ポリカプロラクトン足場およびhiPSC由来心細胞の溶融エレクトロスピニングライティングを用いたヒト心筋組織作製

機能的なヒト心臓工学組織の作製は、インパクトの大きいアプリケーションに大きな期待が寄せられています。これらは、薬物心毒性とヒト心疾患のモデリングの開発から、関連するサイズの治療組織の生成まで多岐^{にわたります1}。過去15年間でこの分野では大きな進歩が見られましたが、高度に模倣されたヒト心筋の作製は、現在、その天然の対応物²の複雑な構造的および機械的組織を再現することが困難であるために妨げられています。

生物学的面では、革新的な細胞リプログラミング技術により、患者固有の治療用細胞を開発する可能性が開かれました。現在、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)は、パーソナライズされた状況でヒト心筋細胞の唯一の供給源です。心筋細胞の高収率は、堅牢な分化プロトコル^3,4に従って得ることができる。重要な問題は、現在使用されているヒトhiPSC由来心筋細胞(hiPSC-CM)が従来の2次元分化条件下で未成熟な表現型を示すため、成熟度です⁵。これは、心臓組織の構造組織が非常に複雑で、従来の2D培養とは全く異なるという事実と結びついています。また、心筋は、心筋線維芽細胞、平滑筋、内皮細胞などの非筋細胞を含むさまざまな心血管細胞で構成され、特定の3D構造を通じて整然と配置されているため、効率的な血液送り出しが可能になります^6,7。したがって、生理学的に関連性のある生体模倣組織を生成するためには、すべての主要な細胞タイプで構成される高度に構造化されたヒト心臓ミニ組織が必要です。

新しいバイオファブリケーションアプローチを応用することで、この膠着状態を打破することができます。これらの中で、高度な3D印刷技術であるメルトエレクトロスピニングライティング(MEW)は、高精度と解像度を提供することができます。MEWでは、電場を使用して、セルのサイズ範囲に繊維の形で溶融ポリマーを堆積させますが、これは従来の熱溶解積層法(FDM)3Dプリンティングよりも桁違いに小さく、高度に定義された足^場構造8,9をもたらします。MEWは、複合体のインシリコ設計を印刷されたマトリックスに変換し、心臓組織の物理的特性と一致するように3Dで物理的特性を調整できることが示されています¹⁰。MEW技術を使用すると、さまざまな形状や構造の高分子メッシュを印刷し、軟質細胞に適したヒドロゲルと組み合わせて、ネイティブの成人心筋^11,12のミクロおよびマクロメカニカル環境を模倣した複合組織を生成することができます。MEW 3Dスキャフォールドの設計を変更すると、結果として得られる機能(カルシウム過渡現象)¹⁰が変わることが示されており、この有望な3Dエンジニアリングシステムの形態と機能の関係を理解するための根拠が確立されています。

ここでは、hiPSC-CMおよびヒトiPS細胞由来心線維芽細胞(hiPSC-CF)からの収縮性ヒト心臓ミニ組織の作成、および3D MEWプリント構造で強化されたフィブリンハイドロゲル内でのそれらの組み合わせについて、詳細なプロトコルを提供します。線維芽細胞の添加は、hiPSC-CMの生存率を高め、組織構造を維持するために、さまざまな3D工学システムで広く使用されていますが、3D-MEWシステムでの使用はまだ調査されていません¹³。ここで説明する技術は、疾患メカニズムの理解、前臨床毒物学、薬物スクリーニングなどのアプリケーションを使用して、正確な心臓組織モデルの開発を目指す研究者に汎用性の高いプラットフォームを提供します。このモデルは、アントラサイクリン系薬剤(ドキソルビシンなど)、チロシンキナーゼ阻害剤、および心機能障害と関連しているキメラ抗原受容体T細胞(CAR-T)細胞などの新興治療法などの確立された薬剤の心毒性を評価するのに適している¹⁴。さらに、このモデルは、心筋梗塞などの状態で心機能を改善し、心筋組織の回復を目的とした生体材料、バイオインク、細胞ベースの治療の試験を可能にすることにより、再生医療を進歩させる大きな可能性を秘めています。

