ここでは、継代0のケラチノサイトの系統を手動で追跡するために使用できるライブセルイメージング解析の方法を提供し、細胞分裂の運命や細胞周期の持続時間などの増殖指標を収集できるようにします。
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この記事について
サマリー
要約
生細胞イメージングは、 in vitroでケラチノサイトの挙動を研究するための進化途上の、やや挑戦的な方法です。歴史的に、ケラチノサイトの分裂挙動は、クローン解析、免疫染色、細胞周期解析などの方法によって研究されてきました。これらの方法のいずれも、単一細胞レベルでのケラチノサイトの挙動をリアルタイムで解析することはできません。過去10年間、グループはライブセルイメージングを利用して、標識を必要とせずにケラチノサイト幹細胞とコミットされた前駆細胞を同定してきました。それぞれのグループの分裂挙動、終末分化の速度、および細胞周期の持続時間に違いが特定されています。ここでは、タイムラプス撮影によるケラチノサイト生細胞イメージングの方法とその解析方法について説明する。この方法では、イン ビボ の挙動を最も忠実に模倣するために、未継代のケラチノサイトを利用することが推奨されます。ライブセルイメージングは、幹細胞とコミットされた前駆細胞の挙動をシングルセルレベルで研究し、分裂運命、細胞周期の持続時間、およびその他の増殖指標を決定する独自の機能を提供します。
概要
細胞集団が長期間にわたって拡大する様子を in vitro でリアルタイムに可視化できることは、生細胞イメージングのユニークな利点です。ライブセルイメージングでは、細胞の運動性、遊走、増殖をシングルセルレベルで評価することができます。このプロトコルの目標は、タイムラプス写真によるケラチノサイト培養の視覚化を最適化し、手動で追跡して細胞の挙動に関する詳細なデータを取得できるビデオを作成することです。
私たちの焦点は増殖速度論にあります。ライブセルイメージングビデオの解析から、系統樹を解明し、分裂間の時間(細胞周期の持続時間の代理)や、娘細胞のさらなる分裂と分化につながる分裂の割合を評価することができます。
初代ケラチノサイトを扱う際には、ドナー間のばらつきが大きく、細胞増殖の試みが頻繁に失敗する。このため、多くの研究者は、HaCaT細胞や新生児ケラチノサイトなどの増殖性の高いケラチノサイトを使用することを選択します。成人または老化した皮膚から初代ケラチノサイトを培養し、系統追跡を行うことは困難な場合があります。しかし、細胞株や男性の包皮由来の継代細胞の使用には問題があります。継代を繰り返すと、in vivoの状態とは大きく異なる細胞が得られます2。さらに、HaCaT細胞は、複数のアッセイで初代ケラチノサイトとは異なる反応を示すことが示されています3,4,5。in vivoの対応物に最も近い細胞を利用するために、成人のヒトドナーからの継代0ケラチノサイトが利用されます。ケラチノサイト幹細胞とコミットされた前駆細胞は、挙動に明確な違いを示し、これにより、ライブセルイメージング6を介していずれかの集団のコロニーを区別することができます。この比較的新しい能力は、単一ケラチノサイトの長期にわたる挙動を視覚化するもので、同様の技術を用いた以前のいくつかの研究でしか使用されていませんでした6,7,8。このプロトコールでは、IncuCyte S3 Live-Cell Analysis Systemを用いた初代ケラチノサイトのライブセルイメージングについて概説します。構築された系統樹から、コロニーのタイプ(幹細胞とコミットされた祖先)、細胞周期の期間、分化分裂の割合を判断できます。
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プロトコル
この研究は、ヘルシンキ宣言に従って実施されました。すべてのヒト組織は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校(UCSF)の治験審査委員会(IRB)の承認後に取得され、使用されたすべての組織について同意が得られました。
1.通過0人のヒトケラチノサイトのタイムラプス撮影
注:このプロトコルは、IncuCyte S3およびSX5に特有のものです。
- 研究にヒト組織を使用するために、機関のヒト研究委員会から適切な承認が得られていることを確認してください。
- 前述のように、新鮮な肌からケラチノサイトを単離します9。
- アッセイの播種密度を決定します。異なるドナーからの複数の希釈液のサンプルを使用してパイロット研究を実施し、研究に十分なコロニーを確保しながら、観察期間中にコロニーが重複する過剰なコロニーを防ぐために必要な細胞密度を理解します。これらのパイロットは、同じ実験条件(同じプレート、試薬など)で実行してください。これらの要因によって結果が変わる可能性があるためです。
注:播種密度が低すぎると成長が不十分になり、播種密度が高すぎると、フィールド内の細胞が密集しているため、細胞を正確に追跡できなくなります。- コレクション培地に4°Cで保存されたコレクションから48時間未満の新生児包皮からの継代0ケラチノサイトの場合、播種密度が1000-5000 / cm2であることを確認してください。P1ケラチノサイトの場合、500-2000細胞/ cm2を使用します。通路が遠いほど、播種密度は低くなります。
