DNAテンションプローブの細胞内破壊と送達に基づく細胞メカノタイプのハイスループットフローサイトメトリー測定

サマリー

この方法では、リガンドを提示する固定化されたDNA二本鎖を切断する細胞の傾向を測定して、相対的な細胞牽引力を報告します。破裂した蛍光オリゴを細胞内に送達し、フローサイトメトリーで解析して、細胞の機械的履歴を記録します。これにより、細胞メカノフェノタイピングの文脈で細胞力発生のハイスループット測定が可能になります。

要約

機械的な力が多くの重要な細胞プロセスを導き、細胞の機械的表現型、または機械型は多くの疾患で破壊されます。細胞の力を定量化するために最も広く使用されている方法は牽引力顕微鏡法であり、これは従来、蛍光ビーズを含む弾性基板を変形させたり、マイクロポストを偏向させたり、固定化された分子張力センサーのコンフォメーションを変化させたりする細胞の高解像度顕微鏡法によって、細胞が周囲に及ぼす力を捉えます。ここでは、確立されたDNAテンションプローブを使用して相対的な細胞牽引力を測定し、フローサイトメトリーで定量化するハイスループット法を紹介します。この方法には、以下で説明する 5 つの全体的な手順があります。まず、DNA連結HUHタグに融合した高親和性インテグリンリガンドエチスタチンの発現と精製。第二に、レポーターとリガンドを含むDNAデュプレックスプローブの調製;第三に、プローブの表面処理と固定化。第四に、「Rupture and Deliver」テンションゲージテザー実験と流れの読み出しの実行。最後に、実験結果のデータ解析と解釈について説明します。

概要

機械的な力は、遊走¹から幹細胞分化²、T細胞が正しい抗原提示細胞³に結合して活性化される能力まで、多くの重要な細胞プロセスを導きます。機械的変数は疾患において調節不全であり、その結果、細胞の細胞の機械的表現型または機械型に測定可能な違いが生じる^4,5。メカノタイプは、細胞や組織の機械的特性の総称であり、収縮性、移動性、接着性、変形性などのパラメータを含めることができます。細胞や組織の硬さは、ハイスループットで測定できるため、測定されるメカノタイプの最も一般的な側面です。たとえば、がん細胞は正常細胞よりも硬いことがよくありますが、転移細胞は多くの場合、より準拠しています^6,7。細胞による力の生成は^{、特定の細胞}と環境の相互作用をプローブするため、疾患8で変更されるメカノタイプの重要な側面です。牽引力顕微鏡法は、細胞の力の発生を測定する最も一般的な方法であり、蛍光ビーズが埋め込まれた変形可能な弾性基板またはマイクロポストのアレイに細胞をめっきし、ビーズの動きやポストのたわみの変化を追跡して、細胞が加える力を計算します。分子張力センサは、牽引力の測定にも使用されており、特定のリガンド-受容体ペア^9,10によって生成される力の小さな大きさおよび測定力に対する感度の利点を提供する。しかし、従来のTFMセンサーや分子張力センサーによる細胞力の測定は、高解像度のイメージングに依存しているため、測定のスループットには限界があります。

私たちは最近、DNA二本鎖テンションプローブを、細胞メカノフェノタイピング¹¹の文脈で細胞力生成のハイスループットな読み出しに適合させました(図1)。簡単に説明すると、広く使用されているテンションゲージテザー(TGT)プローブ¹²から適応されたDNA二本鎖は、「アンカー」鎖¹³のビオチン-ニュートラアビジン化学を介して96ウェルプレートのウェルに固定化される。TGTデュプレックスの必要な破断力は、アンカーストランド上のビオチンの位置を変えることで調整でき、デュプレックスの形状が変化し、破断力のアンジップコンフォメーションが小さくなる(図2A)か、破断力のせん断コンフォメーションが大きくなる(図2B)かのどちらかになります。アンカー鎖にはビオチンと蛍光クエンチャーが含まれ、DNAの「リガンド」鎖には蛍光プローブと、インテグリンなどのメカノセンシングに関与する細胞表面受容体を認識するリガンドが含まれています。リガンドは、リガンド^14,15に融合したHUHタグと呼ばれるDNA連結融合タグを使用することにより、DNAに共有結合的に結合される(図3)。HUHタグは、ウイルスの複製やその他のプロセスに関与する小さなHUHエンドヌクレアーゼドメインで、一本鎖DNAの9 bpの配列/構造を認識し、それをニックし、ニックDNAの5'末端に共有結合ホスホチロシン付加体を形成します。