本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1. 培地と試薬のセットアップ

1. 細胞培養プレートのプレコーティング
   1. マトリゲル成長因子還元型(MGFr)ストックアリコートを調製します。MGFrのバイアル1本を氷の上で冷蔵庫で一晩解凍します。滅菌フード内で、冷蔵チップを使用し、ストックとチューブを常に氷の上に置いたまま、ストックを冷冷RPMI 1640 L-グルタミン(RPMI)で1:1に希釈することにより、適切な量のアリコートを作成します。
      注:hiPSCの培養およびhiPSC心筋細胞(hiPSC-CM)の播種には、異なる希釈量のMGFrが使用されます。ヒトiPS細胞のMGFrコーティング希釈率は、特定の細胞株によって異なります。ただし、心筋細胞のステージに達すると、細胞株に関係なく1:80の希釈が使用されます。
   2. 細胞培養プレートをコーティングするには、必要な数のMGFrアリコートを氷上でゆっくりと解凍し、さらに冷RPMI、hiPSC培養の場合は1:180(9 mLのRPMIに100 μLのMGFr)、hiPSC-CMの再プレーティングには1:80(4 mLのRPMIに100 μLのMGFr)で希釈します。
      1. 希釈したMGFrを、6ウェルプレートの場合はウェルあたり1 mLの容量で直ちに加え(hiPSC維持)、12ウェルプレートの場合はウェルあたり0.5 mLの容量で加えます(hiPSC-CM再プレーティング)。プレートは使用前に4°Cで保管してください(最大1週間)。
         注:MGFrコーティングプレートは、細胞播種前に37°Cで30分間温める必要があります。細胞をプレーティングする前に、MGFrコーティングされたプレートから液体を吸引します。
   3. hiPSC-CFを培養するには、使用前にT75またはT175フラスコを0.1%ゼラチンで室温(RT)で少なくとも15分間、T75フラスコの場合は5 mL、T175フラスコの場合は10 mLの容量でコーティングします。インキュベーション後、細胞播種前に液体を吸引します。
2. 細胞培養培地
   1. hiPSC培養には、Essential 8 Supplement(50x)をEssential 8 Basal Mediumに添加して、Complete Essential 8 Medium(E8培地)を使用します。
   2. 心筋細胞の分化のために、以下を準備します。
      1. インスリンを含まない RPMI/B27 (-INS 中程度): 500 mL の RPMI と 10 mL の B27 をインスリンサプリメントなしで混合します。RPMI/B27(B27培地):500 mLのRPMIと10 mLのB27サプリメントを混合します。
   3. 心筋細胞の精製(乳酸培地)では、1 M乳酸2 mLをグルコースフリーRPMI 1640 500 mLに加えます。培地は4°Cで最大1ヶ月間保存できます。
   4. 心筋細胞の再プレーティング(Replating Medium)には、B27培地に10%ノックアウト血清補充療法(KSR)と10μMのY27を添加します。
      注:KSRは、ESCおよびiPSC培養プロトコルでFBSに代わる定義された無血清製剤です。
   5. 線維芽細胞の分化と維持(11日目以降)のために、製造元が指定した完全な線維芽細胞増殖培地3(FGM3)を調製します。サプリメントパック(0.1 mL/mL ウシ胎児血清、5 μg/mL 組換えヒトインスリン、1 ng/mL ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子 FGF2)を FGM3 基礎培地に加えます。
      注:線維芽細胞の増殖を促進するには、FGF2濃度を10 ng / mLに増やすことをお勧めします。.
   6. 3D心臓組織の生成とメンテナンスに使用するには、以下を準備します。
      1. 組織生成培地:B27培地に1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P / S)、10%KSR、および10μMのY27を補給します。組織維持培地:1% P/Sとアプロチニン(0.1%(wt/vol);33 μg/mL)を含むB27培地を調製します。
         注:アプロチニンは、培養中のフィブリンゲルの完全性を可能にし、その分解を防ぎ、ヒドロゲル内の細胞を維持します。したがって、組織が生成されるのと同じ日に培地に追加することを強くお勧めします。
3. 低分子および成長因子ストックソリューション
   1. CHIR-99021 (CHIR): GSK3阻害剤およびWntシグナル伝達活性化因子については、10 mMのストック溶液をDMSOに溶解して調製します。アリコートは-20°Cで最大6か月間保存してください。
      注:hiPSC株は、CHIR治療に対して異なる反応を示す場合があります。CHIR濃度の最適化が必要な場合があります。6-10 μM CHIRテストをお勧めします。
   2. C59、Wnt阻害剤:10 mMのストック溶液をDMSOに溶解して調製します。アリコートは-20°Cで最大6か月間保存してください。
   3. Y-27632、ROCK阻害剤(Y27):10 mMストックをDMSOに溶解して調製します。アリコートは-20°Cで最大1か月間保存してください。最終的な濃度は、標的細胞の種類によって異なります。hiPSCには2μM(1/5000)、hiPSC-CM、hiPSC-CF、および組織作製には10μM(1/1000)を使用します。
      注:Y27は、剥離時の懸濁液中の細胞死を抑制することにより、細胞の生存を促進します。過度の細胞死を避けるために、収穫時に使用してください。
   4. レチノイン酸:30 mMの原液をクロロホルムに溶解して調製します。アリコートは-20°Cで最大2年間保管してください。
   5. FGF2(Recombinant Human Fibroblast Growth Factor、FGF-b、線維芽細胞増殖促進):50 μg/mLの原液を滅菌水に溶解して調製します。アリコートは-20°Cで最大6か月間保管してください。
   6. SB431542(SB)、TGFβ1シグナル伝達阻害剤:10 mMストック溶液をDMSOに溶解して調製します。アリコートは-20°Cで最大6か月間保管してください。
      注:CFの状態を維持し、2D培養で筋線維芽細胞の移行(線維化中に発生する病理学的表現型)を防ぐために、線維芽細胞培地に添加してください。
4. フィブリンハイドロゲルのストックソリューション
   1. フィブリノーゲン:200 mg / mLのストック溶液を調製します。.まず、細胞フード内の滅菌ツールを使用して、フィブリノーゲンの塊を微粉末に粉砕します。0.9%(wt/vol)のNaCl溶液を温め、完全に溶解するまで37°Cに保ちます。アリコートは-80°Cで最大1年間保管してください。4°Cで1週間。
      注:粘度が4°Cであるため、ティッシュ生成ステップの少し前に解凍して室温に保ち、正確にピペットでピペットできるようにしてください。再利用時に簡単にピペットで移せない場合は、アリコートを廃棄して新しいものを使用することをお勧めします。
   2. トロンビン:トロンビンを滅菌60%PBS + 40%水に溶解して、100 U/mLのストック溶液を調製します。アリコートは、-20°Cで最大1年間、4°Cで最大6か月間保存します。
      注:使用する前に、解凍し、組織生成ステップが完了するまで氷の上に置いてください。
   3. アプロチニン:アプロチニンを滅菌水(粉末100 mgを3.04 mLの水)に溶解して、33 mg / mLのストック溶液を調製します。.アリコートは-20°Cで最大1年間保管してください。
5. 分析のためのソリューション
   1. FACSバッファー(細胞サイトメトリー):PBS溶液(Mg²⁺ およびCa²⁺フリー)に加えて、2.5 mMのEDTAおよび5%(v / v)FBSを調製します。

2. ヒトiPS細胞の培養と継代

注:ここで報告されている手順は、UCSFi001-A(男性、ブルース・コンクリン教授、David J. Gladstone Institutesの親切な贈り物)、ESi044-A(男性)、ESi007-A(女性)およびESi044-C(女性)の健康な系統、ESi107-A(心アミロイドーシス女性疾患系統)を含むいくつかのhiPSC系統で実施されており、hiPSC培地、継代希釈、およびCHIR濃度に関連するわずかな適応があります。そのプロトコルには、UCSFi001-Aの使用に固有の詳細が含まれています。このプロトコールのすべての細胞培養インキュベーションは、37°C、5%_CO2、 および96%の湿度条件で行われます。

