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方法論記事

単一マウス胚性幹細胞からの神経管オルガノイド生成のための堅牢かつ再現可能なプロトコル

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DOI:

10.3791/67883

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2025年12月19日

 , 
1Vienna BioCenter, Institute of Molecular Biotechnology of the Austrian Academy of Sciences (IMBA), 2Vienna BioCenter PhD Program, Doctoral School of the University of Vienna and Medical University of Vienna

この記事について

サマリー

マウス胚性幹細胞由来の三次元神経管オルガノイド(NTO)は、初期発生中の中枢神経系を研究するための貴重なツールです。ここでは、NTOをin vitroで培養するための最適化プロトコルの段階的なデモンストレーションを示し、安定した培養条件と信頼性が高く再現性のあるNTO生成のためのトラブルシューティング戦略を提供します。

要約

哺乳類の発達は非常に複雑なプロセスであり、正確なパターン形成と形態形成のためには、濃度と時間に依存する正確なシグナル伝達が求められます。多くの技術的進歩と知識の蓄積にもかかわらず、哺乳類の発達の多くの側面は依然として捉えどころがありません。生物全体を調査すると、個々の経路の影響や外部刺激が周囲の組織や因子の干渉を導くメカニズムを解き明かすのが難しくなります。この複雑さに対処するため、オルガノイドなどの三次元(3D) in vitro モデルが貴重なツールとして登場しています。胚性幹細胞(ESC)や誘導多能性幹細胞(iPSCs)由来のオルガノイドは、発現パターンや機能の面で生 体内 の組織に非常に似た組織的特徴を示します。重要なのは、制御された実験環境内での操作や広範な生物学的研究へのアクセス性があることです。多能性培養に由来するオルガノイド系は、しばしば異質性と大きな変動性を示し、複雑で複雑な生物学的問題の研究においてその有用性を制限しています。したがって、高品質な再現性のあるデータ、使用材料の削減、そして複雑な現象の調査を可能にする手続きの調和を目指す詳細なプロトコルの緊急性が切実に求められています。この文脈で、in vitro で神経管オルガノイド(NTOs)培養するための最適化プロトコルをここで紹介します。安定した培養条件を作り出し、包括的なトラブルシューティング戦略を提供することで、このプロトコルはNTOの信頼性が高く再現可能な生成を可能にし、神経誘導、パターン形成、初期中枢神経系の発達メカニズムなど関連する科学的課題を研究するための適切なモデルとなります。

概要

哺乳類の発生は単一の全能性幹細胞から始まり、パターン形成と形態形成の誘導を伴う複雑な過程です1,2。この発展には、細胞とその環境間の動的な相互作用を管理する厳密に調整された細胞プログラムが必要です。幹細胞は、形態原勾配3、機械的境界4、細胞増殖、環境再構築5を含む全身および局所的な信号を感知、統合、応答する固有の能力を持っています。外部の時空間的手がかりも、最初は均質な組織において多細胞反応を駆動し、複雑な構造の正確な形成を保証します。幹細胞は自己更新能力と分化能力によって区別され、胚の発生と成人組織修復において重要な役割を果たします。主なタイプには胚性幹細胞(ESC)、成人幹細胞(ASC)、誘導多能性幹細胞(iPSCs)があります。

