私たちは、輸血医学および免疫学における赤血球同種抗体の臨床的関連性をより正確に予測するためにマクロファージを使用する既存の単球単層アッセイ(MMA)の機能強化と更新された方法を開発しました。このアッセイは、単球マクロファージアッセイ(M-MA)と呼ばれています。
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この記事について
サマリー
要約
骨髄の単球に由来するマクロファージは、死んだ細胞、破片、腫瘍細胞、および外来病原体の除去に大きな役割を果たす大きな自然免疫細胞です。単球とマクロファージの食作用能力は、あまり理解されていない概念です。ここでは、確立された単球単層アッセイ(MMA)の修正および更新バージョンを使用して、単球とマクロファージ、特にM1 / M2マクロファージのさまざまなオプソニン化赤血球に対する食作用の違いを調べることを目指しています。末梢血単核細胞(PBMC)は、ドナーのバフィーコートから単離されました。精製された単球を用いて、 in vitro 培養と分極により炎症性M1マクロファージと抗炎症性M2マクロファージを作製しました。M1/M2細胞を採取し、MMA様アッセイ(M-MAと呼ぶ)で使用することで、さまざまな赤血球抗体の臨床的に重要な食作用を解読しました。食作用指数(PI)>5は、単球の使用により臨床的に有意な食作用と見なされました。.食作用指数(PI)>12は、M1/M2マクロファージの使用により臨床的に有意な食作用と見なされました。M2マクロファージは、単球やM1と比較して、オプソニン化された赤血球をファゴサイト化する能力が高いことを示しています。同じ弱い抗体(抗S)は、M2マクロファージ(PI=43)のみで有意な食作用をもたらし、M1(PI=2)または単球(PI=0)では有意な食作用をもたらし、これはさまざまな抗体を用いて繰り返し実証されました。単球の代わりにM2マクロファージを使用すると、これらの細胞はより食作用性が高いため、より正確な結果が得られる可能性があり、アッセイへの臨床的関連性がさらに高まります。臨床的意義が知られている抗体を用いた単球マクロファージアッセイ(M-MA)の検証など、赤血球に対するさまざまな抗体を用いたさらなる研究により、M-MAが臨床的に重要な赤血球同種抗体および輸血反応の予測に役立つことが示される可能性がある。この方法は、輸血医学と免疫学の分野を進歩させます。
概要
輸血医療の現場では、輸血反応の予測が依然として大きな課題となっています。過去40年間にわたり、TongとBranchによって開拓された単球単層アッセイ(MMA)1,2は、輸血患者1の溶血の臨床転帰を予測するための貴重なin vitro細胞アッセイとして機能してきました。実際、このアッセイは、臨床的に重要な赤血球(RBC)抗体と重要でない赤血球(RBC)抗体を区別するのに役立ちました2。このアッセイでは、従来から単球が標準的な白血球を使用してきましたが、私たちの研究は、単球由来のマクロファージを代替として使用することの潜在的な利点を探ることを目的としています。これらの細胞は、赤血球同種抗体の臨床的関連性を評価するアッセイの能力を高める可能性があります。
歴史的なMMAでは、有害な輸血反応中の赤血球のクリアランスと破壊に関与する免疫細胞であるマクロファージの前駆体である単球が、RBCおよび抗体1,2,3,4,5,6,7とともに
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プロトコル
この研究は、人間を対象とする倫理的研究を実施するための機関ガイドラインに準拠して行われました。倫理承認は、カナダ血液サービス研究倫理委員会 (REB) から付与され、承認 CBSREB#2023.008 されました。このプロトコルのすべてのステップは、無菌条件下でバイオセーフティキャビネット内で実施されます。
1. PBMCの分離
- ACDチューブでドナーから全ヒトの血液を採取します。血液を室温(18°C〜22°C)で最大36時間保存します。
- 全血ACDチューブを50 mL遠心分離チューブ(ACDチューブ2本につき50 mLチューブ1本)に移します。RPMI-1640 完全培地を室温で最終容量 35 mL まで加えます。
- 15 mLの室温密度グラジエント培地を新しい50 mLチューブに加えます。希釈した全血を密度勾配培地の上に慎重に重ね、界面での混合を最小限に抑えて血液を最適に分離します。
- ブレーキをオフにして、層状混合物を700 x g で30分間遠心分離します。密度勾配遠心分離では、混合物を上から下に、血漿、バフィーコート(PBMCを含む)、密度勾配材料、顆粒球、および赤血球に分離します。
- 最上層(プラズマ)の大部分を吸引して廃棄します。トランスファーピペットを使....
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結果
図1の結果は文献と一致しており、マクロファージのM0状態からその後のM1/M2状態への分極が成功したことを示しています。M1およびM2マクロファージを8日間培養し(成長因子を添加して6日間、分極を2日間)、抗Dまたは抗kオプソニン化赤血球を試験しました(図2)。M2マクロファージは、抗D(コントロール)または抗kのいずれかによってオプソニン化されたRBCを持つM1と比較して、高い食作用指数を示します。この結果は、M-MAを使用して実施された他の予備試験と一致しています(表1を参照)。M2マクロファージは、強力なRBC抗体を用いても、M1マクロファージや単球と比較して食作用が強いです(図2B)。 表1は、臨床的に重要であると考えられる特異性を持つ4つの異なるRBC同種抗体の予備的な結果を示しています。抗原陽性赤血球をオプソニン化するために使用され、MMAの単球に.......