1. 1:180 MGFrプレコート6ウェルプレート上のhiPSCラインを培養します。E8培地で維持し、多能性を確保します。
   注:自発的な分化を防ぐためには、培養物の過剰成長を避けることが重要です。したがって、細胞が80%〜90%コンフルエントなときにhiPSC継代を行います。
2. 細胞継代には、古い培地を吸引し、ウェルあたりPBS(Mg²⁺-およびCa²⁺-free)で希釈した0.5 mM EDTA溶液1 mLでウェルを2回洗浄し、RTでEDTA/PBSで7分間インキュベートして細胞間接着を破壊します。
3. EDTA/PBSを吸引し、細胞を回収し、1000μLマイクロピペットと1mLのE8培地をウェルの表面に激しくピペッティングして細胞を剥離します。滅菌遠心分離チューブに集めます。
   注:ピペッティングを10〜15回以上行うと、hiPSCによる死亡が増加するため、避けてください。
4. この容量から、1:15-1:20の希釈を行い、E8培地+ 2 μMのY27でMGFコーティングされた6ウェルプレートに細胞を播種します。播種後最初の24時間のみY27を維持し、過度の曝露による毒性を避けてください。
   注:他のhiPSC株の分裂率を調整して、細胞を未分化で健康な形態に4〜5日間維持します。
5. 24時間後、古い培地を吸引し、新鮮な室温のE8培地を2日間(通常は3〜4 mL)追加します。その後、3〜4日間毎日媒体を交換します。
   注:継代頻度は各細胞株によって異なります。コンフルエント度が100%に達するのは避けてください。ヒトiPS細胞は、多角形の形状、滑らかなエッジ、高い核/細胞質比を持つ、大きくて平坦でコンパクトなコロニーで増殖する必要があります。

3. ヒト心筋細胞の分化

注:hiPSC(hiPSC-CM)からの心筋細胞作製については、記載されているプロトコルは、Lian et ^al.3,15およびBurridge et ^al.4で使用されている単層分化法に基づいています。適切なメンテナンスを行うことで、hiPSCは高い分化効率で30回の連続継代で分化することができます。異常な行動の兆候は、自発的な分化または4つ以上の分化の連続した失敗によって検出されます。マイコプラズマ試験を含む定期的なコントロールが推奨されます。.

1. 心分化を開始するには、上記の細胞継代ステップ(ステップ2)で説明したように、80%〜90%のコンフルエントでiPSCを採取します。1:180 MGFrコーティングされた12ウェルプレートで細胞を播種し、分割希釈を調整して、播種48〜72時間後に90%のコンフルエントでコンパクトな細胞単層を達成します。この細胞株については、1:10希釈を行い、細胞は72時間でコンフルエントを達成します。
   注:このプロトコルでは、ユーザー依存のばらつきを避けるために、希釈液は細胞数ではなく体積によって調整されています。めっき後72時間以内に単層状態に到達しなければ、分化プロセスが成功しない可能性が高くなります。このような場合は、試行を破棄して再開し、最適な通過効率を確保することをお勧めします。
2. 単分子膜が安定すると、分化プロセスが始まり、以降は0日目と見なされます。次に、培地を -INS 培地に 8 μM の CHIR (Wnt シグナル伝達活性化因子) を添加し、プレートを 37 °C で 24 時間インキュベートします (1 ウェルあたり 1 mL)。
   注:効率的な中胚葉誘導のために、各iPS細胞ラインのCHIR濃度を6〜12μMに滴定します。このステップでは、高レベルの細胞死が予想され、これは最適なプロセスの兆候です。
3. 1日目:翌日、各ウェルから培地を吸引し、サプリメントを含まないRPMIで細胞を洗浄します(ウェルあたり0.5mL)。次に、1.5 mLの新鮮な-INS培地を加え、細胞を2日間インキュベートします。
   注:洗浄ステップは、すべてのメディア交換中に実行され、破片、死んだ細胞、およびサプリメントの残留物を除去します。
4. 3日目:心臓系統の仕様を誘導するには、培地を5μMのWnt阻害剤C59を補充した1.5mLの-INS培地に48時間置き換えます。
   注:ここでは、GSK3複合体が形成され、β-カテニンが分解され、心臓中胚葉系統につながります。このステップの後、一部の細胞死も観察できます。
5. 5日目:心前駆細胞の拡張を促進するために、1ウェルあたり1.5mLの容量で48時間洗浄し、新鮮な-INS培地と交換します。
6. 7日目:この日以降、細胞はB27培地に保持され、2〜3日ごとに培地が交換されます。
   注:培地の量をウェルあたり2.5 mLに調整して、週末に培地を交換するのをスキップしますが、この状態に達した場合に限ります。通常、hiPSC-CMは7〜9日目に自然に拍動し始めます。まず、収縮は孤立した非協調的なクラスターとして観察されますが、数日後には、高純度の培養物が均一な鼓動単層を形成するはずです。
7. 取得されると、これらの収縮性単分子膜(通常は10日目)は、再播種ステップによって分離された乳酸培地中で72時間の2サイクルからなる代謝選択プロセスにかけられ、非心筋細胞を排除し、培養の純度を高めます。
8. 10日目、最初の精製ステップ(1^番目の 乳酸):拍動する細胞を乳酸培地(ウェルあたり0.5 mL)で洗浄し、乳酸培地のウェルあたり1 mLで72時間インキュベートします。
   注:洗浄ステップは、乳酸培地または基礎グルコースフリーRPMI 1640を使用して、以前のグルコース培地(B27)の痕跡をすべて完全に除去する必要があります。
9. 13日目:最初の精製ラウンドから細胞を洗浄し、B27培地のウェルあたり1.5 mLで2日間回復させます。
10. 15日目(再めっきステップ):精製の2サイクルの間に、EDTA/PBSで洗浄し、TrypLEで37°Cで10分間インキュベートすることにより、単層を解離します(ウェルあたり0.5mL)。
    注:インキュベーション時間は各細胞株によって異なります。
11. 1000 μLマイクロピペットを使用して細胞を分離し、滅菌遠心チューブ内で10% KSR(v / v)を添加したB27培地のウェルあたり0.5 mLで細胞を回収します。
    注:心筋細胞はせん断応力と強いピペッティングに敏感であるため、ピペッティング手順の繰り返しを避けるようにしてください。低ダメージの hiPSC-CM 解離のための他の選択肢は、TrypLE 10x またはコラゲナーゼと DNase の併用です。インキュベーション時間を最適化して、細胞の損傷を引き起こしたり、細胞の完全性を損なう可能性のある過度のピペッティングを必要とせずに、細胞の剥離に十分であることを確認します。
12. 室温で100 x g で10分間遠心分離し、1:80 MGFrコーティングされた12ウェルプレートに再播種し、再めっき培地で再播種します。ウェルあたり1mLに播種します。
    注:これにより、分化中に沈着した余分な死細胞とマトリックスが除去されます。これらは後で組織生成に悪影響を与える可能性があるためです。
13. 16日目:再プレーティングの24時間後、Y27とKSRを除去し、次の精製ステップ(通常は48〜72時間)の前に細胞をB27培地に保持します。
14. 18日目:2番目の精製ステップ(2^番目の 乳酸)。最初のサイクルと同様に、細胞を乳酸培地で72時間(ウェルあたり1 mL)洗浄し、インキュベートします。
    注:精製サイクルは、心筋細胞マーカーcTNT(心筋トロポニンT)(図示せず)のフローサイトメトリー分析で観察されるように、培養純度を最大30%向上させることができます。このプロセスは、主に線維芽細胞と残存するヒトiPS細胞の汚染を低減します。収量を損なうことなく組織作製を進めるために必要な最小許容純度レベルは決定されていませんが、少なくとも85%〜90%の純度の培養物を使用することが推奨されます。このレベルの純度は、心筋細胞の付着性の向上をサポートし、最終組織の収縮強度を高め、実験間の再現性をサポートします。
15. 21日目:乳酸の精製が完了したら、精製した心筋細胞をB27培地で使用するまで維持し、頻繁に培地を交換します(2〜3日ごと)。
    注:使用が遅れると、細胞の剥離が困難になるため、細胞の収量が減少します。したがって、2回目の乳酸精製が終了した日からさらに1週間以内にそれらを使用することをお勧めします。

