方法論記事

赤身および肥満マウスからの初代マウス脂肪細胞の単離と培養

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DOI：

10.3791/67846

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2025年1月24日

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1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

成熟した脂肪細胞のサイズと脆弱性は、その研究と分離に利用できる技術とツールを制限しています。ここでは、成熟したマウス脂肪細胞の単離のためのプロトコルが記載されており、これは異なる脂肪貯蔵庫およびマウスの食事療法に容易に適応することができる。

要約

脂肪組織は、主に成熟した脂質を多く含む脂肪細胞で構成されています。これらの有糸分裂後細胞は、エネルギーの貯蔵と動員、体温調節、および内分泌因子の分泌に重要な役割を果たします。カロリーの不均衡による白色脂肪組織の拡大は、既存の脂肪細胞の肥大と、脂肪細胞前駆細胞からの追加の脂肪細胞の生成の両方をもたらします。肥満による白色脂肪組織の変化(脂肪細胞に影響を与えるものを含む)は、2型糖尿病や13種類のがんなど、多くの併存疾患と関連しています。脂肪細胞が疾患にどのように寄与するかを研究する上での大きな障壁は、成熟した脂肪細胞を容易に分離して培養できないことです。この記事では、雄と雌のC57BL/6マウスの皮下脂肪および内臓脂肪貯蔵庫からマウスの痩せた脂肪細胞と肥満脂肪細胞を分離するためのプロトコルについて説明します。このプロトコールでは、単離された初代脂肪細胞を膜脂肪細胞凝集体系で最大2週間培養する方法を詳しく説明しており、共培養実験、脂肪分解アッセイ、または脂肪細胞分泌因子を含む馴化培地の収集を通じて、単離された初代脂肪細胞の機能分析を容易にします。さらに、このプロトコルでは、基底膜マトリックスドームで脂肪組織外植片を培養し、一次単離脂肪細胞をイメージングする方法を概説しています。重要なことに、このアプローチは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を使用して脂肪組織に常在する脂肪細胞前駆細胞を単離するための既存のプロトコルと統合できます。これらのプロトコルを組み合わせることで、研究者は脂肪細胞、脂肪細胞前駆細胞、および痩せたマウスと肥満のマウス、雄と雌のマウスの脂肪組織全体を機能的に研究するためのツールを提供します。

概要

米国における成人肥満の有病率は2030年までに50%に達すると予想されており1、肥満の細胞的および生理学的影響をよりよく理解することが不可欠です。肥満は、カロリーの不均衡を特徴とし、脂肪としてのエネルギー貯蔵の増加により白脂肪組織が拡大します。脂肪組織の拡大は、新しい脂肪細胞の生成(過形成)または既存の脂肪細胞のサイズの増加(肥大)の両方を通じて発生する可能性があります。どちらのプロセスも脂肪組織の拡張をもたらしますが、肥大型の拡大は代謝の健康の低下と代謝障害の発生率の増加と一致します2,3。脂肪組織の複雑さをより深く理解することで、代謝障害や、2型糖尿病やがんなどの肥満関連疾患を調節する分子メカニズムについての洞察が得られます。

脂肪組織は、エネルギー貯蔵と体温調節におけるその役割で長い間高く評価されてきました。しかし、最近では、脂肪組織が重要な代謝シグナル伝達組織として浮上し、代謝物、脂質、およびペプチドの分泌に関与しています4,5。これらの脂肪組織由来分子は、アディポカインと呼ばれ、局所的および全身的にシグナルを伝達し、エネルギー恒常性、免疫機能、血管動態などを調節することができます5,6,7。成熟脂肪細胞は、脂肪組織の細胞の約50%を占め、脂肪組織の体積の大部分を占めています8。重要なことに、脂肪細胞は多くの亜集団9,10で構成されていることが研究でわかっています。そのため、脂肪細胞前駆細胞は、性別や脂肪組織デポーなどの要因に基づいて、成熟脂肪細胞の異なる集団を生成します。これらの成熟脂肪細胞は、食事と肥満の変化によってさらに調節され、転写的に異なり、異なるパラクリンシグネチャーを発現する脂肪細胞の亜集団を作り出すことができます9,11,12,13,14,15,16 .その複雑さと生理学的重要性にもかかわらず、成熟した脂肪細胞を分離して培養する能力は、これらの細胞を研究する上で明確な障壁となっています。