- 選択したプレート サイズのプレート セル。
注:96ウェルプレートとマイクロプレートにはメニスカス効果があり、細胞分布が不均一になり、成長の大部分がイメージャーのフィールド外にあります。より大きなウェルを持つプレート(たとえば、24ウェルプレート)では、より多くのデータをキャプチャできます。24ウェルプレートで最大36個のフィールドを視覚化できますが、96ウェルプレートでは最大5個のフィールドのみを視覚化できます。ただし、機器でキャプチャされるフィールドの数には限りがあり、フィールドが増えるとイメージャの容量がより多く消費されます。通常、24ウェルプレートが使用されます。- プレート上の細胞の均一な分布を達成するために、さまざまな手法を使用することができます。まず、各ウェルを個別に播種するのではなく、特定の希釈ですべてのウェルに必要な全培地をマイクロチューブに分注します。次に、アリコートが目的の密度に達するために必要な細胞の総数をピペットで取り、チューブを穏やかに反転させて細胞を均一に分布させます。
- めっき後、プレートをクロスパターンで3回(上下左右)動かし、慎重にインキュベーターに移します。
注意:マイクロプレートを使用する場合は、タイムラプス顕微鏡がイメージング時に熱を発生し、それらのウェル内の媒体が蒸発する可能性があるため、ウェルの外側の行と列は避けてください。実験用ウェルは、プレートの中央にグループ化し、蒸発/エッジ効果を減らすために、PBSまたはその他の滅菌流体を最大容量で含むウェルで囲む必要があります。
- 細胞を37°Cおよび5%CO2 で24時間インキュベートし、接着可能にします。
- 24時間後にメディアを交換します。
注意: 吸引するときは、成長している単層を邪魔しないでください。常に温めた培地(37°C)を使用し、側壁を使用して培地をウェルに穏やかに流します。ここで使用している培地は、エピライフ/サプリメントS7/プリモシンです。このアプリケーションには、長期の生細胞イメージングのための培地中の抗生物質の使用が推奨されます。複数の同時実験に使用される機械での長期培養は、汚染のリスクが高くなります。ペニシリンとストレプトマイシンが一般的に使用されます。 - 左下の大きな三角形のボタンを押してインキュベーターを開き、ライトが緑色のときにトレイを開きます。船を開いた湾に置きます。次に、左下にある同じボタンを使用してトレイを閉じます。開くボタンが赤のときは、トレイがアクティブにスキャン中であり、スキャンが中断されるため、トレイを開かないでください。
注意: スキャンが行われていないことを確認するには、コントローラモジュールの画面を見てください。次のスキャンまでの時間とスキャンの長さを示します。スキャンが開始されている場合は、スキャンが完了するまでの時間が与えられます。 - コンピュータでアプリケーションを開き、適切なユーザIDとパスワードを使用してログインします。 [スケジュール] を選択します。
- スケジュールの下の左上隅にある + ボタンを押して、プレートをスケジュールに追加します。
- 「スケジュールに従ってスキャン」を選択し、「次へ」をクリックします。
- [ 新規] を選択し、[ 次へ] をクリックします。
注:このプレートが以前の実験または実行中の実験と同一である場合は、「 Copy Previous 」または 「Copy Current 」を使用して実験のフォーマットを迅速化できます。 - スキャンの種類として [標準 ] を選択し、[ 次へ] をクリックします。
注:Image Lockは、ピントの喪失/画像のジャンプの発生を最小限に抑えるのに役立つ独自の96ウェルプレートであり、これらの問題に直面した場合に役立ちます。他のスキャン・タイプは、リネージ・トレーシングには特に役立ちません。 - スキャン設定については、「 Adherent Cell-by-Cell using the phase channel at 10x Objective」を選択し、「 Next」をクリックします。
注:フェーズチャネルが選択されている限り、データがキャプチャされた後に分析を開始できるため、この時点で分析オプションを選択する必要はありません。 - 船舶を選択し、[ 次へ]をクリックします。最も一般的な容器は装置と互換性がありますが、マイクロプレート以外のものは、タイムラプス顕微鏡のベイに収まるように特別なアタッチメントが必要になる場合があります。
- 空いているベイを選択して船舶を配置し、[ 次へ]をクリックします。
- スキャンするウェルとウェルごとの画像を選択し、[ 次へ] をクリックします。推定スキャン時間は、画面の左下に表示されます。
- 目的の名前付け規則を使用して実験に名前を付けます。後で参照できるように実験のプレートマップを作成し、[ OK]をクリックします。最後に、[ 次へ] をクリックします。