これらのプローブの上に播種された細胞は、リガンドに結合し、発生する力に比例してプローブの一定の割合を破裂させます。その後、その受容体に結合した蛍光リガンド鎖が細胞内に送達されます。したがって、細胞の機械的履歴は、その蛍光の大きさを介して目的の細胞に記録されます。蛍光は、フローサイトメトリーを使用して定量化できます。この方法を Rupture and Deliver-TGTS または RAD-TGT と呼んでいます。この方法は、蛍光を測定するだけでなく、したがって、一度に数千の細胞によって生成される相対的な力を測定するだけでなく、フローサイトメトリーの読み出しは、細胞をメカノタイプごとに分類する可能性を提供し、ダウンストリームのオミクス読み出しだけでなく、細胞のメカノタイプを変更する遺伝子や薬物を特定する可能性のあるCRISPR-KOまたは薬物スクリーニングを可能にします。

以下のプロトコルでは、RAD-TGT実験の準備と実行の方法を示します。WDV(小麦矮星ウイルス由来)として知られるHUHの一種の発現と精製を強調し、それ自体がネガティブコントロールとして機能し、エシスタチンに融合します。これは、細胞と環境の間で力を伝達するリガンドであるエキスタチンに融合します RGD結合インテグリンとして知られている、実験条件として機能します。ここから、実験用のRAD-TGTの作り方を実演します。実験の進め方や、得られたデータの解析方法についてご説明します。また、ROCK阻害剤がCHO-K1細胞内のインテグリン媒介力をどのように変化させるかを測定することにより、RAD-TGTの応用に焦点を当てます(図4)。要約すると、このプロトコルが、以前の経験に関係なく、メカノバイオロジーへの入り口として機能することを願っています。この分野は初期段階にあり、理解を深めるためにはすべての背景が不可欠です。

