マルチカラーフローサイトメトリーによる血小板サブポピュレーションの解析

サマリー

血小板のマルチカラーフローサイトメトリーは、休止血小板、凝集血小板、凝固促進血小板、アポトーシス血小板など、古典的な血小板亜集団内の新しい血小板サブタイプを同定できます。これにより、さまざまな血小板アゴニストによって誘導されるさまざまな亜集団パターンを比較できます。ここでは、マルチカラーフローサイトメトリーパネルを確立するための手順について詳しく説明します。

要約

血小板(血小板)は、止血や血栓症に重要な役割を果たす小さな無核血球です。血小板機能の欠陥は、心血管疾患の患者に出血や血栓性イベントを引き起こす可能性があります。したがって、血小板の亜集団を血小板機能に割り当てることができるように、血小板の表現型を特徴付けることが重要です。血小板アゴニストおよび活性化剤によるヒト血小板の刺激は、表面受容体集団の変化を伴って、血小板の形態学的および生理学的変化を誘発する。これにより、機能的に多様な血小板亜集団が生まれます。古典的に定義された血小板亜集団は、休止血小板、凝集血小板、凝固促進血小板、およびアポトーシス血小板です。血小板サブタイプに対するアゴニストの効果を特徴付けるために、10種類の抗体と色素(抗CD62P、抗CD63、抗CD61、抗CD41、抗CD42b、抗インテグリン_αIIbβ3 (クローン:PAC-1)、抗CXCR4、抗ACKR3、アネキシンV、ゾンビNIR)からなるマルチカラーフローサイトメトリーを用いたアッセイを確立しました。単離されたヒト血小板を血小板アゴニストとインキュベートし、特異的な蛍光色素標識抗体および色素で染色しました。その後、フローサイトメトリーにより測定しました。これにより、古典的な4つの亜集団内でアゴニスト特異的なサブタイプを定義することができます。結論として、本稿で紹介した10色フローサイトメトリーパネルを構成する活性化マーカー(抗CD62P、抗CD63、抗インテグリン_αIIbβ3 (クローン:PAC-1))、炎症マーカー(抗CXCR4、抗ACKR3)、アポトーシスマーカー(アネキシンV、ゾンビNIR)の組み合わせは、特定の血小板機能に関連する可能性のあるさらなる血小板サブタイプを定義する可能性を開く。この方法は、血小板の機能や生理学に関する基礎研究だけでなく、疾患モデルや患者研究における新しい血小板サブタイプの定義にも応用できます。

概要

血小板とも呼ばれる血小板は、止血や血栓症の発症に不可欠な、小さくて核のない血液細胞です^1,2。それらは、さまざまな血小板アゴニストによって活性化できます。従来の生理学的血小板アゴニストは、P2Y12およびP2Y1受容体に結合するアデノシン二リン酸(ADP)、PAR1およびPAR4受容体を介して血小板を活性化するトロンビン、および糖タンパク質VIと相互作用するコラーゲンです。コラーゲンは、in vitro実験でコラーゲン関連ペプチド(CRP-XL)^3,4によって置換できます。近年、ヘミンはC型レクチン様受容体(CLEC-2)と糖タンパク質VI(GPVI)の相互作用により血小板活性化を誘導することが示され、ヘミンは新たな内因性血小板活性化因子/アゴニストとしての地位を確立した^5,6。いくつかの病理学的状況が溶血を引き起こし、遊離鉄鉄含有ヘミンの遊離をもたらす可能性があります。これらすべての血小板アゴニストは、血小板の表面受容体発現を変化させます。表面受容体および原形質膜の変化は、血小板アゴニスト^7,8,9の強度および濃度に依存する。したがって、血小板の亜集団を血小板機能に割り当てることができるように、血小板を表現型的に特徴付けることが重要です。