- スキャンが完了した後にセルごとの分析を開始する必要があるため、データ収集後まで分析を延期します。 「次へ」をクリックします。
- 最後に、イメージングの頻度を設定します。30分以上発生する有糸分裂を確実に追跡するには、ケラチノサイトを20分間隔でスキャンします。 [次へ ] を押して設定を確認し、実験を開始します。
注意: スキャン時間が重複することはできず、製造元は、スキャンしている限りマシンを静止させることを推奨しています。20分間隔の場合、最大10分をスキャンに費やす必要があります。24ウェルプレートの12ウェルをウェルあたり36ビューで画像化する場合、スキャンが完了するまでに7分かかるため、計画を立てる際には、実験に利用可能なリソースに常に注意する必要があります。- 機械を休ませる時間が不十分な場合、およびスキャン時間が重なる場合は船舶をスケジュールに追加できない場合は通知されます。船舶が定期的にスケジュールに収まらない場合は、「 トレイの予約場所 」をクリックして 「次へ」をクリックします。
- 画面上部のスケジュールをダブルクリックし、予備の船舶を選択してから、手動でクリックして空いている時間枠に画像を追加します。または、スケジュールが開いたら右クリックしてスケジュールされたすべてのスキャン時間を削除し、右クリックしてスキャン・グループの新しいスキャン時間を定期的に設定します。
注:これにより、新しい時間が設定されるまで、マシン上のすべての実験が中断されます。フロッピーディスクのアイコンをクリックして保存するか、赤いXを押してスケジュールの変更をキャンセルすることを忘れないでください。目的のウェルまたはビューの選択は、パラメータの選択時にマシンがすぐに推定スキャン時間を提供するため、簡単なプロセスです。スキャン時間は、選択したプレートの種類とブランド、およびスキャンするウェルまたはビューの数によって異なります。これにより、ユーザーはマシンの容量に合わせてスキャンパラメータを調整できます。
- ケラチノサイトの場合は、48時間ごとに培地を交換します。プレートの向きが正しいことを確認するには、容器を機械に入れるたびに最初のスキャンが完了するのを待ちます(時間が許せば)。それは単純な間違いです。プレートを機械にセットして、列を示す文字がベイの左側にくるようにします。
- スキャンを表示するには、目のアイコンが付いた [表示] ボタンを押してから、実験をダブルクリックします。培地の色が急激に変化した場合(酸性化によりフェノールレッドを含む培地が黄色になる)、過剰な死細胞が存在する場合(生きたコロニーの増殖を妨げる可能性がある)、または異常な形態が観察された場合は、培地の早期交換を検討してください。
- すべてのウェルが静止状態になるか、合流点に達したら、実験をエクスポートします。成虫のコロニーを~2週間、新生児を~10日間追跡しますが、その時点で混雑により分析のリターンが減少します。
- エクスポートするには、[ 表示 ] タブをクリックし、最近のスキャンのリストの下にある実験をダブルクリックします (デフォルトでは、最新の逆順に並べられます)。矢印の付いた ランドスケープ アイコンをクリックし、エクスポートツールが起動するのを待ちます。
- 「表示通り」をクリックし、「次へ」をクリックします。
- エクスポートする各ビューフィールドを手動でクリックし、[ 次へ]をクリックします。
- ムービーまたは一連の画像のどちらが必要かを選択し、エクスポートするスキャン時間を選択します。ケラチノサイト系統のトレースでは、ムービーオプションを使用してすべてのスキャンを選択します(これを迅速に行うために、破線付きのクイックすべて 選択 アイコンがあります)。 「次へ」をクリックします。
- 最高品質で1秒あたり1フレームでエクスポートします(品質の横にあるバーを使用して設定します)。 「次へ」をクリックします。
- ターゲットフォルダとファイルタイプを選択します。ファイルに名前を付けて、[ エクスポート] をクリックします。
注:インターネット接続の速度や関係するコンピューターによっては、ビデオのエクスポートに時間がかかる場合があります。大規模な実験のためにすべてのビデオファイルをエクスポートするには、数日待つことを覚悟してください。タイムラプス顕微鏡にリモートでログインできる機能は非常に便利です。
2. タイムラプスイメージングによる系統樹の構築とデータシートの生成
- メディアプレーヤーを使用してビデオファイルを開きます。VLCメディアプレーヤーをお勧めします。
- ビデオをスクロールして、成長しているコロニーを特定します。VLCでは、矢印キーを使用してフレームを前後にスキップします。追跡するコロニーのスクリーンショットを撮り、コロニーにラベルを付けます。
- ビデオ録画の終了時または数日後に目的のコロニーを特定し、ビデオを巻き戻してコロニー形成細胞を特定します。
注:これは、適切な播種密度を持つことが重要な場所です。隣り合って発生するコロニーが多すぎると、コロニーが拡大して互いに融合し、細胞分裂を正確に追跡できなくなります。 - セルが分裂しようとしているとき、セルは凝縮しているように見えます(図1)。分割が発生したら、ビデオを一時停止します。除算の時間を記録します (タイムスタンプは左下隅にあります)。この最初の分割のスクリーンショットを撮り、コロニーと同じラベルを付けます。手描きの系統図に分割を記録します(代表的な結果を参照)。できるだけ多くの世代を追跡し、文書化し続けます。