現在、成熟脂肪細胞の単離に用いられている方法は、脂肪細胞前駆細胞(APC)からの分化、蛍光活性化細胞選別、遠心分離法などを用いるものですが、いずれも欠点があります。成熟脂肪細胞へのAPCのin vitroまたはex vivo分化は、成熟脂肪細胞の開発に広く使用されています。しかし、これらの人工分化細胞は、in vivoの成熟脂肪細胞の単房表現型ではなく、多数の小さな脂肪滴を含む多房性であり、大きな脂肪滴17を含む。さらに、研究により、in vitroで分化した細胞は、in vivoで見つかった単離された成熟脂肪細胞とは転写的に異なることがわかっています17。重要なことに、in vitroでの分化では、痩せた脂肪細胞と肥満の脂肪細胞の違いを捉えることができません。蛍光活性化セルソーティング(FACS)は、組織から特定の細胞集団を分離するために一般的に使用されます。しかし、成熟脂肪細胞は、その大きなサイズと壊れやすい膜のために、FACS条件下で容易に破裂する可能性があり、これは成熟脂肪細胞の分離には非効率的な方法となっています。他の既存のプロトコルでは、遊離脂質が大量に蓄積され、時間の経過とともに培養中の成熟脂肪細胞に毒性を示す可能性があります。

ここでは、白色脂肪組織からマウスの成熟脂肪細胞を単離するためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、もともとHarmsらによって確立された成熟脂肪細胞凝集体培養のプロトコルから適応されました17。しかし、ここで説明する遠心分離ベースのアプローチは、一般的な実験装置を使用し、少量(~0.5 g)の脂肪組織から脂肪細胞を効率的に分離することができます。これは容易に適応できるシステムであり、雄および雌のマウス、内臓および皮下脂肪貯蔵庫、およびさまざまな食事条件から成熟したマウス脂肪細胞を分離するための変更が含まれています。

プロトコル

記載されているすべての動物実験は、ユタ大学の動物の使用と世話に関する委員会によって承認されました。このプロトコルは、体重が20〜45gの8〜16週齢のC57BL / 6オスおよびメスマウスからの成熟脂肪細胞の分離に最適化されています。この研究で使用した試薬と機器の詳細は、 材料表に記載されています。

1. 溶液の調製

  1. コラゲナーゼバッファーを調製します。コラゲナーゼ粉末100 mg、1 M HEPESバッファー1 mL、100x P188 500 μL、1 M CaCl2 50 μL、BSA 0.05 g、Medium 199 48.45 mL を添加します。滅菌ろ過液を溶液、分注し、-20°Cで保存します。
  2. 細胞培養培地を作製します。500 mLのDMEM、50 mLのFBS、5 mLのペニシリン-ストレプトマイシン、および5 mLのL-グルタミンサプリメントを組み合わせます。.

2. マウスからの白色脂肪組織デポの採取

  1. 10 cm x 10 cm プレートに 200 μL の HBSS を各デポごとに用意し、必要に応じてコンディショニングして氷上に置きます。
  2. 動物の家から動物を回収し、施設の動物管理および使用委員会のガイドラインに従ってマウスを安楽死させます。ここでは、動物は深い麻酔下で頸部脱臼によって安楽死させられました。
  3. 必要に応じて、各マウスの重量を量り、記録します。
  4. 70%エタノールを噴霧してマウスを滅菌し、外装をコーティングします。
  5. マウスから適切な脂肪パッドを採取します18,19。
    注:組織を皿に入れる前に、皮下デポからリンパ節を取り除くように注意してください。
  6. 各脂肪の重量を量り、重量を記録します。
  7. 氷の上に用意した10cmプレートにファットパッドを入れます。