ESCは胚盤胞の内側細胞塊(ICM)から抽出され、通常は給餌細胞や細胞外マトリックス上で特定の培養培地を用いて2次元(2D)環境で培養され、多能性8を維持します。近年、より現実的な細胞培養条件や技術の必要性が急激に高まり、基礎的な生医学プロセスを研究するために三次元(3D)細胞および組織モデルが確立されました。特に発生生物学において、オルガノイドなどのこれらの3Dモデルは、組織の形態形成および生体外器官形成をモデル化するための堅牢な手法を提供します。オルガノイドは、増殖する幹細胞の自己組織化によって形成され、対称性の破れやパターン形成を通じて自然発生的に複雑な3D構造へと発展します。この過程は生体内で観察されるものと似ていますが同一ではなく、主に外部の指導なしに内部の動態や相互作用によって駆動されます。オルガノイドは実際の臓器の構造や機能を非常によく模倣するため、従来の2次元細胞培養と比べて哺乳類の生物学をより正確に表現できます11。さらに、主な利点の一つは倫理的利点であり、オルガノイドは動物モデルの必要性を減らし、動物実験に関する懸念に対処しています12,13。さらに、オルガノイドは高スループットの薬物スクリーニングのプラットフォームを提供し、薬剤の有効性と毒性の予測を向上させます。しかし、オルガノイドの使用にはいくつかの課題も伴います。2D培養よりは現実的ですが、生物体内の臓器全体の複雑さや相互作用を完全に再現することはできません。さらに、同じ種類の細胞から派生してもオルガノイド間で大きなばらつきが観察されることがあり、その結果に一貫性が欠けることがあります。したがって、オルガノイドを堅牢かつ再現性の高い方法で培養することは不可欠であり、高度な技術、専門的な装置、詳細なプロトコルが必要です。

神経系は複雑なネットワークであり、動作を調整し感覚情報を処理し、体全体に信号を送受信することで、動き、感覚、思考、心拍や消化などの自律神経機能など、必要なすべての機能を制御・調整します。脳と脊髄からなる中枢神経系の前駆体は神経管です。神経管初期の発達における神経構造の形成と機能を理解することは、さまざまな神経障害や発達異常の洞察を得るために不可欠です。神経発達障害は、倫理的な懸念から生体内で研究が難しいと言えます。特にヒト被験者から起因する場合です。脳オルガノイド(16,17)のような神経オルガノイドは、人間の脳組織を密接に模倣した多機能でアクセスしやすいモデルを提供することで、神経系の発達と疾患の理解を大きく深めています。これらの三次元構造は多能性幹細胞(PSC)に由来し、脳の発達のさまざまな側面を再現しており、明確な脳領域の形成、細胞多様性、複雑な神経ネットワークなどを挙げています(16,18,19)。研究者が発達段階をリアルタイムで観察し、主要な調節機構を研究できるため、これらのオルガノイドは正常な脳の発達に深い洞察をもたらします。脳オルガノイドはまた、神経発達19および神経変性疾患20(小頭症16,21、ジカウイルス感染22、自閉症スペクトラム障害23など)のモデリングを可能にし、疾患のメカニズムを解明し、潜在的な治療標的を特定することに寄与します。さらに、脳オルガノイドは薬物試験や開発の貴重なプラットフォームとして機能し、人間の脳に似た環境での薬剤の有効性と毒性の評価を促進し、個別化医療のアプローチを加速させます。さらに、遺伝子と環境の相互作用を研究するための管理された環境を提供し、遺伝的要因と環境要因の相互作用から生じる複雑な疾患の理解を深めます。しかし、神経オルガノイドは脳オルガノイドと同様に細胞の集合体から形成されるため、実験結果において顕著な細胞異質性やばらつきを示すことが多く、それが生成されたデータの解釈可能性に影響を与え、研究者にとって大きな課題となっています17。このため、プロトコルの最適化と正確な品質管理基準は、生体内の状態を十分に反映する価値あるデータの減衰に不可欠です。

マインハルトらは、初期の神経管発達を模倣したクローナル神経オルガノイドプロトコルを初めて報告し、単一の胚性幹細胞(ESC)から形成され、オルガノイド間の異質性を大幅に最小限に抑えました。この革新により、研究者は発達過程やメカニズム、さらには神経パターン化を、卓越した解像度で精密かつ定義された環境で研究することが可能になります。これまで、多くの研究室が主にマウスや人間由来の神経オルガノイドを開発しており、神経管の異なる部分やその発達を模倣しています(25参照)。しかし、入手可能な情報に基づくと、Meinhardtらが確立したプロトコルは、NTOが単一の細胞から確実に形成され、自己組織化され、レチノイン酸(RA)の全域的なパルスを経て、ソニックヘッジホッグ作動因子(SAG)などの他の腹側化因子を加えることなく、効率的に背腹面の運命へとパターン化する唯一の方法です26または勾配形成による空間情報を提供するマイクロ流体チャンバーの使用。ここで示されたプロトコルは、Krammerら26に記載されたMeinhardtら24から適応されたものです。このプロトコルでは、単一マウスのESCを細胞培養マトリックスにシードし、定義された神経分化条件にさらします。2日以内にこれらの細胞はクローン的に拡大し上皮化し、単一の腔と基底に層状の細胞を持つ3次元の丸楕円形構造を形成します。2日目には、シグナル伝達分子RAを世界的に18時間照射し、神経分化を促進し、NTOsを中脳から後脳・頸髄の脊髄レベルへ後方化させ、6日目までに単一の機能的なフロアプレートを形成させ、NTOを腹側から背側へとパターン化します。