プロトコル

1. HUHの発現と精製

1. WDV(±エキスタチン)プラスミドで 大腸菌 を形質転換し、形質転換ごとに約1.5 μL~50 ng/μLプラスミドを形質転換し、アンピシリン寒天プレート上で増殖します。
2. 5 mLのLBに単一コロニーを接種し、37°Cで一晩増殖させます。
3. 1 L の LB に一晩培養して接種し、OD₆₀₀ が ~0.8 に達するまで成長させます。
4. 温度を18°Cに下げ、500 μMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導し、一晩インキュベートします。
5. 細胞を3,750 × g で30分間遠心分離してペレット化します。ペレットを40 mLの溶解バッファー(300 mM NaCl、50 mM Tris pH 7.5、1 mM EDTA)で再懸濁します。
6. 70%デューティサイクル、電力7で氷上で3 x 90秒の超音波処理で細胞を溶解します。24,000 × g で 4 °C で 30 分間スピンダウンし、上清を新しい 50 mL チューブに注ぎます。
7. Ni-NTA樹脂スラリーを15mLのコニカルチューブ(ビーズ懸濁液1mL/培養L)に入れ、700 × g で2分間スピンダウンし、上清を除去します。
8. レジンに6 mLの水を加え、ステップ1.7の洗浄プロセスを繰り返します。
9. 水の代わりに洗浄バッファー(300 mM NaCl、50 mM Tris [pH 7.5]、1 mM EDTA、20 mM イミダゾール)を使用して、洗浄を2回繰り返します。ビーズを5 mLの洗浄バッファーに再懸濁します。
10. 溶解した細胞(ステップ1.6)にビーズスラリー(ステップ1.9)を加え、十分に混合します。溶解した細胞とビーズを4°Cで少なくとも1時間回転させます。
    注:このプロトコルの残りの部分では、レジンを乾燥させて、カラムを流れるすべてのサンプルを収集しないでください。
11. 混合物を20 mLカラムに注ぎ、フロースルーを回収します。カラムを 4 × 25 mL の洗浄バッファーで洗浄します。
12. 10 mL × 10 mL の溶出バッファー (300 mM NaCl、50 mM Tris [pH 7.5]、1 mM EDTA、250 mM イミダゾール) を新鮮な 15 mL チューブに入れて溶出し、早期溶出と後期溶出を別々に集めます(早期溶出を最初の 1 mL、後期溶出を最終 1 mL)。
13. ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により、採取したすべての画分を分析し、溶出中にHUHが採取されたことを確認します( 補足図S1を参照)。最良の結果を得るには、4〜20%ゲルをロードし、35 Wおよび200 Vで45分間分析します。
14. 溶出したタンパク質を透析チューブに加え、透析バッファー(溶解バッファーと同じ)で4°Cで一晩インキュベートします。 HISタグを取り外すには、タンパク質を透析チューブに入れる前に、溶出するタンパク質に還元剤を含まないULP1を直接添加します。
15. 翌朝、ステップ1.7-1.9で説明したようにNi-NTA樹脂を調製し、透析タンパク質とインキュベートします。タンパク質とNi-NTA樹脂の混合物をカラムに注ぎ、フロースルーを回収します。カラムを 10 mL の透析バッファーで洗浄し、フロースルーを回収します。
16. 上記の設定に従ってSDS-PAGEで収集した画分を評価してタンパク質が存在することを確認し、分子量10 kDaのカットオフ値を持つ15 mL超遠心フィルターを使用して目的の濃度まで濃縮します( 補足図S1を参照)。
    注:理想的な最終タンパク質濃度は40μMから100μMの間です。

2. RAD-TGTの調製

1. アンカーストランド(クエンチャー付き)とリガンドストランド(蛍光色素付き)のモル比1.1:1で、最終濃度40 μMのリガンドストランドで、10 mM Tris(pH 7.5)、50 mM NaCl、および1 mM EDTAの溶液中でデュプレックスを組み立てます。
2. 98°Cで5分間インキュベートした後、室温で1時間冷却してアニールします。光から保護します。
   注:少量のサンプルは蒸発しやすく、完全に回収するのが難しい場合があります。必要以上に大量のものを用意してください。
3. アニーリングした二本鎖をHUH(アニーリング時に最も存在量が少ない鎖の濃度を使用、この場合はリガンド鎖を使用)と1:2モル比で1:2モル比で反応させ、最終濃度10 μM二本鎖および1 mM MnCl₂、50 mM HEPES(pH 8)、50 mM NaClを含む溶液中で20 μM HUHを反応させます。
4. 反応を37°Cで30分間インキュベートし、サーマルサイクラーまたは光保護ヒートブロックでインキュベートします。インキュベーション後、火から下ろし、ベンチトップのミニフュージを使用して、組み立てたTGTをスピンダウンします。TGTをすぐにプレートするか、暗所で4°Cで保存します。