3. 白色脂肪組織外植片の調製

注: この手順はオプションです。

  1. 解剖を開始する少なくとも12時間前に、基底膜マトリックス(マトリゲル)を氷上で4°Cで解凍し、滅菌済みの200μLピペットチップ1箱を4°Cで冷やします。
  2. 冷却したピペットチップを使用して、80 μLの基底膜マトリックスを24ウェル培養プレートの各ウェルの中央にピペットで注入し、ドームを作ります(図1A)。プレートをインキュベーター(37°C、5%CO2)に30分間置き、マトリックスを部分的に固化させます。
  3. 組織を調製する:滅菌解剖ハサミを使用して、各サンプルから0.1 gの組織を秤量し、氷上のPBSに入れます。
  4. 滅菌鉗子を使用して、事前に秤量した組織を部分的に固化したマトリックスドームに埋め込みます。30 μLの基底膜マトリックスを、埋め込まれた組織の上に加えます。プレートをインキュベーターに30分間戻し、組織を基底膜マトリックスにセットします。
    注:基底膜マトリックスに組織を埋め込むことは、組織が浮遊するのではなく培養中に留まるようにするために重要です。これにより、組織の健康と品質が維持されます(図1B)。
  5. 各ウェルに1 mLの増殖培地(DMEM、10% FBS)を添加し、インキュベーターに戻します。

4. コラゲナーゼ治療

  1. 必要なコラゲナーゼ溶液の量を計算します。 表 1 を参照してください。
  2. DNaseでコラゲナーゼ溶液を調製します。コラゲナーゼ溶液1 mLあたり0.00017 gのDNaseを添加します。渦を混ぜます。
  3. かみそりの刃を使用して、組織が均一に見えるまで、分離された脂肪組織をミンチします(図2A)。ミンチ組織を滅菌済みの50mLコニカルチューブに移します。
    注意: みすぼらしすぎないでください。組織が均質でペースト状に見えると、ミンチは完了します。ミンチ不足の組織は分厚く不均一に見え、ミンチしすぎた組織は遊離脂質の放出につながります(図2B)。
  4. 調製したコラゲナーゼとDNase溶液を、ステップ4.1で計算した容量を使用して、刻んだ脂肪組織に加えます。最高速度で7〜10秒間渦を巻き、完全に結合します。50 mLのコニカルチューブを220 rpm、37°Cに設定したシェーカーに水平に置きます。
  5. 10分間振とうしながらインキュベートし、次に5秒間ボルテックスしてサンプルを確認します。完全に分解されたサンプルは、目に見える凝集塊や組織片がなく、均質に見えます。サンプルが完全に分解されていない場合は、シェーカーで分解を続け、2分ごとにチェックします(図2C)。
    注意: 消化しすぎないでください。コラゲナーゼ溶液に長時間浸漬すると、脂肪細胞が分解され、脂質が放出される可能性があります。
  6. 血清学的ピペットを使用して、消化された組織をふるいにかけ、新しい50mLコニカルに通します。組織+コラゲナーゼ溶液の量と等しい量のFBSをふるいを通して円錐形に追加し、コラゲナーゼを中和します。
    注:ろ過後、少量の組織がふるいに残ります。

5. ティッシュペーパーの洗浄

注:滅菌組織培養フードで以下のすべてのステップを完了します。

  1. 各条件について、10 mLの温かい培地を入れた1 x 15 mLチューブを調製します。
  2. ステップ4.6のチューブを300 x gで 、表1に指定された温度で3分間回転させます。
    注:遠心分離の温度は、脂肪組織が単離されたマウスの性別に基づいて変更する必要があります。これらの温度を 表1に示します。
  3. 回転後、組織が4つの層に分離することを確認します(図3A)。
    注:最上層は遊離脂質、2番目の層は成熟脂肪細胞層、3番目の層はコラゲナーゼとFBS、4番目の層は下部20,21にペレット化する間質血管画分(SVF)です。
  4. 遊離脂質の最上層を200 μLのピペットで慎重に廃棄します。
  5. 最上層を取り外した後、底部を切り取ったp1000ピペットを使用して、成熟脂肪細胞を10 mLの成長培地を含む調製した15 mLチューブに移します(図3B)。
    1. オプション:初代脂肪細胞前駆細胞(APC)を単離するには、チューブを再度300 x g で10分間回転させます。次いで、Liuら22、Choら23、または類似のものによる脂肪細胞前駆細胞の単離に進む。
  6. 成熟脂肪細胞を含む15mLチューブを、白い層が培地全体に分散するまで、3〜5回穏やかに反転させます。
  7. チューブを表1に示す温度で10分間直立させて、脂肪細胞層と培地層を分離できるようにします。
  8. 10分間の休息後、チューブを100 x g で室温で1分間回転させ、層の分離をさらに促進します。スピン後、 サンプルは図3Aに示すように再び4つの層に分離されます。
  9. 遊離脂質の最上層をピペットで取り除き、廃棄します。
  10. 5 mLシリンジに取り付けられた21 Gの針を使用して、針の底が成熟脂肪細胞層から離れるまで、針をチューブの端にスライドさせます(図3C)。針の上部とシリンジの下部が成熟脂肪細胞層を乱さないようにしてください。
  11. シリンジをゆっくりと引き上げて、培地と細胞の破片を取り除きます。
    注意: メディアを取り外すときは、針先が成熟脂肪細胞層から離れていることを確認してください。
  12. 各チューブに10 mLの培養培地を静かに加えます。
  13. 手順5.6〜5.11を繰り返します。培養液を追加しないでください。
  14. ゲルローディングピペットチップを使用して、ピペットチップをチューブの端にスライドさせて、成熟脂肪細胞層の下から残りの培地を取り除きます。