4. ヒト心線維芽細胞の分化

注: ヒト心線維芽細胞 (hiPSC-CF) を hiPSC から取得するために、次のプロトコルは Zhang et ^al.16 によって使用された 2 段階の方法論に基づいています。最初のステップは、心原性中胚葉誘導後にWntシグナル伝達経路を再活性化することにより、心外膜細胞(hiPSC-EpiC)を取得することです。その後、hiPSC-EpiCを血管発生阻害剤とFGF2に曝露し、18日間で心線維芽細胞を取得します。

1. hiPSCのメンテナンス、収穫、播種密度は、hiPSC-CMの分化プロトコルに記載されているように確保します。1:180 MGFrコーティングされた12ウェルプレートでhiPSCを培養し、分化を開始します。
2. コンパクトな hiPSC 単分子膜が達成されたら (0 日目)、5 μM の CHIR (1.5 mL/ウェル) を添加した -INS 培地を 48 時間加えます。
   注:効率的な中胚葉誘導のために、各hiPSCラインのCHIR濃度を滴定します。
3. 2日目:培地を吸引して廃棄し、細胞をRPMIで洗浄し、1.5mLの新鮮な-INS培地と24時間交換します。
   注:hiPSC-CMsプロトコルと同様に、培地交換中に細胞をすすぎます。各ステップに応じて、対応する未補充の基礎培地を使用してください。
4. 3日目:5 μMのC59(Wnt阻害剤)を含む-INS培地で細胞を48時間インキュベートします(ウェルあたり1.5 mL)。
5. 5日目:心臓中胚葉細胞の再播種のために、EDTA/PBSで洗浄し、TrypLEで37°Cで5分間インキュベートして細胞を剥離します(ウェルあたり0.5mL)。Advance DMEM基礎培地(ADMEM)のウェルあたり0.5 mLに細胞を回収し、RTで300 x g で5分間遠心分離します。
6. 1:180 MGFrプレコート12ウェルプレート(1ウェルあたり1 mL)に20,000細胞/cm²の密度で播種します。再めっきには、5 μMのCHIR、2 μMのレチノイン酸、10% KSR(v / v)、および10 μMのY27を添加したADMEMを使用してください。
7. 6日目:再めっき後24時間で、培地をリフレッシュしてY27を取り除き、KSRを2%に減少させます。心外膜表現型の発達を達成するために、同じCHIRおよびレチノイン酸濃度をさらに48時間維持します。
8. 8日目:ADMEMを添加した細胞を培養し、KSRの2%を72時間かけて培養し、心外膜単分子膜の生成を促進します。
   注:hiPSC-EpiCは、単一のコロニーにグループ化された平坦または立方体の大きな細胞のように見えます。この時点で、分化の最初のラウンドを実行するときに、WT1(核抗原)、ZO1(細胞質膜抗原)、およびTCF21(細胞質抗原)などの典型的な心外膜細胞マーカーをFACS(フローセルサイトメトリー)またはIF(免疫蛍光染色)(図示せず)で分析できます。
9. 11日目:心外膜細胞を再播種するために、hiPSC-EpiCs洗浄液をEDTA/PBSで解離し、TrypLEと37°Cで5分間インキュベートします(1ウェルあたり0.5mL)。FGM3培地(ウェルあたり0.5 mL)で細胞を回収し、室温で300 x g で5分間遠心分離します。
10. 0.1%ゼラチンコーティングされた12ウェルプレートに、細胞密度10,000細胞/cm²でhiPSC-EpiCをリプレートします。10 μM の SB (筋線維芽細胞の移行を避けるための TGFß1 シグナル伝達阻害剤で、通常は形成上培養中) と 10 μM の Y27 (最初の 24 時間のみ) を添加した FGM3 培地を使用します。
11. 翌日、線維芽細胞培地(FGM3 + SB10 μM)を2日ごとに補充し、hiPSC-CFが得られるまで、全工程で合計約18日間を過ごします。
    注:hiPSC-CFは紡錘形の形態を示す必要があります。ここでは、線維芽細胞マーカーDDR2の発現をFACSおよびIF技術で解析する必要があります(ステップ7.1-7.2を参照)。
12. hiPSC-CFsの培養液がコンフルエントになったら、ゼラチンでコーティング済みのT75またはT175フラスコで1:3の細胞継代を行います。細胞は約4〜6日で90%のコンフルエンスに達します。hiPSC-CFを切り離すには、hiPSC-EpiCsの再めっきで説明されているTrypLEハーベスティングプロトコルを使用します。ここでは、通過にY27は必要ありません。
13. hiPSC-CFは、FGM3培地+10 μMのSBで使用まで維持するか、クライオチューブあたり1〜300万細胞の細胞密度で低通過で凍結します。
    注:プラスチックフラスコで長期間培養すると、細胞はより収縮性の筋線維芽細胞表現型に分化し始めるため、新しい細胞を解凍する前に、hiPSC-CFを最大6継代維持することが推奨されます。