3. 表面処理

1. 96ウェルのガラス底板を開けたらすぐに、すべてのウェルを接着性PCRプレートホイルで覆い、未使用のウェルを後で使用するために保存してください。かみそりの刃を使用して、目的のウェル(できればエッジのないウェル)でホイルを切り取り、目的のウェルに100μLの冷たいPBSを追加します。
   注意: ウェルに液体を加えたら、ウェルを乾かさないでください。乾燥が発生すると、生体分子の表面への非特異的吸着がデータに悪影響を及ぼします。乾燥を防ぐために、100μLの余剰容量をウェルに継続的に保管してください。
2. 200 μLの冷たいPBSをウェルに加え、2〜5回静かにピペットで混合し、200 μLのPBSを取り除きます。合計3回の洗浄を繰り返します。
   注意: ウェルに液体を追加したり取り除いたりするときは、表面が乱れないように、ピペットの先端をウェルの端に45°の角度で置いてください。これは、セルをめっきするときを除くプレートのすべての取り扱いに対して行います。
3. 実験用ウェルの場合は、PBS中に0.1 mg/mLのビオチン化BSA溶液を調製し、その溶液80 μLを目的のウェルに加えます。コントロールウェルの場合は、18.75 μg/mL フィブロネクチンを添加して同じ溶液を調製し、それぞれのウェルに 80 μL を加えます。使用したすべてのウェルをピペットで静かに混合し、蓋をプレートに置き、ホイルで覆います。室温で1時間インキュベートします。
4. ウェルから80μLの容量を取り出し、手順3.2を繰り返してウェルを洗浄します。ステップ3.3と同じ方法で、0.1 mg/mLのニュートラアビジン80 μLをPBS溶液に加えます。
5. インキュベーション後、ウェルから80 μLの容量を取り出し、ステップ3.2を繰り返します。アセンブルしたTGT(RAD-TGT調製ステップ2)を、ステップ3.3と同様の方法で、PBSおよびウェルへの80μL溶液で0.1μMに希釈します。ウェルを接着ホイルで覆い、4°Cの暗所で保存するか、光から保護して室温で1時間インキュベートしてから実験を進めます。
   注:ステップ3.5を停止点として扱い、実験を進めるには翌日まで待つことをお勧めします。

4. RAD-TGT実験プロトコール

1. TGTが接着するのに十分な時間が経過した後、ウェルをPBSで3回洗浄し(ステップ3.2を参照)、続いて無血清培地で2回洗浄します。最終洗浄後、メディアをウェルに入れておきます。200 μLのPBSを周辺ウェルに添加してエッジの影響を軽減し、プレートを37°Cのインキュベーターに移してプレートを予温します。
2. 目的の細胞を~80%のコンフルエント度で回収し、培地を吸引した後、PBSを添加して吸引して細胞を洗浄します。適量のトリプシンを添加し、細胞が解離するまで(~5〜10分)プレートを37°Cの細胞培養インキュベーターに置きます。
3. 細胞が解離したら、細胞の維持に使用した全細胞培地の原量をプレートに加え、血清ピペットで再懸濁します。細胞懸濁液を15mLのコニカルチューブに加えます。
4. 細胞を300 × g で4分間遠心分離し、培地を吸引し、ペレットをPBSに再懸濁します。遠心分離と吸引を繰り返し、その後、5 mLの無血清培地に再懸濁し、遠心分離と吸引を繰り返します。細胞を~2 mLの無血清培地に再懸濁します。
5. 再懸濁した細胞の密度を決定し、必要に応じて濃度を調整します。
   注:ウェルあたり~15,000個の細胞を播種することを目標としているため、細胞を150,000細胞/mLの濃度になるように調製し、15,000個の細胞に100μLの再懸濁細胞を播種することができます。
   1. オプション:薬物またはその他の薬理学的物質の効果をテストする場合は、適切な濃度の薬物を細胞に追加し、細胞をインキュベーターに戻します。次のステップに進む前に、十分なプレインキュベーション時間を確保してください。
6. インキュベーターからプレートを取り出し(ステップ4.1)、予熱したプレートの実験ウェルから洗浄液に残った量の培地を取り除きます。希望のメディアで一度洗ってください。再懸濁した細胞100μLを目的のウェルに慎重にピペットで移します。播種した細胞をインキュベーターに90分間移します。
   注:ピペットを垂直に保つようにしながら、細胞をウェルの中央に静かにピペットで固定します。
7. インキュベーション後、ウェルから~125-170 μLの容量を取り出します。必要に応じて、温めたPBS200μLで細胞をやさしく洗浄します。各ウェルに50μLのトリプシンを加え、細胞が解離し始めるまでプレートをインキュベーターに戻します(5〜10分)。
   注意: 井戸が乾燥しないようにし、過剰トリプシン化が発生しないようにしてください。
8. 調製したばかりのフローバッファー160 μL(1 mM EDTA、2% w/vウシ血清アルブミン、冷PBS溶液)をウェルに加えます。ピペットで静かに上下させて細胞を解離し、この細胞懸濁液196μLをPCRチューブに加え、続いてヨウ化プロピジウム4μLを加え、穏やかに混合します。生存率ゲーティングのコントロールとして機能するヨウ化プロピジウムを含まないコントロールサンプルを1つ調製します。
9. チューブを蓋の遮光光のある氷のバケツに入れ、フローサイトメーターで蛍光強度の測定に進みます。

