膵管細胞株におけるpH変化を伴うがん遺伝子発現解析

サマリー

この研究では、膵管細胞株のRNA-seq解析を通じて、pHの変化ががん遺伝子発現に及ぼす影響を調査するためのプロトコルについて説明します。

要約

がん関連死の4番目に多い原因である膵管腺がん(PDAC)は、5年生存率が12%です。この疾患は予後が不良で、硬直した間質微小環境を特徴としており、これが治療における具体的な課題となっています。慢性膵炎患者は、PDACを発症するリスクが10倍高くなります。これらの患者では、重炭酸塩の機能不全と炎症性環境により、管のpHがpH8.0からpH6.0に低下します。私たちの目標は、慢性膵炎で観察される酸性環境が膵管細胞株のがん遺伝子発現に果たす役割を理解することでした。

したがって、80%のコンフルエントなヒト膵管上皮細胞をpH 6.0〜pH 7.2で6時間インキュベートした。細胞からの全RNAをプロセシングして、サンプル中の全mRNAを濃縮しました。遺伝子発現は、生物学的複製物の次世代シーケンシング(NGS)によって評価されました。RNA-seq解析はオンラインツールを用いて実施され、差次的に発現する遺伝子(FCs < ± 2.0)が同定されました。pH 6.0、6.5、7.0では、それぞれ90、148、109個のアップレギュレーション遺伝子と、20個、14個、23個のダウンレギュレーション遺伝子がありました。4つのがん遺伝子がpH 6.0でアップレギュレーションされ、7つのがん遺伝子がpH 6.5でアップレギュレーションされ、7つのがん遺伝子がpH 7.0でアップレギュレーションされました。pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0でアップレギュレーションされた一般的な遺伝子は、リンパ球細胞特異的タンパク質-チロシンキナーゼ(LCK)[pH 6.0、FC:2.93、pH 6.5、FC:2.93、pH 7.0、FC:3.32]、FGRがん原遺伝子、Srcファミリーチロシンキナーゼ(FGR)[pH 6.0、FC:4.17、pH 6.5、FC:5.25、pH 7.0、FC:5.09]、およびArfGAP With SH3ドメイン、 アンキリンリピート、およびPHドメイン3(ASAP3)[pH 6.0、FC:2.37、pH 6.5、FC:3.84、pH 7.0、FC:2.51]。酸性環境は、がん原遺伝子の活性化を引き起こし、慢性膵炎の腫瘍開始を引き起こす可能性があります。

概要

膵管腺がん(PDAC)は、がんの原型がんの1つであり、関連する死亡者数でがんの中で4位にランクされています¹。PDAC患者では死亡率が高いことは明らかであり、最近の研究では、5年生存率はわずか12%です。慢性膵炎、膵臓^の炎症を引き起こす疾患2の患者は、PDAC^を発症する可能性が高くなります(約15〜16倍)。CPには、アルコール関連、遺伝性、特発性CPなど、病因の異なるさまざまなタイプ^{があります4。}CP中に存在する条件は、石灰化した結石の形成、がん細胞の発生、さらには糖尿病につながることが知られています。PDACの有病率は、遺伝性慢性膵炎の患者で高くなっています⁵。

CP患者の膵臓内のいくつかの生理学的状態は、他の病気の開始に有益である可能性があります。これらには、炎症性環境、活性消化酵素、および膵液の酸性pHが含まれます⁶。炎症は臓器の正常な機能に混乱を引き起こすため、炎症の分野では幅広い研究が行われています^7,8,9。しかし、pH調節の不均衡は、細胞の制御されていない増殖の開始を引き起こす可能性のある別の現象である¹⁰。健康な人の膵液はアルカリ性であり、胃によって生成される酸性の粥を中和するのに役立ちます。対照的に、CP患者では重炭酸塩の分泌が不十分なため、膵液は酸性のままです。低レベルの重炭酸塩は、ジュースを完全に中和することができず、その結果、ダクト¹¹内にわずかに酸性の環境が生じる。

以前の研究では、がん細胞が酸性環境に適応し、酸性環境で増殖することが示されています¹²。そのような場合、慢性膵炎の過程中に存在する状態は、これらの細胞の増殖および転移にとって好ましい環境を示唆している¹³。したがって、私たちの研究は、ヒト膵管細胞の形態学的変化を評価し、わずかに酸性条件下でのがん遺伝子発現を評価することを目的としていました。