5. MEW(Melt Electrospinning Writing)足場の作製

注:このプロトコルは、医療グレードのポリε-カプロラクトン(PCL)ホモポリマーを使用して、QUT、クイーンズランド工科大学¹⁰によってこの目的のために特別に設計されたMEWプリンターを使用して、繊維状足場を印刷します。

1. 印刷用のPCLポリマーストックを準備します。PCL顆粒を23 G針に取り付けられた3 mLのプラスチック製ルアーロックシリンジに充填し、オーブンで80°Cで2時間溶融し、ポリマーが溶融している間にピストンを静かに押して気泡を取り除きます。いくつかのシリンジを準備し、PCLが急速に固まるため、RTで保管します。
2. 印刷当日は、シリンジを加熱室内に導入し、加圧した_N2 供給パイプに接続してください。MEW装置の電源を入れ、温度調節器を80/65°C(チャンバー/ノズル)に設定し、シリンジを30分間保持して、ポリマーが適切に溶融するようにします。
3. シリンジの下には、コレクタープレートがあり、互換性のある(Mach3)ソフトウェアによって電動でXY方向に可動します。プリントヘッドがプレートの一方の端または任意の場所に配置されるまでコレクタープレートを動かし(コンピューターカーソル制御)、加熱チャンバーとコレクタープレートの間の距離(コレクター距離)を手動で10mm(Z平面)に調整します。
   注:この距離は、特定の繊維直径を達成するために実験的にテストする必要があります。集電距離が短いほど繊維は太くなり、 その逆も同様です。
4. 電界供給を自動的に接続する機器のドアを閉じます。電圧を7 kV、N₂ 圧力を2 barに設定して、プリント時に23 Gの先端から押し出されるようにします。
   注:高電圧を供給することにより、シリンジの先端とコレクタープレート(ステンレス鋼製)との間に電位差が生じます。次に、供給された圧力によってノズルに蓄積された液滴は静電荷を帯び、テイラーコーンを生成し、コレクタープレートに向かって駆動します。電圧と圧力を調整して、最終的な繊維寸法を変更できます。高圧パラメータは太い繊維を押し出すため、繊維を安定させるために電圧を上げる必要があります。このソフトウェアはコンピュータ数値制御(CNC)に基づいているため、足場の形状はGコードとして記述され、プログラムに供給され、プログラムはX-Yの動きとコレクタのプレートモータの速度を制御します。したがって、最終的な足場を印刷する前に、前のステップとして任意のGコードを印刷して、コイリングやホイップの外観なしに定義された繊維を構築する安定したジェットを取得することをお勧めします。そのためには、空気圧が0.1バール、電圧が0.1 kV、コレクター速度が60〜100 mm / minなど、毎回小さな変更でパラメーターを最適化します。これにより、ジェット機のテイラーコーンの動作が保証されます。
5. ソフトウェアで設計された Gコード を選択して、正方形のパターン形状の足場を印刷します。この G コード例では、6 cm x 6 cm の 15 層の正方形メッシュと 0.5 mm x 0.5 mm の正方形の細孔を印刷します。
6. 正確に堆積したファイバー(つまり、オーバーラップするファイバー)をプリントするには、コレクター速度を1080 mm/minに調整します。
   注:各MEW機器の電圧、圧力、コレクター速度、およびコレクター距離のパラメーターを調整して、正確なファイバー直径(μm)を定義します。前述のパラメータの影響を超えて、コレクタ速度を上げると繊維が細くなり、減少すると繊維が太くなります。このプロトコルのパラメータ設定により、直径10〜15ミクロンの繊維の印刷が可能になります。
7. ソフトウェアの START ボタンを押して印刷を開始します。印刷が終了したら、コレクターから足場を慎重に取り外します。
   注意: 印刷後の足場の取り扱いを容易にするために、足場よりも大きいガラス片に印刷し、粘着テープでコレクターベースに固定することをお勧めします。
8. プリントしたメッシュを直径6mmのパンチでカットし、ティッシュ作製用の最終的な足場を作ります。
9. PCLメッシュは疎水性が高いため、O₂/アルゴンプラズマで5分間処理することで、親水性を高め、フィブリンや細胞との相互作用を促進します。
   注:オプションで、0.1 NのNaOH処理を15分間行い、その後にPBSを広範囲に洗浄することも有効です。
10. 70%エタノールに30分間浸漬してメッシュを滅菌し、滅菌蒸留水で30分間広範囲に洗浄し、乾燥させます。
    注意: このプロセスは、滅菌ペトリ皿内および滅菌フード内で行ってください。メッシュがプレートに付着して変形するのを防ぐために、メッシュが使用されるまで、メッシュを完全に乾かさないでください。

6. フィブリンミニティッシュの生成とメンテナンス

注:ヒト心筋3Dミニ組織の生成は、フィブリンハイドロゲル内のhiPSC由来の心臓細胞のカプセル化と、線維性サポートを提供するMEWスキャフォールドの組み合わせに依存しています。以下のプロトコルは、Breckwoldt et ^al.17 および Ronaldson-Bouchard et ^al.18 が使用した工学設計アプローチから採用されています。