5. データの収集と分析

1. フローサイトメーターで各サンプルを分析します。サンプルあたり少なくとも2,000個の生きた単一細胞を収集することを目指します。
   注:まだ分析されていないサンプルの光への曝露を最小限に抑え、氷上に保管してください。
2. すべてのデータが収集されたら、選択したソフトウェアにファイルを転送し、セルをゲートします。
   1. 前方散乱領域(FSC-A)と側方散乱領域(SSC-A)による細胞のゲート。
   2. FSC-Aと前方散乱高さ(FSC-H)による細胞集団内のシングレットのゲート。
   3. ステップ4.8で調製したヨウ化プロピジウムなしコントロールの最高値にヨウ化プロピジウム面積強度のヒストグラムに垂直ゲートを設定することにより、一重項集団からの生細胞をゲートします。ゲートを超えないイベントはすべてライブセルです
   4. シングレットのCy5領域(Cy5-A)強度のヒストグラムに垂直ゲートをセットして、細胞破片によって引き起こされるCy5-Aチャネル上の非蛍光イベントを除去します。この垂直ゲートが、分析した非標識細胞よりも小さい値で、蛍光強度が0より大きいことを確認してください。
   5. 細胞集団を解析するには、バイセクターゲートをそれぞれのネガティブコントロールの99^パー センタイルに設定します。
   6. 対応する実験条件と同じ強度のゲートを適用し、各条件でネガティブコントロールゲートを超える細胞の割合を収集します。
      注:パーセンテージは、適切な統計分析を介して生物学的複製間で直接比較できます。「代表的なデータ」を参照してください。
3. Cy5 蛍光の中央値を使用してデータを分析し、リガンド-WDV の強度の中央値を WDV のみの中央値で除算し、これらの値を反復間で比較します。

結果

RAD-TGTの有用性と使いやすさを実証するために、CHO-K1細胞のメカノタイプに対するRhoキナーゼ(ROCK)阻害剤の影響を分析しました。ROCK経路は、アクチン組織化とミオシン活性化に関与しています。TGTを用いた先行研究では、ROCK阻害がせん断TGTの破裂を減少させることが示されている16,17,18。せん断TGTまたは高力TGTは、焦点接着によって加えられる収縮力を報告しますが、解凍または低力TGTは、焦点接着形成の初期接着、細胞拡散、および初期ステップに関与する低細胞力に敏感です。したがって、Y-27632 処理は、以前にミオシン II 阻害剤であるブレビスタチン¹¹ で観察されたように、TGT の解凍の影響が少なく、ビヒクル制御と比較してせん断コンフォメーションの RAD-TGT 蛍光シグナルを減少させると予想されます。

RAD-T...