注:このプロセスを迅速化し、細胞をより正確に追跡するために、自動細胞追跡が開発されています/開発されています7。低カルシウム培養条件でも、分化が最小限に抑えられている機械学習モデルでは、ケラチノサイトの分裂を正確に追跡する感度が不足しているのが現状です。 - 手動系統ツリーをデータシートに転記します - スプレッドシートの色にちなんで「グリーンシート」と名付けられました(補足ファイル1)。
- グリーンシートを使用して、増殖分裂と分化分裂の割合を計算し、幹細胞とコミットされた前駆細胞コロニー、および細胞周期の持続時間を特定します(代表的な結果を参照)。
注:このマシンは、独自の基本分析装置および細胞ごとの分析装置を介してデータを分析し、他の複数のアッセイ(コンフルエンス、スクラッチ)を実行することができます。ただし、これはこのプロトコルの範囲を超えています。
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結果
初代ケラチノサイトは常同型的に増殖し、ライブセルイメージングで追跡することができます。VLCメディアプレーヤーは、録音の調査に使用されます。最初の分裂までの時間は変動し、年齢、健康状態、 in vitro 環境に存在する成長因子など、ドナーの特性に応じて数日になる場合があります。最初の播種時には、ケラチノサイトは小さく丸みを帯びた外観をしています(図1)。播種後、コロニー形成ケラチノサイトは通常、平らになります(図1)。これらの平坦化されたケラチノサイトは、分裂していないケラチノサイトよりも移動性が高い傾向があります(補足ビデオ1)。分裂する直前に、扁平になったケラチノサイトが中央で凝縮しているように見えます(図1)。
最初の分裂を除いて、分裂する(増殖性-P)ケラチノサイトの95%は、...
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ディスカッション
ケラチノサイトのライブセルイメージングは、幹細胞とコミットされた前駆細胞の分裂挙動を追跡するためのラベルフリーの方法です。表皮の維持が幹細胞とコミットされた前駆細胞の増殖動態に依存していることを考えると10、これらのケラチノサイト集団の変化とそれらがさまざまな条件でどのように影響を受けるかを詳細に理解することは、発見された欠陥を改善するための治療法の開発を促進します。
最終的に、ライブセルイメージングによる系統追跡は、使用可能なデータを取得することにかかっています。コロニー形成ユニットは、タイムラプス写真によって生成されたビデオではっきりと見える必要があります。新たに分離された継代0細胞では、真のクローン密度を得ることは困難です。めっきされたケラチノサイトのわずか3%〜4%が最終的にコロニーを形成します11。細胞が多すぎると、分裂を追跡したり、最初のコロニー形成細胞を特定したりすることができなくなる可能性があります。細胞...
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謝辞
この研究は、米国(U.S.) の Merit Review Award Number I01 CX001816 の支援を受けました。退役軍人省臨床科学研究開発(CSRD)サービス。内容は、米国退役軍人省または米国政府の見解を表すものではありません。実験を行うために彼のタイムラプス顕微鏡へのアクセスを提供してくれたマイケル・ローゼンブラム博士に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 96ウェルイメージロックプレート | サルトリウス | BA-04856 | 96ウェルプレートを使用する場合、機械対応のマイクロプレートを推奨します。 |
| 24ウェルプレート | コーニング | 3524 | 24ウェルプレートを使用する場合、機械対応のマイクロプレートを推奨します。 |
| アンホテリシンB、50 mL | コーニング | 30-003-CF | 5倍(原装100倍)に希釈すればPSAは5倍、メディア交換は1倍 |
| エピライフ、50mL | ギブコ | MEP1500CA | S7を加え、プリモシンを考えます |
| IncuCyte S3 | サルトリウス | 4637 | イメージャー(Zoom/SX5対応の代替品) |
| ペニシリン/ストレプトマイシン、100 mL | コーニング | 30-002-Cl | 5倍に薄めてください(100倍のストックで提供されています) |
| プリモシン | インビボジェン | ANT-PM-05 | 500mLの培地につき1mL |
| 補遺 シーズン7 | ギブコ | S0175 | エピライフに追加 |
参考文献
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