最適化されたプロトコルにはいくつかの重要な利点があります。この方法により、最初の3日間で強固な上皮化が可能となり、直径約200μmの比較的小さな球状組織を生成し、それぞれに1ルーメンを含みます。オルガノイドは単一細胞からクローン的に生成され、血清を含まない化学的に定義された培養培地で維持されます。6日以内に多能性培養からの徐々の神経分化が達成され、6日目までに前中脳の同一性を示すオルガノイドが現れ、全波RAパルス26後には背側の後脳または頸椎の脊髄様構造が現れます。

再現性とスループットを高めるために、元のプロトコル22,25とは異なるいくつかの側面が適応されています。これには、修正されたESC培養条件、入力細胞数の減少、改良された分化培地、そして0〜2日目にノギン補給を省略した調整分化プロトコル(すでに26日目に使用)が含まれます。さらに、シーディング密度は96ウェルプレートでの使用に最適化されており、高スループット解析が可能です。これらの改良により、NATO形成およびパターリング効率は当初の~40%から80%26へと40%向上しました。

ここでは(図1)、細胞培養マトリックス内でNTOの堅牢かつ再現性のある生成を可能にする最適化プロトコルの詳細な説明が示されています。このプロトコルは、差別アッセイのためのESCの初期シードから、その後のメンテナンス、固定、解析に至るまで、NTOの取り扱いのすべての段階を網羅しています。また、NTO形態の日々の視覚的評価による品質管理のガイドラインや、抗体染色を用いたオルガノイド同一性の重要な特性評価による正しいパターンや神経分化の検証も含まれます。さらに、包括的なトラブルシューティングアプローチも提供されており、プロトコルの各段階で重要な評価が可能となり、実験プロトコルの再現性と信頼性を確保するために必要です。これらの詳細な指示は、潜在的な問題の特定と解決、エラーの最小化、結果の最適化に役立ちます。これは科学実験の整合性を維持し、他の科学者が研究を成功裏に再現し、生成されたデータから包括的な結論を導き出し、分野の発展を促すために極めて重要です。

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図1:プロトコルの概要。 (A) ESCの通過(ステップ1.1参照)。(B) 細胞培養マトリックスを分割し、単一ESCをシードしてNTOへの分化を行う(ステップ1.2参照)。(C) RAとRA治療の分割(ステップ2参照)。(D) RA除去および毎日のミディム補充のルーティン(ステップ3参照)。このフィギュアは BioRender.com で作られました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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プロトコル

注意:今後の処置(培地置換、治療、固定など)前に、細胞とNTOを毎日質の評価のためにチェックしてください。細胞を空気に直接曝露させるすべての手順は、無菌性を確保し培養物の汚染を防ぐためにバイオセーフティキャビネット内で実施しなければなりません。