プロトコル

1. 細胞株の復活

1. ヒト正常膵管細胞株(HPDEC/H6C7)を調達し、新鮮な培地で細胞を蘇生させます。
   1. 細胞を37°Cの水浴で解凍します。
   2. 新たに調製した完全な培地をシリンジフィルターを使用してろ過します。
      注:完全な培地には、10%のウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコの改変イーグルス培地(DMEM)が含まれています。
   3. 6 mLの完全培地を新しい15 mLのコニカルチューブに加え、解凍した細胞懸濁液を加えて十分に混合します。
   4. 懸濁液を1,800 × g で6分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットに培地1mLを加え、穏やかに混ぜます。
      注:培養液には、10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペン/連鎖球菌抗生物質を含むDMEMが含まれています。
   5. 4 mLの培地を含むT-25フラスコに細胞を滴下し、37°C、5%CO₂でインキュベートします。

2. 培地のpHの変更

1. 表 1 に示すように、pH 値が 6.0、6.5、7.0 の 0.5 M リン酸ナトリウム緩衝液ストック溶液 100 mL を調製します。
2. pHメーターでpHを確認し、1 N HCl/1 M NaOHを使用して調整します。
3. 0.45 μmシリンジフィルターを使用して、層流エアフローフード内のバッファーをフィルター滅菌します。
   注:バッファーは、さらに使用するまで4°Cで保存できます。
4. pH 6.0、6.5、7.0 の培地を調製するには、pH 20 mL の滅菌 0.5 M リン酸ナトリウム緩衝液 (それぞれの pH を含む) を 80 mL の培地に加えます。
5. pHを変更した培地を85〜90%のコンフルエントなヒト膵管細胞に添加し、明視野顕微鏡で1時間間隔で6時間間隔で形態学的変化を確認します。

3. RNA単離

注:細胞からのRNA単離には滅菌手袋を使用し、表面は100%エタノールを使用して除染する必要があります。

1. 培地を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞をすすぎます。
2. プレートを氷の上に置き、PBSをウェルに加え、セルスクレーパーでセルをこすり落とします。
   注意: 添加されるPBSの量は、スクレイピングのためにセルを覆うのに十分である必要があります。PBSを大量に追加する必要はありません。
3. 懸濁液を新しいチューブに集め、8,000 ×g で10分間遠心分離します。上清を捨てます。
4. β-メルカプトエタノールを含む溶解緩衝液をペレットに加え、氷上で5〜10分間ピペットで上下させます。
5. 等量の70%エタノールを溶解物に加え、十分に混合します。渦巻きにしないでください。
6. 溶液をシリカメンブレンカラムに加え、>8,000 ×g で30秒間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。
7. 洗浄バッファーをサンプルに加え、>8,000 × g で30秒間遠心分離します。空のチューブを>8,000 ×gで1分間遠心分離します。
8. 30-50 μL のヌクレアーゼフリー水をカラムに加え、室温で 5 分間放置します。カラムを>8,000 × g で5分間遠心分離します。
   注:RNAサンプルは、さらに使用するまで-20°Cで保存できます。

