方法論記事

陸生両生類の皮膚からの細菌株の単離と同定

DOI：

10.3791/67862

⸱

2025年6月17日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life, Health, and Environmental Sciences (MeSVA), University of L'Aquila

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

これは、ヨーロッパサンショウウオ(Speleomantes genus)の皮膚微生物叢から培養可能な細菌を採取し、単離する方法です。 ここでは、綿棒でサンショウウオの皮膚をサンプリングし、培養可能なアプローチを使用して処理するためのプロトコルを紹介します。無菌培養のサンプリング、単離、および確立について、細菌株の特性評価とともに説明します。

要約

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微生物叢は高等生物の重要な要素であり、皮膚微生物叢は外部因子に対する生物の防御に大きく貢献しています。微生物培養アプローチのために 、Speleomantes (両生類:Plethodontidae)の皮膚微生物群集をサンプリングする標準的な方法はありません。これに対処するために、私たちは個人の皮膚から細菌を分離するための実用的なプロトコルと、サンプルの取り扱いと保存のベストプラクティスを開発しました。手順は簡単で、綿棒はサンプリング時にグリセロールを添加した生理食塩水に保存されます。実験室に移した後、スワブは+4°Cで最大10日間保存でき、微生物群集の完全性を確保できます。この研究は、 Speleomantes属に属する陸生両生類の皮膚微生物叢の調査に関する興味深い洞察を提供します。このアプローチは、絶滅危惧種に対する対策の実施、監視、保全に貢献し、両生類の健康と生態学における微生物叢の機能に関する知識を向上させる可能性があります。このプロトコルは、多くの野生生物保護シナリオにおけるマイクロバイオーム研究にとっても、より広範な意味を持つ可能性があります。

概要

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すべての生物は、その上皮表面、組織、および器官にさまざまな微生物共生生物を保有しています1。皮膚は、宿主とその環境との間の主要なインターフェースであり、多様な微生物の生息地を提供します2。皮膚は脊椎動物の最大の器官であり、機械的、化学的、および微生物の攻撃に対する障壁として機能します3。しかし、このように皮膚が環境条件に広くさらされることで、皮膚は、生物と外部の生物的および非生物的要因との相互作用を媒介する最も重要な生態学的フロンティアとなる可能性が高い4。

両生類の皮膚微生物叢は過去10年間で集中的に研究され、この微生物群集とその宿主との関係は深く探求されてきた5,6,7,8,9,10。皮膚微生物叢の生物多様性は、主に宿主の種類(すなわち、種特異的なコミュニティ)によって決定されるが、さらなる環境要因がより高い種間多様性を促進する可能性がある11。両生類の皮膚微生物叢は、他の動物とは独特の組成を持っています。両生類は皮膚微生物と共生関係にあり、抗菌化合物を生合成したり、新興感染症から宿主を保護したりできることが知られている12。

皮膚からの細菌の分離は、通常、さまざまな手順を完了した後に達成されます。最初のステップには、スワブによる代表的なサンプル収集と外部汚染の回避が含まれます。微生物サンプルは、滅菌生理食塩水または緩衝液に懸濁されます。懸濁液に保護剤(グリセロールなど)を補給すると、実験室での移動中の細菌群集の完全性が向上する可能性があります13,14。ラボに移されたサンプルは、すぐに、または短時間で処理して、微生物群集の完全性を維持することができます。従来の微生物アプローチでは、微生物密度を下げ、ペトリプレート上でのコロニー分離を改善するために、段階希釈によるサンプル処理を行います。次に、サンプルおよび段階希釈液を、寒天培地Luria-Bertani(LBA)15、トリプシン大豆(TSA)16、トリプトン酵母抽出物寒天培地(TYEA)17、18、19、または栄養素(NA)20などの非特異的、非選択的培地に縞模様で貼り付けます。サンプリングおよび処理中の非選択的濃縮は、広範囲の微生物を培養する必要があるため、使用されます。ストリークまたはスプレッドプレート法は、微生物懸濁液を寒天表面21上に均等に分配する。均一な分布により、サンプル中に存在する異なる微生物種が異なるコロニーを形成することができます。20〜37°Cで2〜7日間インキュベートした後、微生物コロニーを数え、形態に基づいて区別します。細菌コロニーの形態学的特性評価は、色素沈着、形態、隆起、マージン、不透明度、および表面に基づいて行われました。最高希釈液で十分に分離されたコロニーは、微生物培養物を精製するために、新鮮な寒天プレートに継代培養されます。コロニーの純度は、細胞の均一性とグラム染色に対する親和性に基づいて保証されます。コロニーの純度を確認するために、いくつかの生化学的または分子的試験も実施することができる22。単離された菌株の純粋培養物は、4°Cの寒天スラントで短期間使用するために保存することも、凍結保護剤(例えば、グリセロールと中程度の比率が20:80または50:50)で-80°Cで長期保存することもできる23。