1. 上記のように、hiPSC-CMs分化プロトコル(TrypLEハーベスティング)の再プレーティングステップ(3.10-3.11)で説明したように、hiPSC-CMを切り離します。細胞ペレットを組織生成培地に再懸濁して、ノイバウアーチャンバー内の細胞をカウントします。
2. TrypLEによるhiPSC-CMのハーベスティングステップと同様に、hiPSC-CFを切り離します。T75には3 mLのTrypLEを、T175フラスコには5 mLを、TrypLEインキュベーションの不活性化には同量のTrypLEを使用してください。最後に、CMの場合と同様に、細胞ペレットを組織生成培地に再懸濁します。これは、同じ培地で混合して培養するためです。
3. ノイバウアーチャンバー内の細胞をカウントします。すべての組織に播種するために必要な細胞の正確な総数を計算します。
   注:このプロトコルは、組織ごとに100万個の細胞を使用し、80%のCMと20%のCF、つまり800,000個のCMと200,000個のCFで構成されています。組織あたり合計150万から300万という他の量も、練習すれば達成可能です。
4. 必要な全細胞を新しいチューブ(Cell Mix)で混合し、ペレット化します。室温で300 x g で5分間、ペレットが完全に乾燥していることを確認し、播種するまで氷上に保ちます。すべての組織の播種に必要なヒドロゲルの総量を計算します。
   注:このプロトコルでは、組織あたり35 μL(直径6 mmのスキャフォールドサイズの場合)を最終密度3,000万細胞/mLに近づける必要がありますが、上記のステップ6.4ですでに述べたように、増やすことができます。各フィブリンハイドロゲルは、6 mg/mL フィブリノーゲンと 5 U/mL トロンビン、および細胞が再懸濁される組織生成培地で構成されています。35 μL のハイドロゲルの場合、フィブリノーゲン/トロンビン比は 1.05 μL/1.8 μL です。ピペッティングエラーによる容量損失を避けるために、最終容量のハイドロゲルを10%追加することをお勧めします。例:10組織の場合、細胞を350 μL + 10%、つまり385 μLに全終末容量として再懸濁します。
5. Cell Mixを必要量のTissue Generation Mediumに再懸濁します。気泡の形成を避けて、慎重に混ぜます。
   注:10組織の場合、1,000万個の細胞(80 CM:20 CF)を374.5 μLの組織生成培地(ヒドロゲルの総量から全組織に必要なフィブリノーゲンの総量を差し引いたもの、つまり10.5 μL)に再懸濁します。
6. 必要量のフィブリノーゲンを加え、慎重に混ぜます。10組織の場合、10.5 μLのフィブリノーゲンを Cell Mixに添加し、 Hydrogel Mixを生成します。RTのままにしてください。
   注:せん断力がhiPSC-CMの生存率に影響を与えないように、過度に繰り返されるピペッティングを避けることが不可欠です。滅菌メスでピペットチップの先端を切り取り、その後、せん断損傷を減らすために ハイドロゲルミックス を再懸濁することをお勧めします。.
7. プレートへのフィブリンの付着を避けるために、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)表面に ハイドロゲルミックス を播種します。一滴として残るティッシュの半分の容量(17.5μL)をピペットでピペットし、ティッシュの総数に対してそれを行います。
   注:一度に10枚以上のティッシュを作らないでください。
8. 各滴の上にPCLスキャフォールドを置き、残りの容量(17.5 μL)を追加します。足場が完全に浸されていることを確認します。
   注:反応が非常に速いため、両手でピペッティングする準備をしてください。ティッシュペーパー1枚ずつ。
9. 利き手ではない手で必要量のトロンビン(1.8 μL)を加え、ハイドロゲルを利き手とすばやく混合します(少なくとも2〜3回ピペッティングします)。
   注:気泡の形成を避けるために、できれば全容量(30μL)よりも少ないピペッティングで混合してください。気泡が発生した場合は、針で素早く刺します。
10. 各組織について前の手順を繰り返します。
    注:適切な取り扱いが確保されるまで、セルなしでこの手法を練習することをお勧めします。
11. 組織を37°Cで1時間インキュベートして、フィブリンの重合を完了します。
12. 滅菌ピンセットで各組織の端を優しくつまみ、33 μg/mLのアプロチニンを添加したTissue Generation Mediumのウェルあたり2 mLを入れた12ウェルプレートに入れます。ウェルごとに1つのティッシュを配置します。
    注:機械的な力によって細胞が損傷する可能性があるため、ハイドロゲルの中心でそれらを拾わないでください。必要に応じて、へらを使用してください。
13. 組織を37°Cで24時間インキュベートします。
    注:最初の24時間の間にアプロチニンを省略すると、たとえ後で添加されたとしても、メッシュとハイドロゲルからの細胞の部分的な剥離につながることが観察されているため、生成日以降、組織培養培地にアプロチニンを維持することが重要です。これにより、最終組織の完全性に必要な完全な細胞被覆が損なわれます。
14. 翌日、培地を2 mLのTissue Maintenance Mediumでリフレッシュし、KSRとY27の残留物を取り除きます。それ以降は、一日おきに媒体を交換してください。