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ディスカッション
このメソッドを確実に成功させるためには、1)M1/M2分極の成功、2)マクロファージ層の生成とRhD+制御、3)食作用指数の定量化という重要なステップを踏む必要があります。私たちの方法では、細胞培養には単離された単球を使用することが定められていますが、PBMCを使用することもできますが、精製された単球を使用することをお勧めします。PBMCには様々な種類の細胞が含まれており、これらの細胞は複数の異なるサイトカインや媒介因子を分泌していることが知られています。これは、M1/M2マクロファージの分化または分極に影響を与える可能性があります。したがって、精製された単球を使用すると、より良い結果が得られます。 また、STEMCELL単球単離キットを使用すると、単球の約10%が元のPBMCの量から得られることを覚えておくことが重要です。50 x 106 PBMCsが、約5 x106 単球を得るためのPBMCの最小開始数であることが観察されています。付着した単球でフラスコを洗うときは、細胞が剥がれないように、渦巻き状にやさしく洗ってください.......
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開示事項
著者は何も開示していません。
謝辞
この研究は、オンタリオ州トロントのカナダ血液サービスイノベーションセンターによって支援され、資金提供されています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1X PBS、pH 7.4、Ca2+/Mg2+ | Wisent Bioproductsなし | 311-425-CL4 | 度または室温で保管 |
| AccutaseTM | STEMCELL Technologies | 7920 | 細胞剥離液 |
| ACK溶解バッファー | STEMCELL Technologies | 07850、07800 | 4度で保存 |
| 反ヒトグロブリン | NOVACLONE、Immunocor. | N/A | NOVACLONE ANTI-IGG for IAT試験 |
| 抗Rh(D)(WinRho.SDF CDN) | Saol Therapeutics | 1003092 | Rh免疫グロビンの任意の商用供給源で十分です |
| セルスクレーパー | UofT Medstore | 83.395 | セル剥離 |
| セルストレーナー 70uM ナイロン | ファルコン | 352350 | 細胞フィルター |
| チャンバースライドヌンク。Lab-TekTM II カバー付 RSスライドガラス 滅菌済み | サーモフィッシャーサイエンティフィック | MMA用の154534チャンバースライド | |
| カバースリップ | VWR | 48393-081 | 24 x 50 mm |
| Cytiva Ficoll Paque Plus、密度1.077 g / L | Thermo Fisher Scientific | 17-1440-03 | 全血からのPBMCSの分離;密度勾配培地 |
| Elvanol Mounting Medium | N/A | N/A | Dulbecco'Ca2+/Mg2+、15%(w/v)ポリビニル樹脂、30%(v/v)グリセリンを含まないPBS(D-PBS)。 |
| 新鮮な全血(ACDチューブ)またはバフィーコート | カナダの血液サービス | 36時間室温で休むことができます | |
| ヒト組換えGM-CSF | 幹細胞技術 | 78015.1 | M1マクロファージの分極のためのサイトカイン |
| 組換えIFN-γ | STEMCELL Technologies | 78020 | M1マクロファージの分極サイトカイン |
| 組換えIL-4 | STEMCELL Technologies | 78045.1 | M2マクロファージの分極のためのサイトカイン |
| 組換えM-CSF | 幹細胞技術 | 78057.1 | M2マクロファージの分極用サイトカイン |
| ID-CellStab | Bio-Rad | 005650 05740 | RBC細胞の保存/安定化溶液 |
| アイソレーション・ミディアム | N/A | N/A | PBS Ca2+ and Mg2+ free + FBS 2% + 1mM EDTA |
| Lipopolysaaracide (LPS) | Sigma Aldrich | L3024-5MG | M1マクロファージの分極用サイトカイン |
| メタノール (100%) | N/A | N/A | スライドの固定 |
| 単球単離キット STEM-cells EasySep CD16枯渇なしのヒト単球濃縮キット | STEMCELL Technologies | 19058 | PBMCからの単球の単離 |
| Poly-D-ysine | UofTメドストア | P6407 | セル接着液 |
| Rh(D)陽性R2R2 RBCs | Canadian Blood Services | N / A | また、商業的に利用可能な |
| RPMI-1640 | Wisent Bioproducts | 350-000-CL | に10%熱不活化FBS、1 mM GlutaMAXサプリメント、1 mM HEPES、および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加。4度で保管してください。 |
| トリパンブルーソリューション | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15250061 | セルカウンティングソリューション |
参考文献
- Tong, T. N., Branch, D. R. Use of a monocyte monolayer assay to evaluate Fcγ receptor-mediated phagocytosis. J Vis Exp. (119), e55039(2017).
- Tong, T. N., Cen, S., Branch, D. R. The monocyte monolayer assay: Past, present and future. Transfus Med Rev. 33 (1), ....
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