フローサイトメトリーなどの高次元的な方法により、血小板は異なる機能を持つ亜集団を形成することが明らかになりました。部分母集団は、異なるサーフェスマーカーで分類できます。文献では、ホスファチジルセリンの外部化を特徴とするプロコアギュラントと、インテグリンα_IIIbを活性化する凝集表現型という2つの異なる血小板亜集団が存在することがよく知られています_{β 3。} 古典的な活性化マーカーに加えて、ミトコンドリア機能および酸化ストレスを検出するグルタチオン-S-アリールオキシド(GSAO)のような蛍光色素は、例えば、それらの代謝状態による凝固促進血小板などのさらなる分類に使用することができる¹⁰。これにより、バルーニングとミトコンドリア透過性遷移細孔形成(MPTP)の凝固促進剤血小板表現型¹¹を区別することができます。

Heemskerkらは、ホスファチジルセリン(PS)曝露とインテグリンα_IIbβ₃活性を分析することにより、異なる血小板集団が明確な凝固ステップを制御できること、およびホスファチジルセリン曝露にはトロンビンやコラーゲンなどの強力な活性化因子が必要であることを示しました¹²。さらに、コラーゲンまたは特定のGPVIアゴニストであるコンブルキシンを用いてGPVIによる血小板の活性化は、主に付着性凝固促進血小板の形成に関与しています。同様に、シクロオキシゲナーゼによってトロンボキサンA2を産生することにより血小板の活性化をもたらすアラキドン酸は、PS曝露を誘導する¹³。しかし、アラキドン酸は、トロンビンやコラーゲンに比べて、血小板活性化剤として弱い¹⁴。Van Velzenらはまた、血小板表面抗原(CD42a/b、CD36、CD41、CD61)および活性化マーカー(PAC-1、CD63、CD62P)を2つの別々の測定で評価した¹⁵。さらに、van Velzenらは血栓塞栓症患者の血液を分析し、健康な患者と病気の患者の亜集団を比較することができました。Hindleらは、トロンビンおよびCRP-XL治療後の血小板亜集団に対するプロスタサイクリンの影響を、それぞれ4つのマーカー(PAC-1、Annexin V、CD62P、CD42b、またはCDCD154、CD62P、CD63、CD42b)からなる2つの個別のパネルで測定した¹⁶。最近、マルチカラーフローサイトメトリーは、安静時(CD42b⁺、PAC1^-、CD62P^-、アネキシンV^-)、凝集性(CD42b⁺、PAC1⁺、CD62P⁺、アネキシンV^-)、凝固促進剤(CD42b⁺、PAC1^-、CD62P⁺、アネキシンV⁺)およびアポトーシス(Cd42b^-、PAC1^-、CD62P^-、アネキシンV⁺)血小板亜集団を定義するために使用されています^7,17.Laspaらは、ケモカイン受容体CXCR4およびACKR3に対する抗体を添加することにより、マルチカラーフローサイトメトリーアプローチを拡張/改良しました¹⁸。入手可能な文献に基づくと、これは単離されたヒト血小板用の最初の10色フローサイトメーターパネルであり、1つのチューブ内の単離されたヒト血小板の集団内の個々の血小板(単一細胞レベル)上の10の異なる抗原を検出できます。したがって、単一細胞の活性化、接着、凝集電位、ケモカイン受容体、およびアポトーシス電位を同時に測定して、既存の亜集団をさらに区別することが可能です。したがって、それは、4つの主要な亜集団を4つのマーカー(休静、凝固促進、凝集、アポトーシス)で定義したJohnsonらを補完するものである¹⁷。したがって、マルチカラーフローサイトメトリーアッセイを確立することで、さまざまな血小板アゴニストの活性化パターンと古典的な血小板亜集団内の血小板サブタイプの形成に関して比較することができます。

この方法は、血小板の機能や生理機能に関する基礎研究に使用することができます。さらに、確立されたヒト血小板のマルチカラーフローサイトメトリーアッセイは、心血管疾患や血栓性イベントの研究など、患者研究で得られた血小板を使用して実施し、これらの疾患によって誘発される血小板亜集団と、これらの誘発された表現型に対する治療の影響を解読することができます。例えば、Muellerらは、血小板亜集団が大動脈弁狭窄症患者で異なる可能性があることを示しました¹⁹。得られた知識は、医薬品介入の新たな機会を提供する可能性があります。