6. パッキング

  1. 細胞を100 x g で1分間、 表1に示す温度で遠心分離します。遊離脂質(細胞の上にある透明な油層)をピペットで取り除きます。脂肪細胞の下の培地をゲルローディングチップで取り除きます。脂肪細胞層の破壊を最小限に抑えるように注意してください(図4)。
  2. すべての培地と遊離脂質が除去されるまで(通常は3〜5回)、手順6.1を繰り返します。セルパックは白色で、細胞の上には目に見える遊離脂質、または細胞の下には培地が存在しない必要があります(図4)。

7. めっきおよび機能アッセイ

  1. 成熟脂肪細胞への細胞培養用プレーティング
    1. 組織培養処理した24ウェルプレートから細胞培養インサートを取り出し、メンブレン面を上にしてフードの表面に置きます。
    2. プレートのウェルを交互に1 mLの温かい培地で満たします。
    3. カットしたp200ピペットチップを使用して、ステップ6.2でパックした30 μLの成熟脂肪細胞をトランズウェルインサートの上部に置きます(図5A、B)。
    4. トランズウェルインサートを慎重に持ち上げて反転させ、24ウェルプレートのプレフィルドウェルに入れます(図5A)。プレートを37°Cに5%CO2で設定したインキュベーターに慎重に置きます。
      注:適切に充填された脂肪細胞は、上から見たときに目に見える透明な遊離脂肪滴のない不透明な層を形成するはずです(図5C)。
    5. 成熟脂肪細胞の培地を最大14日間、2〜7日ごとに交換します。
      1. ウェルから培地を取り出すには、トランズウェルを所定の位置に保持し、p200ピペットを使用して、トランズウェルインサートの側面にある小さな開口部から培地を慎重に取り出します(図5D)。
      2. 培地を取り除いたら、トランズウェルを所定の位置に保持したまま、ウェルの側壁に1 mLの培地を非常にゆっくりと加えます。
        メモ: メディアの追加と削除は、非常にゆっくりと行ってください。脂肪細胞は、培地を素早く交換すると、メンブレンから簡単に外れてしまうことがあります。
  2. 脂肪分解アッセイ
    1. ステップ3.4に記載のプレート脂肪組織外植片またはステップ7.1に記載の成熟脂肪細胞。
      注:細胞または組織は、脂肪分解アッセイを実施する前に、フェノールレッドフリー培地で少なくとも24時間培養する必要があります。
    2. 溶液調製:5 gのBSAを100 mLのDMEMに溶解することにより、DMEM(フェノールレッドなし)に5%BSAの溶液を調製します。BSAが完全に溶解するまで、穏やかに反転させて混ぜ合わせます。
      1. 制御媒体と刺激媒体の作業溶液を準備します。制御媒体の場合は、5% BSA DMEM媒体を車両と組み合わせます。刺激媒体には、5% BSA DMEM培地と5 μMのCL-316,243を組み合わせます。使用前に、コントロールメディアと刺激メディアを37°Cに温めてください。
    3. ウェルから培地を取り出し、1 mLの温かいDPBSで洗浄します。コントロールまたは刺激媒体のウェルあたり500μLをウェルに充填します。37°C、5%CO2でインキュベートします。
    4. 脂肪分解アッセイを開始してから1時間後、2時間後、4時間後、および24時間後に、各ウェルから100 μLの培地を微量遠心チューブに集め、100 μLの適切なコントロールまたは刺激培地と交換します。
      注:この時点で、サンプルは-20°Cで保存できます。
    5. 市販の無料グリセロールキット( 材料表を参照)または類似のものを使用して、グリセロール比色アッセイを実行します。
      1. キットの指示に従って試薬を調製します。
      2. サンプルを解凍し、ピペッティングで穏やかに混合します。
      3. グリセロール標準溶液を使用して、7 点、2 倍段階希釈で標準曲線を調製します。
      4. 25 μLのサンプルまたは標準試料を、透明底の96ウェルプレートの各ウェルに移します。
      5. 100 μLの遊離グリセロールアッセイ試薬を、サンプルまたは標準溶液を含む各ウェルに加えます。
      6. 室温で15分間インキュベートした後、540 nmで吸光度を読み取ります(図6A-D)。
  3. イメージング
    1. イメージングスライドを準備します。スライドを準備するには、各イメージングスペーサーから裏紙層を取り除き、スライド上に置きます。2つのイメージングスペーサーを各スライドに並べて配置できます。
    2. カットした200 μLのピペットチップを使用して、ステップ6.2でパックした脂肪細胞30 μLを微量遠心チューブに移します。
    3. 染色ミックスを準備します。PBS中の原形質膜染色溶液を5 μg/mL、Hoechstを4.5 μg/mLでサンプルあたり200 μL調製します。サンプルにステインミックスを加え、静かに振ってください。
    4. サンプルを室温で30分間染色します。サンプルを光から保護します。
    5. 染色が完了したら、サンプルを洗浄します。各サンプルに500 μL PBSを加え、穏やかに振って混ぜ合わせます。5分間放置します。100 x g で1分間遠心し、ゲルローディングピペットチップで細胞の下から培地を取り除きます。
    6. スライドを準備します。イメージングスペーサーの上面から透明なプラスチックフィルムをはがして、粘着層を露出させます。
    7. 染色した脂肪細胞のチューブにPBS500μLを加え、穏やかに混合します。
    8. 成熟した脂肪細胞が表面に浮かび上がる時間を与えないように、カットしたp200ピペットチップを使用して、イメージングスライドのスペーサー内に35μLの脂肪細胞を配置します。
    9. スペーサーにカバースリップを置きます。
    10. すぐにイメージングに進みます(図6C)。イメージングの遅れは、メンブレンマーカーの出血を引き起こす可能性があります。