4. RNA-seq/トランスクリプトーム

1. RNA完全性評価
   1. バイオアナライザーでRNAの完全性を確認するには、1 μL(25-500 ng)を5 μLの色素バッファーと混合します。
   2. 溶液を500 ×g で1分間ボルテックスし、短時間遠心します。
   3. 各サンプルについてワンステップポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を72°Cで3分間実行した後、チューブを取り、氷上で2分間インキュベートしてから、バイオアナライザーで分析します。
2. rRNAが枯渇したトータルRNA
   1. 5 μgのトータルRNA、50 μLのハイブリダイゼーションバッファー、および1-3 μLのプローブ混合物を新鮮なPCRチューブに加えます。
   2. 次の手順を実行します:最初のステップ、70°Cで10分間変性します。第2ステップ、37°Cで20分間ハイブリダイゼーション。使用まで37°Cでインキュベートします。
   3. 新しいチューブに、500 μLの磁気ビーズとサンプルを加えます。溶液が透明になるまで、混合物を磁気スタンドに1分間置きます。
   4. 上清は慎重に捨てます。チューブを取り外し、ヌクレアーゼフリーの水500μLを加えてビーズを洗浄し、混合物を磁気スタンドに1分間戻します。溶液が透明になったら、上清を取り除きます。
   5. このプロセスを5〜7回繰り返します。200 μLのハイブリダイゼーションバッファーを加え、適切に混合します。チューブを37°Cで5分間保ちます。
   6. 上記の混合物に100 μLのRNAプローブを加え、穏やかに混合し、混合物を37°Cで15分間インキュベートします。
   7. チューブを短時間回転させてから、マグネットスタンドに1分間置きます。
   8. rRNAが枯渇したRNAを含む透明な上清を新しいチューブに集めます。
3. RNA断片化
   1. 新鮮なPCRチューブに、8〜10 μLのrRNA枯渇全RNA(500 ng / g)、1 μLの10xバッファー、および1 μLのRNase IIIを加えます。
   2. 軽くたたいて短時間回転させて溶液を混合します。
   3. チューブをサーマルサイクラーに37°Cで10分間置きます。
   4. 新しいチューブに5 μLの核酸結合ビーズを加え、次に90 μLの濃縮結合溶液を加えます。
   5. 上記の混合物に、30 μLのRNAフラグメントと150 μLの100%エタノールを加えます。サンプルを10回ピペッティングして混合し、室温で5分間インキュベートします。
   6. 溶液が透明になるまで、チューブを磁気スタンドに置きます。上清を取り除き、廃棄します。
   7. チューブを磁気スタンドに置いた状態で、ビーズを150μLのエタノールで洗浄します。混合物を30秒間放置してから、上清を取り除きます。
   8. チューブを磁気スタンドに1〜2分間放置して、残りのエタノールを蒸発させます。
   9. 12 μLの予熱したヌクレアーゼフリーの水をビーズに加え、サンプルを10回ピペッティングして混合します。
   10. サンプルを室温で1分間インキュベートします。チューブを磁気スタンドに置き、上清が透明になったら収集します。
4. ライブラリー調製およびcDNA調製
   1. 断片化したRNAサンプル3 μLをPCRチューブに加え、次にハイブリダイゼーション混合物5 μLを加えます。ピペッティングで数回サンプルを混合し、サンプルを短時間回転させます。
   2. チューブをサーマルサイクラーに65°Cで10分間、続いて30°Cで5分間保持します。
   3. 上記の溶液に10 μLのライゲーションバッファーと2 μLのライゲーション酵素ミックスを加えます。反応液をサーマルサイクラーで30°Cで1時間インキュベートします。
   4. ライゲーション混合物に逆転写酵素マスターミックスを加え、70°Cで10分間インキュベートした後、氷上でインキュベートします。
5. cDNAの増幅
   1. 6 μL の cDNA (500 ng) を新しい PCR チューブに加え、46 μL のハイフィデリティポリメラーゼ酵素と 1 μL の 3' バーコードプライマーが入ったチューブから 46 μL のバーコード付き PCR ミックスを加えます。
   2. PCR条件を次のように設定します:第1ステージ、94°Cで2分間保持します。第2段階、94°Cで30秒間、50°Cで30秒間サイクルします。第3段階、94°Cで30秒、62°Cで30秒、68°Cで30秒で16サイクル。反応液を68°Cで5分間保持します。
   3. ステップ4.3.5から4.3.10を繰り返して増幅したcDNAを精製し、断片化されたRNAサンプルを前のステップで得られたPCR産物と交換します。
   4. 精製したRNAサンプルをシーケンサー(NGS)で解析し、FASTqファイルの形でデータを生成します。

5. バイオインフォマティクス

1. リンクをコピーして貼り付けることにより、オンラインで利用可能なギャラクシーツールを開きます:ブラウザの検索タブに https://usegalaxy.org。
2. このサイトに初めてアクセスするときは、 ログイン または右上隅にある 登録 オプションをクリックしてプロファイルに登録します。
3. アカウントを作成したら、公開名/ユーザー名とパスワードを入力してアカウントにログインします。
4. RNA-seq解析後に取得したFASTqファイルをアップロードするには、左側のパネルにある アップロード オプションをクリックします。
5. 左側のパネルのツールセクションからcutadaptツールを選択します。このツールは、低品質のシーケンスをトリミングします。
   注: このファイルをマッピングに使用できるようになりました。
6. 左側のパネルにある ツール ボタンをクリックして、 RNA starツールを探します。cutadaptの出力ファイルを使用し、 参照ゲノム を ヒト参照ゲノム(hg38)として選択し、 アノテーションジャンクションの周りのゲノム配列の長さ を 36に変更します。 出力を遺伝子カウント として選択し、右上隅にある 実行ツール オプションをクリックします。
   注: このツールは BAM ファイルを生成します。
7. ツールオプションからfeaturecountsツールを選択し、RNAスター解析後に取得したBAMファイルをアップロードします。読み取りフィルタリングオプションで読み取りあたりの最小マッピング品質オプションを10に設定し、右上隅にある実行ツールオプションをクリックします。
8. 右側のパネルからfeaturecount出力ファイルを開き、データをスプレッドシートにコピーします。テストで得られた読み取りカウントの数と、コマンド =log (fold change, 2) を使用してコントロールで取得した読み取りカウントの数を除算して、コントロールに対するフォールド変更を計算します。
   注: フォールドチェンジ <-2.0 はダウンレギュレーションを示し、フォールドチェンジ > 2.0 はアップレギュレーションと見なされます。