1. NTO分化のためのマウスESCの維持、継承、シーディング

  1. 通過
    1. 細胞培養皿や6ウェルプレートのウェルに、0.15%ゼラチンをあらかじめコーティングしたものにESCを37°Cで30分間保管します。
    2. 2〜3日ごとに通過ESC(中等交換)を行い、2日目以降は毎日中中交換を行います。
    3. 使用前にすべての試薬(培地、PBS、酵素溶液)を最低21°C、最大37°Cで予温してください。
    4. 位相差顕微鏡で細胞を観察します(代表画像、 図2参照)。コロニーが適切な大きさと適切な形態を持つこと(図2A)を確認し、また皿の底に付着していることも確認してください。
      注意:マウスのESCが10%以上分化された場合(図2B)、解凍したばかりの培養液を準備してください。分化アッセイのためにESCをシードする前に少なくとも2回はパパパスしてください。経験豊富な研究者は、目視評価(Mulasら28参照)や抗体染色 による マーカー発現(例:OCT4、Yingら29参照)によって判断できます。
    5. 培養皿の蓋を開け、少し傾けて慎重に培地を吸引します。細胞はできるだけ短時間インキュベーターに入れないようにしましょう。培養液を乾燥させないように、培地なしで細胞をできるだけ短時間保持してください。
    6. コロニーを500μLの事前に加熱したPBSで洗浄し(6ウェルプレートの1つのウェルに細胞に加え)、すぐに再び吸引します。
      注:このステップは重要です。なぜなら、i) ESC培地(2iLIF)の遷移を分化アッセイ前に避けなければならず(そうでなければNTO形成が妨げられる)、ii) 培養培地中のFBSまたはBSAが解離を止められるからです。これはFBSやBSAを含む別のESC培地で培養されたESCに当てはまります。
    7. 予備加熱酵素溶液500μLを加え、細胞をインキュベーターに戻します。
    8. タイマーを使って37°Cで細胞を3分間培養します。
    9. 培養後、プレートを取り出して位相差顕微鏡で細胞を調べます。
      注:ESCは培養プレートから切り離されているはずです。もしそうでなければ、皿や皿をしっかりと、しかし慎重に叩いてください(図2C)。
    10. 細胞に直接ピペットで1mLのN2B27培地を加えます(表1)。
      注意:培地(N2B27)を調製する際、グルタミンは最大5〜10分間37°Cで、できれば常温で保存します。ESCはプレートから洗い流され、培養皿の中に「空いている」部分を残すべきです。
    11. P1000ピペットを使い、プレートを少し傾けて培養皿に付着しているコロニーをすべて洗い流します。
    12. 細胞の塊を解離するには、プレートを少し傾け、ピペットの先端(P1000)を皿の中央に置き、先端を皿の底に押し当てつつ、わずかに垂直軸から外して細胞を洗い流します。細胞の塊を割るために5回から10回繰り返します。
    13. 位相差顕微鏡(図2D)で細胞が適切に単一細胞に解離されているか確認し、塊が残っている場合は繰り返します。
    14. 完全な解離後、細胞懸濁液を清潔な無菌15 mL円錐形遠心分離機管に移し、細胞を培養した空の井戸を1 mLのN2B27培地で洗浄し、細胞懸濁液を残した同じ円錐形遠心分離機管に移します。
    15. 細胞を453 x g の超遠心分離機で5分間回転させます。
    16. 上清液を慎重に吸引してください。
    17. 細胞を適切な量のN2B27培地(例:1 mL)に再懸浮させ、細胞数をカウントします(NTOへの分化アッセイに推奨される細胞数は 表2 参照)。
  2. ESCから神経管オルガノイド(NTOs)への分化
    1. 細胞培養マトリックスのアリクオート化
      1. 細胞培養マトリックスのボトルは4°Cの氷の上で一晩解凍します(室温や手解凍は絶対にしないでください)。細胞培養マトリックスを4°Cの温度で必要以上に放置しないでください。機能を保つためにできるだけ早くアリコットと凍結をしてください。
      2. バイオセーフティキャビネットでは、1.5〜2mLのマイクロ遠心分離機チューブを氷の上に置き、細胞培養マトリックスのボトルを新鮮な氷の上に置きながら予冷します。
      3. 溶けた細胞培養マトリックスは、気泡ができないように慎重に混ぜてください。気泡はゼリー化後にウェルや皿から剥がれることがあります。