プロトコル

研究目的での採血と取り扱いは、エバーハルト・カール大学医学部とテュービンゲン大学病院の倫理委員会によって承認され(倫理投票238/2018B02)、研究方法論はヘルシンキ宣言によって設定された基準に準拠していました。健康なドナーは、採血について書面によるインフォームドコンセントを与えました。健康なドナーのベースライン特性を 表1に示します。 図1 は、フローサイトメトリーのプロトコルの概要を示しています。

1.全血からのヒト血小板の単離

注:ISTHガイドラインは、血小板²⁰を分離するための標準化された方法を確保するために、サンプル収集、止血帯、および抗凝固剤の選択に関して従われました。

1. バッファー調製
   1. 酸-クエン酸-デキストロース(ACD)抗凝固緩衝液:12.50 g Na₃-シトラート(85 mM C₆H₅Na₃O₇ x 2 H₂O)、6.82 gクエン酸(71 mM)および10.00 gグルコース(111 mM)を475 mLのアクアデスチラータに溶解します。1 M NaOHでpHを4.69に調整します。アクアデスチラータを最大500mL充填します。その後、バッファーをフィルター滅菌し、使用するまで4°Cで保存します。
      注:すべての溶液は、0.22μmの孔径の高速フローポリエーテルスルホン膜を使用する真空駆動フィルターシステムでフィルター滅菌されています。
   2. Tyrode's buffer (10x): NaCl 80.00 g、NaHCO 3 10.15 g_、 KCl 1.95 g を秤量し、1 Lにaqua destillataを加えます。
   3. Tyrode's-HEPESバッファー(1x;137 mM NaCl、2.8 mM KCl、12 mM NaHCO₃、5 mMグルコース、10 mM HEPES):10 mLの10 mLのTyrode'sバッファーと90 mLのアクアデスチラータを混合します。0.1gのグルコースと0.1gのウシ血清アルブミン(BSA)を溶解します。4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)でpHを7.4に調整します。10 mLのTyrode'sバッファーをpH 7.4にセットし、残留90 mLのTyrode'sのpHを7.4に調整し、1 N HClをpH 6.5に調整します。
      注:BSAは、ヘミンなどの一部の化学物質を清掃する可能性があります。この場合、BSAを含まない1x Tyrodeのバッファーを調製することが重要です。すべてのバッファーは、使用前に室温または37°Cまで温める必要があります。
2. 血液サンプル採取
   1. すべてのドナーに 10 mL シリンジ 1 本と 2 mL の ACD 抗凝固剤を準備し、インキュベーターを使用して室温または 37 °C に調整します。希釈係数は1:5(ACD:血液)に保ちます。
      注:小さいまたは大きい注射器を使用して血液サンプルを採取します。冷たいACDバッファーは、血小板を事前に活性化し、結果を損なう可能性があります。
   2. バタフライニードル(21G)を使用して、事前に温めたACDシリンジにドナーの血液をゆっくりと収集します。シリンジに充填する前に止血帯ホースを開けて、事前の活性化を避けてください。
      注:より大きなゲージ針を備えたシリンジは、血小板のせん断誘発活性化を最小限に抑えることができます。
   3. ACD血液をゆっくりと15mLの反応チューブに移します。血小板の事前活性化を避けるために、すぐに血液を使用してください。.
3. 血小板単離
   1. ACD血液を209 x g (室温、RT)でブレーキなしで20分間遠心分離します。50 mLの反応チューブに25 mLのTyrode's-HEPES緩衝液(pH 6.5)を調製します。
   2. 得られた多血小板血漿(PRP、上層)を、pH 6.5のTyrode's-HEPES緩衝液を含む50 mLの反応チューブに穏やかに移します。
   3. 他の血球との汚染を避けるために、バフィーコートと赤血球の上に約1mLのPRPを残します。.
   4. 懸濁液を430 x g で室温で10分間遠心分離し、血小板をペレット化します。得られたペレットを200-300 μLのTyrode's buffer(pH 7.4)に慎重に再懸濁します。
   5. セルカウンターを使用して、血小板数を決定します。Tyrode's-HEPES-buffer pH 7.4 to 200 x 10³ platelets/μLで血小板数を調整します。血小板染色のさらなる処理については、ステップ3を参照してください。