このプロトコルでは、表面環境と地下環境の両方で生活できる厳密に陸生の両生類である Speleomantes 洞窟サンショウウオの皮膚微生物叢から細菌を分離するためのベストプラクティスアプローチを報告します24。文献に普遍的に適用されるプロトコルがないことを考慮して、この研究は、これらの陸生両生類からの皮膚微生物叢サンプルをサンプリングおよび保存するためのベストプラクティスを開発することを目的としていました。このプロトコルをテストするために、イタリアの洞窟サンショウウオ(Speleomantes italicus)をモデルとして使用し、アブルッツォ州(イタリア)にある洞窟集団から12人をサンプリングしました。個体を手で採取し、背側、腹側、脇腹を繰り返し(少なくとも5回)拭きました。使用済みの綿棒を滅菌蒸留水に浸しました。次に、スワブをグリセロール補給の有無にかかわらず生理的0.9%生理食塩水に浸しました。ラボに移すと、サンプルの保存は、制御されていない室温、4°C、-20°Cの10日間など、さまざまな条件下でテストされました。培養可能な微生物群集を、ジェネリック培地と半選択培地(LBA、TSYEA、TSA、NA)で培養ベースの方法を使用して比較しました。

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プロトコル

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このプロトコールは、細菌株を分離するための微生物学的培養可能なアプローチのための Speleomantes 皮膚サンプルの入手と取り扱いに関するベストプラクティスを示しています。次の手順で役立つ材料は、 材料の表にリストされています。このプロトコルは、イタリア環境省の承認を得て、DPR 357/97の第11条の動物飼育ガイドライン(2024年4月22日のPNM 74554)に準拠しています。

1. 培地の準備

  1. 粉末成分の量を計算して計量します(LBA、TSYEA、TSA、NA、またはその他のメディアに使用される粉末の量については、製造元の指示を参照してください)。
  2. 製造元の指示に従って、材料を蒸留水に溶かします。培地と購入した製品によっては、沸騰ステップが必要になる場合があります。
  3. 材料が完全に溶解し、pHを制御したら、培地を最終容量にします。値が予想よりも高いか低い場合は、製造元の指示で提案されている解決策を使用して調整してください。HCl溶液とNaOH溶液は、それぞれpHの低下と上昇によく使用されます。
  4. 寒天(2%w / v)を加え、95°Cまで加熱し、約1分間沸騰させて寒天を溶解してからオートクレーブします。
  5. 製造元の指示に従って、オートクレーブで培地を滅菌します。一般的なオートクレーブプロセスには、121〜134°Cで15〜30分間の処理が含まれます。
  6. オートクレーブ後、寒天培地を約45〜50°Cに冷却し、事前に滅菌した層流フードの下の滅菌シャーレに注ぎます
  7. 固化後、培地の種類と調製日に従ってプレートにラベルを付けます。

2.サンプル収集

  1. サンショウウオ(Speleomantes属)の皮膚を滅菌蒸留水ですすいで、一時的な微生物群集を取り除きます。
  2. 試験管内の滅菌綿先綿棒を使用して、両生類から皮膚綿棒を収集します。綿棒を皮膚表面にそっとこすりつけて、個人を傷つけずに微生物サンプルを収集します。
    1. 滅菌蒸留水に浸した綿棒を全身の両側(四肢全体を含む)に5回(前後5回のストローク)通過させて、個体をサンプリングします。
      注:添加物の補給は、個人に害を及ぼす可能性があるため、お勧めしません。
    2. グリセロール(20%)を補給した生理食塩水(0.9%NaCl)を含むチューブに綿棒を入れます。
  3. サンプルを溶液と混合し、チューブを絞ってスワブをチューブ壁に向かって押し込み、スワブを時計回りに10回、反時計回りに10回回転させます。
  4. 混合後、チューブ内の綿棒を閉じ、微生物分析までサンプルを4°Cに維持しながら、微生物サンプルを実験室に移します。
    注:すべてのステップは、汚染やオペレーターの生物学的および化学的汚染物質への曝露を避けるために、各個人の新しい滅菌材料と手袋を使用して実行されます。

3.接種とインキュベーション

  1. 処理する前に、微生物学的サンプルを完全に混合します。
  2. 皮膚サンプルの段階希釈液を生理食塩水(0.9%NaCl)で10-1 から10-6の範囲で調製します。
  3. 調製した寒天プレートに100 μLの現状残しサンプルと段階希釈液を接種します。滅菌L字型のループを使用して、寒天培地の表面にサンプルを縞模様にし、過度な圧力をかけずに均等に分散させて、寒天の損傷を防ぎます。
  4. 接種したプレートをインキュベーター内で20〜25°Cで3〜5日間反転させます。この温度範囲は、両生類の皮膚に生息する多くの環境中温性および向精神性細菌の増殖に有利です。
    注:すべてのステップは、以前に滅菌された層流フードの下で滅菌材料を使用して実行されます。各実験ユニットに対して5つの独立した反復が準備されます。開始密度は不明で予測できないため、広範囲の希釈を含めることが常に役立ちます。