結果

形態学的変化
酸性培地でのヒト膵管細胞のインキュベーションは、細胞の形態を変化させました。コンフルエントで密集した細胞パターンにより、酸性条件下で細胞が分散し、細胞死は時間とともに顕著になります。正常な培地含有細胞と比較して、乳管細胞は縮小し、サイズが縮小しました。インキュベーションの6時間後に死亡率の劇的な変化が観察されました。24時間後、細胞数は減少し、細胞はストレス状態にあるように見えました(図1、 図2、 および図3)。したがって、インキュベーション期間は、さらなる分析の前に酸性媒体中で6時間に延長されました。

RNA-seq解析
トランスクリプトームの生のファイルは、Mendeley Data (https://data.mendeley.com/datasets/kd994sftcs/1) の DOI: 10.17...

ディスカッション

この方法は、生物学的反復細胞の非癌性ヒト膵管上皮細胞に対する酸性条件の影響を決定するために開発されました。培地のpHが変化すると、細胞はストレス状態になり、形態の変化が観察されました。細胞をpH 6.0、6.5、または7.0で24時間培養し、1時間ごとにモニターして、さらなる実験のためのインキュベーション期間を最適化しました。インキュベーションの4時間後に形態の変化が観察され、酸性pHでのインキュベーションの6時間後に細胞死亡率が上昇しました。そこで、遺伝子発現解析を進める前に、細胞を6時間インキュベートしました。

log2倍の変化を伴う差次的に発現する遺伝子(DEG)は、酸性pHが管細胞遺伝子発現に及ぼす影響を示しました。がん遺伝子LCK、FGR、およびASAP3の発現増加は、酸性pHが乳管上皮細胞遺伝子発現に及ぼす影響を示しました。酸性pH条件下でのがん遺伝子および腫瘍抑制遺伝子発現の調節不全は、pHが炎症条件下での腫瘍開始に関与している可能性があることを示...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15 mL目盛り付き遠心チューブ(ファルコン)	ターソンズ		サンプル調製に使用500031
50 mL目盛り付き遠心チューブ(ファルコン)	ターソン		サンプル調製に使用500041
Agilent 2100 バイオアナライザー機器	Agilent	Agilent G2938A	RNA品質評価用機器
抗生物質抗真菌剤溶液 100倍液体	Himedia	A002-100 mL	汚染を防ぐために使用
回転刃付きセルスクレーパー	Himedia	TCP223	細胞の掻き取りと収集
CO2 incubator	ニューブランズウィック	ギャラクシー170 S	培養物のインキュベーションに使用
ダルベッコ修正イーグルミディアム(DMEM)、高グルコース	Himedia	AL007S-500 mL	細胞の培養に使用される培地
Dulbecco's Phosphate Buffered saline 1x	Himedia	TL1006-500mL	cell washing
Galaxy	(https://usegalaxy.org)		NSGデータ処理用オンラインツール
HI FBS(原産地:オーストラリア)	Gibco	10100-147	細胞の増殖に使用
ヒト膵管上皮細胞株 (HPDEC/ H6C7)	Addex Bio	T0018001	膵管細胞株
イオン Total RNA-Seq Kit v2	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4475936	RNA サンプル調製キット
層流
Na2HPO4 Diabasic	Sigma Aldrich	S3264-250G	リン酸ナトリウムバッファーの準備
NaH2PO4 モノベーシック	Sigma Aldrich	S3139-250G	リン酸ナトリウム緩衝液の調製
NovaSeq 6000	Illumina	3376672	シーケンサー
Nunclon Delta Surface (6-well plate)	Thermo Scientific	140675	細胞の培養
冷蔵卓上遠心分離機	Thermo Scientific	Sorvall ST 8R	遠心分離に使用
RiboMinus 真核生物システム v2	Thermo fisher scientific	A15026	rRNA depletion kit
Rneasyミニキット	Qiagen	74104	細胞からTotal RNAを単離するためのキット
サーマルサイクラー	Eppendorf	E950040025	PCR reaction
ウォーターバス	Equitron	#8406M	サンプルの解凍