2. フローサイトメトリー用抗体の選抜と滴定

1. 抗体と色素の選択
   1. フローサイト^{メーター21}に適した蛍光色素を含む抗体および色素を選択します。フローサイトメーターのメーカーが推奨するフィルター構成に注意してください。血小板マーカーと蛍光色素分子の構成の例を 表2 および 図2 に示します:レーザー構成のBD LSR Fortessa:紫(402 nm)、青(488 nm)、黄/緑(561 nm)、赤(640 nm)。
      注:低発現抗原には、より明るい蛍光色素を使用してください。例えば、発現が弱いケモカイン受容体(ACKR3およびCXCR4)には、明るい蛍光色素BV412およびBV650が使用された22,23,24。
2. 抗体および色素の滴定
   1. 抗体を滴定して、適切な使用濃度を見つけます。滴定には、ステップ1で単離したヒト血小板と抗体の濃度系列を使用します。
      注:メーカーによって与えられた使用濃度は、一般的に濃度シリーズの適切な開始点です。
      1. 治療中にのみ発現する抗原を扱う場合は、染色前に血小板を活性化して、陰性細胞と陽性細胞も検出できることを確認してください。例えば、PAC-1は活性化インテグリンα_IIbβ₃にのみ結合します。したがって、血小板を強く活性化して、例えば10 μg/mLのコラーゲン関連ペプチド(CRP; 図3参照)を使用して、明るく正のシグナルを得ます。
3. サンプルの滴定
   1. ステップ1と同様にヒト血小板を単離し、血小板数をサンプルあたり1 x 10⁶ 血小板に調整します。
      1. 染色前に活性化する必要がない受容体の場合:CD61、CD42b、CD41、CXCR7、CXCR4は、抗体ごとに1つの未染色サンプルと1つの染色済みサンプルを使用します。例えば、染色前に10 μg/mLのCRP-XLで活性化する必要がある受容体/マーカーの場合:PAC1、CD63、CD62P、Annexin V、Zombie NIRは、1つの活性化サンプルと1つの非活性化サンプル15,25,26を使用します。
   2. 必要に応じて、血小板(サンプルあたり1 x 10⁶ 血小板)を10 μg/mL CRP-XLで30分間活性化します。次に、単離した血小板(1サンプルあたり1 x 10⁶ 血小板)を異なる濃度の蛍光色素標識抗体または色素と30分間インキュベートし、300 μLの1x Annexin Binding Bufferを添加してサンプルを希釈します(濃度の例を 表3に示します)。
   3. サンプルごとに 10,000 のイベントを測定します。
   4. 補足図1に示すように、すべての抗体の陽性集団と陰性集団の最適な分離を示す染色指数を計算します。
   5. 抗体の各濃度の染色指数をプロットして、最適な濃度を見つけます。

3. フローサイトメトリーのための染色

注:4種類の血小板活性化剤(CRP-XL、ADP、トロンビン、ヘミン)を使用した染色例については、 表4 を参照してください。

1. ヘミンは作りたてのものでなければなりません。粉末を1.4 M NaOHに溶解し、3 M溶液に溶解し、450 rpmで96°Cに5分間加熱します。次に、蒸留したH₂Oで3 mMのストック溶液に希釈します。
2. 血小板数(サンプルあたり:1 x 10⁶ 血小板)を調整した後、 表4に示すように、血小板活性化剤を使用してチューブ内の血小板をRTで30分間活性化します。
3. 43.3 μLの抗体カクテルをサンプルに加え、血小板を暗所の室温で30分間インキュベートします。
4. インキュベーション後、サンプルを300 μLの1x Annexin Binding Buffer(10 mM HEPES/NaOH、pH 7.4、140 mM NaCl、2.5 mM CaCl₂)で希釈し、アネキシンVタンパク質が細胞膜の外側のホスファチジルセリンに結合できるようにします。すぐにサンプルを測定してください。
   注:調製後すぐにサンプルを測定してください。サンプルは固定されていないため、サンプルの調製と測定が遅れると、結果のばらつきが大きくなる可能性があります。固定はアネキシンV結合を損ないます。.