4. 菌株の精製と同定

  1. インキュベーション後のさらなる分析のために、異なる形態を持つ細菌コロニーを選択します。
    1. まず、汚染や重なりを避けるために、十分に隔離されたコロニーを選択し、コロニーが合流する可能性のある混雑したエリアを避けます。さらに、外観(色、サイズ、形状、エッジ、表面、テクスチャなど)が異なるコロニーを選択して、潜在的に異なる種や菌株のサンプリングを確保します。
      注:このステップは、皮膚微生物叢のさまざまな培養可能な細菌株を選択するために重要です。
  2. 選択したコロニーのサブカルチャー。
    1. 元の寒天プレートの十分に分離されたコロニーを、接種ループを使用して新鮮な寒天プレートに無菌的に移します。コロニーを縞模様にして隔離し、適切にインキュベートします。
    2. 新鮮な寒天プレートでこの手順を数回繰り返して、分離されたコロニーが類似して見えるまで、各細菌分離物から純粋な培養物を取得します。選択培地と汎用培地を用いて継代培養を繰り返す。
      注:無菌処理、目視および顕微鏡検査、および分子同定を組み合わせることで、汚染のないひずみが保証されます。
  3. 顕微鏡観察(5倍から100倍の目的)、グラム染色親和性(コロニーの固定、着色、観察)、および生化学的試験(カタラーゼ、オキシダーゼ、ウレアーゼ、糖発酵試験など)により、微生物培養物の純度を確認してください21,25。
    注:純粋な培養物は、均一なコロニー形態、一貫した顕微鏡特性、および生化学的形質を示す必要があります。
  4. 分子同定を行います。
    1. 精製した細菌コロニーからDNAを抽出し、16S rRNA遺伝子シーケンシングを実施して細菌種を同定します。細菌のユニバーサルプライマーを使用して16S rRNA遺伝子のPCR増幅を行い、その後、GenBank26などのデータベースでシーケンシングと既知の配列との比較を行います。
  5. バイオバンク培養の確立
    1. 無菌性(または純粋)培養物を非選択的培地に接種し、汚染物質の増殖がないことを確認することにより、無菌性をテストします。中期および長期使用のために無菌培養物を保管してください。
      注:標準的な方法には、選択的培地および室温保存の寒天斜面にコロニーをストリーキングすること、選択的培地とグリセロールの混合物(20:80または50:50)で調製したストック溶液に培養物を懸濁すること、またはブロス培養凍結乾燥(凍結乾燥)および-80°Cで凍結することが含まれます。

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結果

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実験アプローチのワークフローを 図 1 に示します。

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図1:両生類の皮膚サンプルのサンプリング、取り扱い、および処理のワークフロー。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

このプロトコルの最初の重要なステップは、動物倫理に従って滅菌手袋と綿棒を使用して両生類からサンプルを収集することです。この手順は、慎重に実行する必要...

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ディスカッション

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私たちは、両生類の皮膚微生物叢から培養可能な細菌群集を取得するためのベストプラクティスプロトコルを開発し、 これをSpeleomantes italicusで実証しました。上記のアプリケーションで実証されているように、両生類の皮膚からの微生物の分離を成功させるためには、いくつかの手順を踏む必要があります。穏やかな綿棒技術と滅菌材料を使用した収集は、十分な微生物材料を収集し、汚染を避けるために非常に重要です。グリセロールを添加した生理食塩水で綿棒を覆った状態で4°Cで輸送および保存することは、さらなる分析まで微生物の生存率を維持するために不可欠です。接種およびインキュベーションは、寒天プレート33上の微生物種を単離するために適切な希釈およびストリーキング方法を必要とする重要なプロセスである。20-25°Cのインキュベーション温度は、両生類の皮膚に生息する微生物の成長を促進し、異なる種間の競争を減らすために不可欠です。コロニーの選択と精製も重要なステップです。継代培養は、菌株の細菌株の純度を...

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開示事項

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著者は何も開示していません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは、Sub-BioMon - Developing and testing approaches to monitor sub-terranean biodiversity in karstプロジェクトの文脈で、プロジェクト「Progetti di Ateneo per la Ricerca di base 2024 UNIVAQ: Ecotoxicology of the endangered European cave salamanders」および「Analisi delle divergenze inter- e intraspecifiche del microbiota dei pletodontidi europei - FFORIC24.35」におけるラクイラ大学からの財政支援に感謝します。2022–2023 BiodivMon合同公募、および国家復興・強靭化計画(NRRP)、ミッション4、コンポーネント2、投資1.1、入札公募第1409号、2022年9月14日にイタリア大学研究省(MUR)、欧州連合の資金提供を受けて-次世代EU-プロジェクトコード:P2022CYF9L、プロジェクトタイトル:通性洞窟種は、地下環境への金属汚染物質のドライバーですか?(金属洞窟) - カップE53D23015380001。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Lauria-Bertani寒天Merk MilliporeL3027
トリプシン大豆寒天Merk Millipore22091
トリプトン大豆酵母エキス AgarMerk Millipore17221
栄養寒天Merk Millipore70148
グリセロール溶液Merk Millipore49781

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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