結果

図2に示すように、適切なミンチ(図2B)と消化(図2C)は、無傷の成熟脂肪細胞の単離に重要です。ミンチ不足や消化不足は、結合組織からの分離が不十分なため、成熟脂肪細胞の収量が低下する可能性があります。視覚的には、これはミンチ後に糸状の組織が残っていることや、コラゲナーゼ溶液中に見える凝集塊があることで観察できます。さらに、ミンチや消化の過剰も、成熟した脂肪細胞の破裂による低収率につながります。視覚的には、これにより白色の不透明な層が失われ、大きく透明な遊離脂質層が蓄積します。不適切なレベルのミンチや消化は、脂肪細胞の分離を困難にします。

脂肪組織の適切な調製と消化により、 図3に示すように、組織が4つの異なる層に分離されます。脂肪細胞の破裂により遊離脂質が放出されることは避けられません。ただし、適切なミンチと消化により、脂肪細胞の破裂を最小限に抑えることができます。残りの遊離脂質層と培地は、脂肪細胞のパッキング中に除去されます(図4)。脂肪細胞の適切なパッキングは、成熟脂肪細胞の効率的な分離に不可欠です。遊離脂質や担体が残っていると、単離が不十分になり、プレーティング、脂肪分解、細胞イメージングなどの下流の機能アッセイに悪影響を及ぼします。

このプロトコルは、成熟脂肪細胞のクリーンな調製物を生成します。細胞イメージングおよび脂肪分解アッセイを実施して、細胞機能を評価し、成熟脂肪細胞が単離後および最大2週間の培養後に機能を保持することを実証できます。脂肪分解アッセイは、成熟脂肪細胞がβ-3アドレナリン作動性受容体の刺激時に遊離グリセロールの放出を通じて細胞シグナル伝達に応答する能力を維持することを示しています(図6A、B)。この能力は、培養で2週間後も保持され、24時間培養した脂肪組織外植片の脂肪分解活性と非常に同等です(図6C、D)。質の悪い脂肪細胞は、脂肪分解が弱まったことを示します。単離された脂肪細胞の細胞イメージングは、単一の大きな脂肪滴を含む丸くて無傷の単房性成熟脂肪細胞を示しています。質の悪い脂肪細胞の単離は、主にバースト脂肪細胞を示す大きな細胞外油滴を示します。