4. コンペンセーション設定と蛍光マイナス1コントロール(FMO)測定

メモ: データを記録する前に、補正設定を実行してください。フローサイトメーターは、コンペンセーション設定を自動的に計算します。特定のコンペンセーション手順については、フローサイトメーターの通常のマニュアルを参照してください。それでも、セルまたはビーズのいずれかで補正コントロールを使用してください。

1. 報酬の設定
   1. ビーズによる補償のためには、1滴のビーズと1 μLの蛍光標識抗体を用いて、各蛍光色素に対して150 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を調製します。
   2. ビーズの種の反応性を監視します。抗マウスIgGκとポリスチレン微粒子のネガティブコントロールを使用してください。アネキシンVを補うために、アネキシンVと同じ蛍光色素を結合する抗体PE/Cy7抗ヒトCD62LでPE/Cy7ビーズを標識します。
   3. アミン反応性色素には、アミン反応性補償ビーズを使用してください。150 μL の PBS に 2 滴のポジティブビーズと 1 滴のネガティブビーズを使用し、1 μL の染料を添加します。アミン反応性補償ビーズが色素と反応し、正のシグナルを示すことを確認します。ネガティブビーズがアミン反応性色素と反応せず、ネガティブなシグナルを示さないことを確認してください。
      注:Zombie NIR APC-Cy7には、ネガティブおよびポジティブアミン反応性ビーズを使用してください。
   4. コンペンセーションサンプルを暗所で室温で30分間インキュベートします。
   5. すべての補償チューブを個別に実行し、FSCおよびSSCに基づいてシングレットビーズポピュレーションにゲートします。ビーズの集団は、1つの小さな集中集団として現れます。この人口の周りにゲートを描きます。
   6. すべてのコンペンセーションチューブのヒストグラムを表示し、異なる抗体と色素の正のピークが重ならないようにコンペンセーション値を調整します。次に、すべての補償チューブを測定し、蛍光色素のスピルオーバーをメーカーのSOPに従って計算します。
   7. 単離されたヒト血小板を用いた実際の染色実験の取得に進みます(ステップ3および 表4を参照)。測定前にSSC/FSC電圧を調整して、血小板集団を見つけます。CD61は血小板上に遍在的に発現しているため、血小板のすべてのサイズを検出できるかどうか、この蛍光閾値で確認してください。
   8. 次に、サンプルごとに 20,000 のイベントを測定します。
2. FMO測定
   1. 表 5 に従って、すべてのマーカーに FMO コントロールを準備します。すべてのマーカーのオーバーラップを判断できるようにするには、刺激されていないサンプルと刺激されたサンプルの両方を準備します。

5. データ分析

1. フローサイトメトリーデータ解析ソフトウェアによる解析(図4)
   1. FSCファイルをソフトウェアにドラッグアンドドロップします。FMO コントロールを使用して、各マーカーの正の母集団を定義します。
      1. FMO を決定するには、ドット プロットの各マーカーに対して各 FMO コントロールをプロットします。これにより、他のチャネルへのスピルが表示されます。蛍光スピルオーバーが最も高い FMO ゲートを、処理した 10 色サンプルの陽性集団への境界として使用します。
2. クラウドベースのフローサイトメトリー解析による解析(図5)
   1. ソフトウェアを開き、新しいデータセットを作成します。フローサイトメーターで取得したFCSファイルをドラッグ&ドロップします。
   2. ワークフローを作成して解析を開始します。補正マトリックスは、生データファイルから自動的に作成されます。
   3. 次の設定でUMAP分析を実行します:近傍:15、最小距離:0.4;コンポーネント:2;メートル法:ユークリッド;学習率:1;エポック:200;埋め込み初期化: スペクトル。すべてのファイルと 10 個のマーカー (フィーチャ) すべてを選択します。
   4. フェノプラフ分析を新しいタスクとして追加し、次の設定で分析を実行します: K 最近傍: 20;距離メトリック:ユークリッド;ルーヴァンラン:1;結果の数: 1.
   5. 生成されたクラスターを示すゲーティング タスクを追加します。解析を実行した後、データを異なるブロットで表示し、エクスポートすることができます。