ディスカッション

私たちは、ライフサイエンス分野の科学者がワークフローにメカノタイピングを組み込むことを奨励することを目的として、RAD-TGT実験の設定方法と実行方法に関するプロトコルを提供してきました。RAD-TGTの主な利点は、特にタンパク質生産能力を持つ患者にとって、HUHエンドヌクレアーゼを使用して、化学的な架橋や精製を行わずに、リガンドをDNA二本鎖に高い忠実度でライゲーションできることです。HUHエンドヌクレアーゼは、部位特異的に一本鎖DNAに結合するヌクレアーゼファミリーを包含しています。HUHは特に興味深いもので、結合後、DNA骨格を切断し、新たに露出した5'末端と共有結合付加体を形成します。これらの反応は迅速で、数分以内に完了まで実行できます。HUHは、その小型サイズと単純なメカニズムにより、多くのタンパク質の末端に付加することができ、元のタンパク質とHUHの両方が機能を保持します。これを利用して、目的の配位子をデュプレックスに迅速に結合させ、テンションゲージテザーをワンステップ反応で組み立てました。HUHの融合パートナーとしての快適性により、RGD結合インテグリン以...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15 mL コニカルチューブ	Sarstedt	62.554.205
96 ウェルガラス底板	Cellvis	P96-1.5H-N
接着性 PCR プレート箔	サーモフィッシャーサイエンティフィック	AB-0626
アンピシリン	Apex バイオリサーチ製品	25-530
Bio-Rad 20 mL カラム	Bio-Rad	7321010
Biotinylated BSA	Thermo Fisher Scientific	29130
BL21 (DE3) Competent E. coli	New England Biolabs	C2527H
Bovine Serum Albumin	Thermo Fisher Scientific	BP9703100
Cell Culture Incubator	Thermo Fisherサイエンティフィック	51030284
遠心分離機	サーモフィッシャーサイエンティフィック	75009521
CHO-K1	ATCC	CCL-61
透析チューブ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PI88242
DMSO	サーモフィッシャーサイエンティフィック	D12345
EDTA	サーモフィッシャーサイエンティフィック	S311-100
フローサイトメーター	BD	Accuri C6 Plus
FlowJo	BD	FlowJo v10.10
HEPES	サーモフィッシャーサイエンティフィック	BP310-1
イミダゾール	サーモフィッシャーサイエンティフィック	O3196-500
IPTG	IBI サイエンティフィック	IB02125
LB 寒天	フィッシャーサイエンティフィック	BP1425-500
リガンドスタンド	統合DNA技術	ユーザーが設計したオリゴ	GCT ATA、AAC、TCA、CCG、TAA、TTT、GGC、CCG、CAG、CGA、CCA、CCC、TTT、3Cy5Sp、
Lysogenyブロス(LB)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	BP1426-500
MnCl<サブ>2	サーモフィッシャーサイエンティフィック	M87-100
NaCl	モフィッシャーサイエンティフィック	BP358-212
トラビジンプロテイン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31000
ニッケルNTA樹脂	サーモフィッシャーサイエンティフィック	88222
PBS	コーニング	21-031-CV
ペトリ皿	VWR	25384-342
ヨウ化プロピジウム溶液	ケイマンケミカル	10008351
SDS-PAGE ゲル	バイオ・ラッド	4561096
無血清培地	サーモフィッシャーサイエンティフィック サイエンティフィ	A4124801	Gibco Optimem Used, alternative serum free medias are fine to use
Shearing Anchor Strand	Integrated DNA technologies	user designed oligo	/5IAbRQ//iBiodT/G GGT GGT CGC TGC GGG GGG CC
Sonicator	Thermo Fisher Scientific	15-345-139
Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096
Tris	Thermo Fisher Scientific	BP152-500
トリピン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12605036
超遠心フィルター、10 kDaカットオフ	Amikon
Unzipping Anchor Strand	統合DNAテクノロジー	ユーザーが設計したオリゴ	/5IAbRQ/GG GTG GTC GCT GCG GGC C/3Bio/
WDV プラスミド	AddGene	226983
WDV-エチスタチンプラスミド	AddGene	226985
Y-27632	セレックケミカルズ	S1049DMSO	で再構成