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図1:脂肪組織外植片の埋め込み (A)組織を埋め込む前の部分的に固まった基底膜マトリックスドームの画像。(B)不適切かつ適切な組織埋め込みの代表的な画像。組織がドームの上に部分的または完全に浮いているように見えるため、不適切な埋め込みが見られます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:脂肪組織の適切なミンチと消化のスキーマ(A)組織のミンチと消化のステップ4.2-4.6の概略図。(B)過小、最適、および過剰にミンチされた組織の代表的な画像。ミンチ不足の組織には、元の形状を保持する大きな塊があります。組織が過度にミンチされると、組織の周囲の遊離脂質が目に見えて増加し、透明で油っぽく見えます。(C)消化不良組織、最適組織、過剰消化組織の代表的な画像。消化不良の組織には、溶液中に残っている組織全体の塊が含まれています。過剰に消化された組織は、溶液からすぐに分離する大きな遊離脂質層を示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:消化された脂肪組織の層の分離。 (A)手順5.3の後に存在するレイヤーの概略図と代表的な画像。(B)カットされたピペットチップを使用して、50mLのコニカルチューブから成熟脂肪細胞層を除去します。(C)針とシリンジが成熟脂肪細胞層の下から培地を除去するための適切な技術と配置。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:成熟脂肪細胞のシーケンシャルパッキング。 成熟した脂肪細胞を詰め込んだ連続画像。遊離脂質、脂肪細胞、および培地の層が標識されています。各スピンの後、遊離脂質と培地が除去されます。これを、スピン後に培地または遊離脂質が脂肪細胞から分離しなくなるまで繰り返します。最終的な画像は、十分に詰まった成熟脂肪細胞の代表です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:成熟脂肪細胞のプレーティングと培養。 (A)成熟脂肪細胞のプレーティングの模式図。切断されたp200ピペットチップを使用して、パックされた脂肪細胞を細胞培養インサートのメンブレン上に配置します。次に、インサートを培養培地のプレフィルドウェルに反転します。(B)トランズウェルインサート上に脂肪細胞を沈着させるカットピペットチップを描いた成熟脂肪細胞のめっきの代表画像。(C)ウェルの上から見たトランズウェルでメッキされた適切に充填された脂肪細胞と十分に充填されていない脂肪細胞の概略図と代表的な画像。適切に詰まった脂肪細胞は白く不透明に見えますが、詰まりが不十分な脂肪細胞は透明な脂肪滴を形成します。(D)培地を変更するために使用される技術の概略図。p200ピペットチップを使用して、トランズウェルインサートの側壁の開口部からメディアを慎重に取り外します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:成熟脂肪細胞のイメージングと脂肪分解アッセイ。 (A,B)皮下脂肪細胞(A)および内臓脂肪細胞(B)からのグリセロール放出。脂肪細胞は、通常の食事を与えられた16週齢のC57BL/6雄マウスから単離されました。ステップ7.1で説明したように30μLの脂肪細胞を播種し、1日間または10日間培養しました。脂肪細胞を5μMのCL-316,243で1時間、2時間、および4時間処理し、上清を採取して遊離グリセロールについて分析しました。(C,D)皮下(C)および内臓(D)脂肪組織外植片からのグリセロール放出。脂肪組織は、通常の食事を与えられた18週齢のC57BL/6雌マウスから単離されました。0.1gの脂肪組織外植片を、ステップ3.1〜3.4に記載したようにプレーティングし、24時間培養した。脂肪細胞を5μMのCL-316,243で1時間、2時間、および4時間処理し、上清を採取して遊離グリセロールについて分析しました。N = A-Dの3テクニカルレプリケート。すべてのデータは平均±標準偏差です。(E)単離された皮下および内臓の成熟脂肪細胞の代表的な画像。脂肪細胞は、通常の食事を与えられた16週齢のC57BL/6J雄マウスから単離されました。脂肪細胞は、原形質膜染色(赤)およびヘキスト核染色(青)で染色されました。スケールバー:50μm;倍率:60倍。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

