and benzodiazepines. Nature. 585 (7824), 303-308 (2020).
  86. Stimberg, M., et al. Equation-oriented specification of neural models for simulations. Front Neuroinform. 8, 6(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

GABAa Receptor VariantsMissense VariantsEpileptogenic MutationsHippocampal Pyramidal NeuronsPathogenic Mutation PredictionMolecular ModelingNeural SimulationEnsemble PredictorsEvolutionary ConservationConductance Based Model

Related Articles