結果

マルチカラーフローサイトメトリーパネルによって収集された生データの解析には、2つのオプションがあります。1つのオプションは、解析ソフトウェアを使用して手動で解析することです(図3 および 図4)。したがって、生データをソフトウェアウィンドウにドラッグアンドドロップする必要があります。まず、散布図表示モードでSSC/FSCスケールを調整してセルを見つけ、血小板集団を個別の点群として表示する必要があります。次に、各マーカーの陽性細胞は、ディスプレイをヒストグラムモードにして未処理のピケと処理ピケの間の閾値を設定するか、散布図ディスプレイを使用してFMOによって決定されるゲートを定義することにより、未処理サンプルと処理済みサンプルを使用して定義できます。

血小板集団の明確な変化は、ドットプロットで見ることができます(図4A)。ヘミンは、他の活性剤と比較して、FSCが低い血小板をより多く形成します。ADP、トロン...

ディスカッション

マルチカラーフローサイトメトリーは、離散的な機能12,17,18に関連する異なる血小板クラスター/亜集団を定義することを可能にする。亜集団の結果と受容体表面発現の決定的なのは、単離されたヒト血小板の品質です。したがって、提示されたプロトコルの1つの重要なステップは、血小板の調製です。さまざまなアゴニストによるサンプル処理の前に活性化を避けるために、それらを穏やかに分離する必要があります。この方法が異なる疾患を比較するために実施されている場合でも、疾患によって引き起こされず結果に影響を与える血小板の活性化を避けるために、患者からゆっくりと血液を採取することが重要です。

10色フローサイトメトリーパネルを確立する際の最大の課題は、利用可能なフローサイト^{メーター21,27}

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10x 結合バッファー	Invitrogen, 米国カリフォルニア州カールスバッド	88-8103-74	バッファー
アデノシン二リン酸 (ADP)	Probe & go Labordiagnostica GmbH Lemgo、ドイツ	70212	小板作動薬
アネキシン V PE-シアニン7	Invitrogen、 米国カリフォルニア州カールスバッド	88-8103-74	染料
抗 CD41 AF 700	BioLegend、 米国カリフォルニア州サンディエゴ	303728	抗体
抗 CD41 Alexa Fluor 700	BioLegend、 米国カリフォルニア州サンディエゴ	303727	抗体
抗CD42b PerCP /シアニン5.5	BioLegend、 米国カリフォルニア州サンディエゴ	303918	抗体
抗 CD61 BV605	BD Bioscience フランクリン レイクス、ニュージャージー州、米国	744382	抗体
抗 CD62P PE	Beckman Coulter、 Brea、カリフォルニア州、米国	IM1759U	抗体
抗CD63 PE / Cy5	Abcam、 カンブリグデ、英国抗体	234251 抗体
抗CXCR4 BV650	BD Bioscience 米国ニュージャージー州フランクリンレイクス	740599
抗CXCR7 BV421	BD Bioscience 米国ニュージャージー州フランクリン レイクス	566234	抗体
抗 PAC-1 FITC	BD Bioscience 米国ニュージャージー州フランクリン レイクス	340507	抗体
ウシ血清アルブミン (BSA)	Applichem、 ダルムシュタット、ドイツ	A1391	-
クリン酸	Carl Roth、 カールスルーエ、ドイツ	6490.1-CRP-XL
	CambCol Laboratories、 Ely、英国	CRP-XL	血小板アゴニスト
D-(+)-グルコース	シグマ アルドリッチ社、 セントルイス、ミズーリ州、米国	G7528-Dubecco
's リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	Sigma Aldrich Co, 米国ミズーリ州セントルイス	D8537-Hemin
	Sigma Aldrich Co.、 米国ミズーリ州セントルイス	H9039-10G	血小板アゴニスト
HEPES	Carl Roth、 カールスルーエ、ドイツ	9105.3	-
塩化カリウム	Carl Roth、 カールスルーエ、ドイツ	6781.3	-
塩化ナトリウム	Carl Roth、 カールスルーエ、ドイツ	3957.1	-
炭酸水素ナトリウム	Sigma Aldrich Co, 米国ミズーリ州セントルイス
401676-Thrombin	ロシュ	10602400001	小板作動薬
トリ-クエン酸ナトリウム-ジヒドラート	Applichem、 Darmstadt、ドイツ
1416551211-Zombie NIR	BioLegend、 San Diego, CA, USA	423105	アミン反応性色素