性ダイエット停車場ミンチの難しさコラゲナーゼ:組織比推奨消化時間(分)スピン温度洗濯温度。
女性ノーマルチャウ皮下のつらい2:112RTについて37°C
内臓中程度1:18RTについて37°C
高脂肪食皮下の易しい1:18RTについて37°C
内臓易しい1:18RTについて37°C
男性ノーマルチャウ皮下のつらい2:1144 °CRTについて
内臓中程度1:1104 °CRTについて
高脂肪食皮下の易しい1:1104 °CRTについて
内臓易しい1:1104 °CRTについて

表1:性別、デポ、および食事固有の変更。 各組織のミンチの難易度は、他のデポと比較して「簡単」、「中程度」、または「ハード」として説明されます。実際のミンチ時間は、研究者や組織によって異なりますのでご注意ください。コラゲナーゼ:ステップ4.1で調製したコラゲナーゼ+DNase溶液の分子量(mL)と組織の重量(g)としてリストされた組織比。消化時間はおおよその目安ですが、実際の消化時間はミンチや組織によって異なります。研究者は、プロトコルに記載されているように消化を評価する必要があります。スピン温度と洗浄温度は、オスマウスとメスマウスで異なります。RTは室温を示します。

ディスカッション

初代脂肪細胞は、破裂しやすいため、単離や培養が難しいことで知られており、そのサイズが大きいため、フローサイトメトリーなどの一般的な初代細胞単離ツールを使用することができません。ここで説明するプロトコルは、クリーンで機能的な成熟脂肪細胞をもたらし、さまざまなダウンストリームアプリケーションに使用できます。重要なことに、このプロトコルにより、成熟脂肪細胞を他の細胞破片や遊離脂質層から分離できるため、効果的なイメージング、培養、および脂肪分解アッセイが可能になります。このプロトコルは、間質血管画分およびAPCの単離のために公開されたプロトコル22,23と容易に組み合わせることができる。このプロトコルはまた脂肪組織からの全組織外植片の調製および培養のためのプロシージャを詳述し、脂肪分解の試金石および全脂肪ティッシュからの分泌された因子の収集のような下流の適用に使用することができる。

重要な側面には、適切なミンチ、消化、および遊離脂質層の除去が含まれます。適切なミンチを確実にするためには、プロセス全体を通して組織の視覚的な外観を注意深く監視することが重要です。組織の最適なミンチを達成するために必要な時間と労力は、脂肪組織のデポ、食事介入(高脂肪食など)、および研究者によって異なります。必要に応じて、ハサミなどの他のミンチ用ツールを組み込むことができますが、ここでは詳しく説明していません。注目すべきは、過剰にミンチすると脂肪細胞が破裂し、即時の収量が減少するだけでなく、遊離脂質層が残りの脂肪細胞に悪影響を与えるため、総収量と脂肪細胞の品質が低下するため、避ける必要があります。適切なミンチと同様に、適切な消化は、脂肪組織の貯蔵庫、食事介入、マウスの年齢などによって異なります。コラゲナーゼにDNaseを添加すると、細胞の破片から生じる可能性のある消化中の脂肪細胞の凝集を防ぐのに役立ちます。したがって、組織の消化時間は非常に変動します。提供されている消化時間の推定値は、 表1 に示すガイドとして機能します。しかし、組織が適切に消化されていることを確認する最善の方法は、プロセス全体を通して、プロトコルに記載されているように組織を目視検査することです。性別に基づいて提案されている 表1に詳述されているさまざまな遠心分離および洗浄温度は、遊離脂質層および他の細胞破片およびSVFの両方から成熟脂肪細胞を適切に分離するために不可欠です。別の温度を使用すると、凝集や脂肪細胞の破裂により成熟脂肪細胞が失われる可能性があります。

すべてのステップで遊離脂質層を除去することは非常に重要であり、これを怠ると、めっき、イメージング、および脂肪分解アッセイの下流で問題が発生します。さらに、処置全体を通して遊離脂質層が持続的に存在すると、脂肪毒性による脂肪細胞の死がさらに起こり、全体的な収量と品質に劇的な影響を及ぼします。成熟脂肪細胞単離の効率を最大化することが一般的に望まれますが、遊離脂質層を除去すると、成熟脂肪細胞の一部を犠牲にしても、プロトコールの終了時に成熟脂肪細胞の収量が全体的に増加します。