7. ヒトiPS細胞の心分化能とミニ組織機能の系統的解析

1. フローサイトメトリー解析
   注:細胞は、「蛍光活性化セルソーティング」(FACS)サイトメトリーモダリティを使用して分析され、hiPSC分化の効率を決定します。すべてのステップは室温条件下で実行されます。
   1. 細胞培養物をhiPSC-CMとCFの両方を別々にシングルセル懸濁液に解離(TrypLE回収)します。
   2. ペレットをFACSバッファーに250,000細胞/mLで再懸濁し、チューブあたり少なくとも1mLを分注します。非特異的抗体の結合を避けるために、30分間インキュベートしてください。
   3. 細胞を300 x g の室温で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
      注:すべての遠心分離ステップは、これらの条件下で実行されます。
   4. 細胞内抗原を検出するには、細胞透過化キットで細胞膜を固定し、透過処理します。まず、細胞を反応性A(Fix)で30分間インキュベートし、遠心分離します(ステップ7.1.3と同様)。
   5. 次に、Reactive B(Perm)と一次抗体と細胞を30分間インキュベートします。チューブあたり100μLの反応性を使用してください。
      1. hiPSC-CMsには、マウスcTNT抗体(心筋Tトロポニン、CMマーカー)を1/200希釈で使用します。hiPSC-CFには、マウスDDR2抗体(コラーゲン受容体、CFのマーカー)を1/500希釈で使用します。
         注:すべての反応を停止するには、遠心分離の前に各チューブに1 mLのFACSバッファーを加えます。
   6. FACSバッファーで1/100に希釈した抗マウスAlexa-Fluor 488二次抗体と15分間インキュベートします。
   7. PBSで3回洗浄し、洗浄の合間に遠心分離を行い(ステップ7.1.3と同じ条件で)、最後に細胞ペレットを400 μLのPBSに再懸濁します。サイトメーターまたは同様のデバイスで分析します。
2. 免疫蛍光染色分析(IF)
   1. 2D心筋細胞培養では、1:80 MGFrまたは0.1%ゼラチンプレコートスライドベースの培養チャンバーウェルシステムで、両方の細胞タイプを別々に播種します。約80,000細胞/cm² をプレート化して、分析に十分な細胞密度に到達させます。3Dミニ組織の場合は、ピンセットで2 mLの微量遠心チューブに優しく移します。
   2. 細胞培地を廃棄し、細胞または組織をPBSで2回洗浄します。RTでサンプルを10%ホルマリン(v / v)で固定します。スライドチャンバーは15分、ミニティッシュは1時間です。
      注意: ホルマリンは吸入すると危険であり、ドラフトで取り扱わなければなりません。
   3. 固定バッファーを廃棄し、PBSで5分間3回洗浄します。サンプルは、使用するまでPBSで4°Cで保存します。
   4. 細胞膜を透過処理するには、細胞を0.1% Triton X-100 (v/v) と 10 分間インキュベートするか、1% Tween-20 と 3D 組織を RT で 15 分間インキュベートします。その後、PBSで5分間3回洗浄します。
   5. 非特異的抗体の結合を減らすには、サンプルを3%(v/v)ウシ血清アルブミン(BSA)溶液でRTで30分間処理します。
   6. PBSと1% BSAを併用した一次抗体溶液を調製して非特異的結合をブロックし、4°Cで一晩インキュベートします。
      1. 2次元iPSC-CMには、1/400希釈の抗心α-ACTN(サルコメアアクチニン)マウス抗体を使用します。2DのhiPSC-CFには、1/500希釈のAnti-DDR2マウス抗体を使用してください。3D組織の場合、2つのCM特異的抗体とCF特異的抗体を組み合わせます。
   7. 翌日、抗体溶液を吸引し、RTでPBSで3回、各5分間洗浄します。
   8. 二次抗体(Alexa-Fluor 488およびAlexa-Fluor 594)を1/200に希釈し、暗闇でRTで1時間インキュベートして、マウスおよびウサギの一次抗体をそれぞれ同定します。PBS洗浄を3回繰り返します。
   9. 核を対比染色するには、サンプルを4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を1/500希釈して、暗所の室温で20分間インキュベートします。PBS洗浄を3回繰り返し、サンプルをPBSで4°Cで保存します。
   10. 共焦点顕微鏡でサンプルを検査し、画像を取得して、フィジーなどの適切なソフトウェアで処理します。
   11. 3Dミニティッシュの場合は、PBSを使用して2つのガラスカバースリップの間に慎重に移し替え、良好なイメージングを可能にします。
       注:高解像度でZスタック画像を取得するには、40倍以上の油浸対物レンズをお勧めします。
3. 細胞生存率解析
   注:Alamar Blueアッセイ(AB)は、3D心臓ミニ組織の細胞生存率に直接関連する細胞代謝活性を測定するために使用されます。サンプルを光から保護し、無菌条件下で全プロセスを実行します。
   1. フェノールレッドを含まないRPMI 1640培地で10%(v / v)AB溶液を調製します(比色測定に干渉する可能性があるため)。
   2. 心臓ミニ組織を滅菌ピンセット付きの48ウェルプレートに慎重に移します。コンストラクトを組織あたり300 μLのAB溶液と1時間30分(実験的に時間を調整)37°Cでインキュベートします。
      注:細胞が代謝酵素の作用によりレサズリンを還元すると、培養培地の色変化が発生し、これは570nmおよび600nmの分光光度法によって測定されます。
   3. 測定には、代謝されたAB溶液の組織あたり100 μLを96ウェルプレートに集め、吸光度を読み取ります。
      注:この分析後、培地を再度Tissue Maintenance Mediumに変更することで、サンプルを培養できます。
4. 収縮解析
   注:心臓のミニ組織は、通常、組織生成の1〜2日後に自然に拍動を開始します。
   1. 光学顕微鏡で組織を観察し、拍動周波数を手動で測定します(拍動/分)。多くの組織を同時に測定する場合は、各読み取りの前にプレートを暖かく保ってください。
      注意: 温度が下がると、鼓動速度も減少し始めます。
   2. 拡張心臓収縮性評価のために、拍動組織の光学顕微鏡ビデオを取得します。4倍でより大きな平面を捕捉するか、10倍で異なる組織領域から捕捉します。ビデオごとに約30秒(少なくとも3ビート)を記録します。
   3. 少なくとも 30 フレーム/秒のフレーム レートを使用し、ビデオを .AVI 形式で保存します。
      注: ここでは、MATLAB¹⁰ 用に開発されたカスタムメイドのトラッキング ポイント アルゴリズムを使用してビデオを解析しています。この方法では、動画ごとに収縮速度、収縮最大変位(振幅)、収縮方向を求めることができます。
   4. 解析フォルダーに含まれるビデオに対して、MATLAB でアルゴリズムを直接実行します。これは、フレームあたりの収縮速度、フレームあたりの収縮振幅、収縮角度(方向)、およびそれぞれの標準偏差¹⁰の値を含む結果Excelドキュメントを自動的に提供します。
   5. 「フレームあたりの縮小速度」にカメラの解像度(μm/ピクセル)とカメラのフレームレート(フレーム/秒)を掛けます。これにより、収縮速度の最終値(μm/s)が得られます。
   6. 「Contraction amplitude per frame」にカメラの解像度(μm/pixel)を掛けると、収縮振幅の最終値(μm)が得られます。
      注:他の場所で議論されているように、MUSCLEMOTIONなどのソフトウェアを使用して収縮速度論をより詳細に分析することは可能です^19,20。イメージングセットアップは、ソフトウェアで分析するために少なくとも60フレーム/秒をキャプチャする必要があります。

2D hiPSC由来心筋細胞の特性評価
多表現型の心組織を作製するために、hiPSC-CMとhiPSC-CFは独立して分化され、 in vitroで特徴付けられます。適切な最適化と厳格なメンテナンスにより、以下のプロトコルにより、分化9日目頃にhiPSC-CMの収量が80%を超え、自発的に拍動する細胞が生まれます(図1A)。さらに、代謝選択による純度濃縮により、非hiPSC-CMが大幅に排除され、21日目に心筋トロポニンタンパク質(cTNT+)を発現する細胞の90%以上で構成される培養物が得られます(図1B)。これらの頑健な鼓動単層は、IF染色による収縮性筋腫アクチニンタンパク質(ACTN)の発現を示しています(図1C、D)。

一方、このプロトコルの成功は、中間心外膜状態誘導による心臓特異的線維芽細胞の生成に依存しています。ここでは、CHIRによるWntシグナル伝達の再活性化後、心外膜細胞が8日目に心臓中胚葉前駆細胞から得られます(図2A)。これらのhiPSC-EpiCは、単一のコロニーにグループ化された大きな細胞であり、線維芽細胞培地で再プレーティングすると、紡錘形の形態の心線維芽細胞が生じます(図2C)。したがって、合計18日間の分化後、hiPSC-CFはFACS分析によりDDR2の発現が90%以上を示します(図2B)。このコラーゲン受容体は、CFマーカーとして特徴付けられ、IF染色によっても観察できます(図2D)。

図1:hiPSCから得られるCMの分化タイムラインと免疫蛍光法およびフローサイトメトリーの特性評価 (A)hiPSCから得られるCMの分化と精製ステップの全体的なスキーム。(B)21日目のhiPSC-CMs純度(cTNT+ 細胞の割合)のフローサイトメトリー定量。(C)精製ステップ後(21日目)の細胞の代表的な位相コントラスト画像。スケールバー = 100 μm. (D) ACTNで染色した完全分化型hiPSC-CMs(緑)とDAPIで染色した核(青)の共焦点画像。スケールバー = 25 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:hiPSC-CFの分化タイムラインと免疫蛍光法およびフローサイトメトリーの特性評価。 (A)hiPSC心外膜細胞に由来するCFの分化の全体的なスキーム。(B)18日目のhiPSC-CFの純度(DDR2+ 細胞の割合)のフローサイトメトリー定量と培養物の代表的な位相コントラスト画像(C)。スケールバー = 100 μm. (D) DDR2 で染色した hiPSC-CF (緑) と DAPI で染色した核 (青) の共焦点画像。スケールバー = 25 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

MEWによるPCLスキャフォールドの生成
足場の機械的特性は、層の総数、繊維密度、直径、分布、および細孔形状によって決まります。これらは、細胞の挙動に強く影響を及ぼす基本的な側面です。設置後、装置をセットアップし(図3A)、このプロトコルに記載されている印刷設定(7 kV、コレクタ距離10 mm、2 bar、ヘッド/ノズル80/65 °C、コレクタ速度1080 mm/s、シリンジチップ23 G)に従って、500 μm x 500 μmの正方形の細孔形状の15層の正方形の足場を生成しました(図3B)。PCL繊維は層ごとに正しく堆積され、繊維径は約15μmでした。

図3:MEW機器と繊維状足場の製作。 (A)MEWセットアップ(i)およびMach3ソフトウェア(ii)。プリンターヘッドとコレクタープレート(iii)、および印刷中のテイラーコーン形成(iv)の図。(B)繊維状正方形足場の位相コントラスト画像(i)と精密繊維堆積の増幅(ii)。スケールバー = 250 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3D心臓ミニ組織機能の特性評価
シングルセル解離後、8:2 hiPSC-CMs:hiPSC-CFsからなるCell Mixをフィブリンハイドロゲル内のMEW PCLスキャフォールド上に播種しました(図4A)。37°Cで1時間のインキュベーション後、フィブリンが安定して形成され、細胞はゲル全体に均一に分布し、メッシュの細孔全体を覆います(図4B)。hiPSC-CMはほとんどが非有糸分裂性であり、他の細胞タイプのように細胞増殖に頼って細孔を埋めることはできないため、これは重要です。細胞は、細胞の伸長によって周囲のマトリックスの急速なリモデリングが証明され、プレーティング後2日という早い時期に局所的な自発的な拍動が見られました。IF染色分析では、ゲル全体に細胞が混在し、PCLメッシュと相互作用し、大部分のCM(ACTN+ VIM-)がVIM+ ACTN-hiPSC-CFと間隔を空けて配置されていることが示されました。hiPSC-CMは、等間隔のACTNタンパク質染色を特徴とするよく組織化されたサルコメア構造を示します(図4C)。100万個の細胞からなる心臓組織は、メッシュ全体にわたって安定した収縮を示し、7日目の拍動頻度は約30bpm(28.93 ± 11.2、平均±SD)でした。この機能的能力は、培養中の全日を通じて維持され、14日目までわずかに低下しました(17.18±12.6、平均±SD)(図4D)。代謝活性を分析すると、組織は培養全体で細胞の生存能力を維持することが示されており、大きな変化はなく、ここでは7日目と7日目として分析されています。14日目(図4E)。最後に、1週間後の組織のトラックポイント分析では、収縮速度は38.53μm/s±19.8(平均±SD、n = 16)、収縮振幅は28.91μm±15(平均±SD、n = 16)であることが示されました(図4F)。

図4:ヒト3D心臓ミニ組織の作製と、組織の構造、機能、細胞生存率の特性評価 (A)hiPSC由来の心細胞、MEWプリントされたスキャフォールド、およびフィブリンハイドロゲルカプセル化を組み合わせた組織作製の全体的なスキーム。(B)叩くミニ組織の代表的な位相コントラスト画像。スケールバー = 250 μm. (C) 3D組織化の共焦点Zスタック画像;hiPSC-CMはACTN(緑)、hiPSC-CFはVIM(赤)、核はDAPI(青)で染色します。MEW メッシュは矢印で示されます。スケールバー = 250 μm. (D) 生成から14日目までの組織の鼓動速度の推移。データは、SD が N = 3、n = 2-4 の平均として表されます。(E)7日目から14日目までの組織の細胞生存率(代謝活性によって分析)。データは、SD が N = 3、n = 3-6 の平均として表されます。(F)1週間での自発的に拍動する心臓ミニ組織の収縮分析。収縮速度(μm/s)と収縮振幅(μm)は、SD(n = 16)の平均で表されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

著者には利益相反はありません。