この手順の制限には、サンプルの数が含まれます。培地と遊離脂質層の除去には厳しさと時間がかかるため、この手順は通常、一度に6つのサンプルに制限されます。処理するサンプルの数が大幅に多いと、初代脂肪細胞が遊離脂質に長時間さらされ、全体的な収量が減少します。ただし、人員を増員することで、サンプル数を増やすことができる場合があります。ミンチから機能アッセイまでの時間は、培地と遊離脂質層の除去が過度に遅れると、さらに成熟した脂肪細胞が破裂するため、非常に重要です。このプロトコルは、成熟脂肪細胞の亜集団を分離する能力においてさらに制限されています。

成熟脂肪細胞を研究する現在の方法は、主にAPCの単離とそれに続くこれらの細胞のex vivo分化に依存しています。Organ-on-a-chipモデルやトランスウェル共培養などの追加の方法が開発され始めています18,24。しかし、これらのex vivo分化脂肪細胞は、脂肪組織17の成熟脂肪細胞とは転写学的および形態学的に異なることが示されています。形態学的には、ex vivo 分化型脂肪細胞は多房性であり、in vivo 単離脂肪細胞は単房性です。このプロトコルは、以前の報告17,25から変更および最適化され、少なくとも5gの脂肪組織を必要とする他のプロトコルと比較して、わずか0.5gの脂肪組織から成熟脂肪細胞を成功裏に分離および培養するために25。最後に、この研究は、具体的な時間、遠心分離温度、コラゲナーゼ量の代わりに、プロトコルの主要なステップが成功裏に完了したことを視覚的に示すことを目的としていましたが、ガイドラインは表1に含まれています。これらのパラメータは、脂肪組織のデポー、性別、動物の肥満度などの要因に応じて調整する必要があり、これらはすべて、このプロトコルでの消化効率と成熟脂肪細胞のクリーンな分離に影響を与える可能性があります。

合計すると、この手順は、プールされたマウスの数と個々の脂肪組織サンプルの数に応じて、3〜4時間かかります。成熟脂肪細胞の培養と機能的役割の評価能力により、脂肪細胞の生物学自体の研究(代謝、栄養利用、トレーシングなど)や、脂肪細胞とAPC、がん細胞、免疫系細胞などの他の細胞種との相互作用など、多くの下流への応用が可能になると期待されています。

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

著者らは、5 For The Fight and Huntsman Cancer Institute(KIH)、V Foundation for Cancer Research(KIH)、およびDK133455(KIH)からの助成金支援に感謝します。Biorenderで作成されたプロトコルの概略図。さらに、著者らは、イメージングの支援を提供してくださったユタ大学の Stephanie Giagnocavo 氏と Cell Imaging Core 氏、および原稿に対するフィードバックを提供してくださった Mark Lee 氏に感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
100x ポロキサマー 188 溶液SigmaP5556-100mL
15 mL コニカルセルスター188261
21 G ニードルBD305165
5 mL シリンジBD309646
50 mL コニカルセルスター227261
6.5 mm トランズウェル 0.4 µm 細孔ポリカーボネート膜インサートコーニング3413
ウシ血清アルブミン (BSA)Sigma-AldrichA7906-100G
CaCl2SigmaC1016-500gm
CellMask Plasma 膜 StainsモフィッシャーサイエンティフィックC10045
CL 316243二ナトリウム塩Tocris1499
コラゲナーゼ粉末ΣC6885
DMEMGibco11995-040
DMEM no pheonol RedGibcoA14430-01
DNase ISigma-Aldrich10104159001
Fetal Bovine Serum (FBS)GibcoA56708-01
Fisherbrand Tissue Path Superfrost Plus Gold SlidesFisher scientific
ゲルローディングピペットチップフィッシャーサイエンティフィック02-707-181
GlutaMAX SupplementGibco35050061
Glycerol Assay KitアブカムAB133130
ハンクス平衡塩溶液 (HBSS)Gibco14025-092
HEPES バッファーシグマ83264-100ml-F
ヘレウスメガフュージ16R遠心分離機サーモサイエンティフィック 
Hoechst 33342 SolutionThermo Fisher Scientific62249
Incubating Mini ShakerVWR12620-942
Medium 199Sigma-AldrichM4530
Microscope Cover Glasses VWR16004-302
PBSGibco
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
SecureSeal イメージング スペーサーGrace Biolabs654006
Seive (SteeL Fine Mesh Cocktail Strainer)OXO3112000https://www.oxo.com/steel-fine-mesh-cocktail-strainer-660.html
サー151884875004271 10010023

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