      4. 細胞培養マトリックスを所定の体積(推奨0.5〜1 mL)で分割し、-20°Cで凍結して使用します。アリコット間の先端を交換するのは避けてください。室温の先端は細胞培養マトリックスを固まらせ、大きな損失を引き起こす可能性があります。代わりに、使用前に冷蔵庫で保存してピペット先端を4°Cまで冷やしてください。
    2. 細胞培養マトリックス内の単一細胞のシーディング
      1. 必要な細胞数(100細胞/μL細胞培養マトリックス、 表2参照)を定量化します。
      2. 適切な細胞番号(細胞懸濁液)を清潔な15 mLの円錐形遠心分離機管に移し、さらに1 mLのN2B27を補充します。
      3. 遠心分離機で453 x g の圧力で5分間細胞を回転させます。
      4. 上澄液を吸引し、円錐形遠心分離機チューブを氷の上に置きます。
      5. 細胞ペレットを適切な量の解凍済みおよび液体の培養マトリックスに慎重に再懸浮させ、気泡の発生を防ぎます。
      6. 適切な量の細胞培養マトリックス-細胞懸濁液を薄い層で、画像撮影に最適なガラス底またはプラスチック底皿(表2、図3A-C参照)に塗布し、マルチウェルプレートの壁に触れないようにします。表面張力が高いため、細胞培養マトリックスの滴が以前に触れられた場合、ウェルの中心から壁へ移動し、細胞やNTOの分布が不十分になります。
        注意:マルチウェルプレートを使用する場合、まずP20(96ウェルプレート)またはP200ピペットチップで細胞培養マトリックスの円を描き、その後細胞培養マトリックスと細胞懸濁液を「充填」してください(図3B)。
      7. マルチウェルプレート/皿をインキュベーターに37°Cで置き、細胞培養マトリックスが固化します。少量の場合は1μLあたり1分、40μL以上の場合は最大15分と推定してください。
      8. 培養時間が終わったら、プレートを取り出して適切な量の培地を加えます( 表2参照)。細胞培養マトリックス中のESCは、NTOへの分化アッセイや培地の交換時に乾燥してはなりません。ゼリー化後は、できるだけ早く培地を塗布する必要があります。ゼリー化は通常、1 μL細胞培養マトリックス1 μLあたり37°Cで1分で完了し、薄層として広げた場合は40〜100 μLの細胞培養マトリックスで最大15分で完了します。
        注意:細胞培養マトリックス中のESCを乾燥させないため、マルチチャネルピペットまたは他のマルチウェルプレートの35mmガラス底皿/ウェル1つを最大8ウェルで扱ってください。細胞はできるだけ短時間インキュベーターに入れないようにしましょう。
      9. 位相差顕微鏡(図3C,D)で細胞培養マトリックス内のシーディング密度と細胞分布を確認してください。最適な播種密度が推奨されます(表2および図3)。しかし、初期解析のような特定の用途では、最大10倍の種子密度が有利になることがあります。
        注意:分化アッセイを行う前に、細胞培養マトリックスと細胞懸濁液を慎重に混合し、P300またはP1000ピペットの先端で再懸濁させて分化アッセイを行い、ウェルや皿ごとの細胞数の変動を抑制してください。この工程は、細胞培養マトリックスの損失を防ぐために、すべてのウェルをシードする前に行うことは推奨されません。なぜなら、細胞培養が固まってピペットの先端にくっつく可能性があるからです。

表1:媒質成分(N2B27塩基、2iLIF、N2B27diff)。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表2:各皿あたりの細胞数、細胞培養マトリックスの量、培地の体積、ゼリー化時間に関する情報。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

2. 神経分化を促進し、後方化および腹部化を誘導するためのNTOのRA治療

  1. レチノイン酸(RA)のアリクオート(aliquoting)
    1. オールトランスRAパウダーは室温(-20°Cで保存)に移してください。
    2. 適切なDMSOの量で粉末を再構成し、最終濃度100 mMに到達させます。
    3. 100 mM RAを1.5 mLのスクリュートップバイアルに分けて1回ずつ。
    4. チューブが"満タン"になるまでアルゴンガスを加えます。
      注意:アルゴンガスは酸素より重いため、空気中のRAを覆い、保持するためにチューブの底に沈みます。チューブが満タンになったときに漏れ出すときに手にもその感覚を感じます。
    5. 小瓶をしっかり閉じて。RAは光や空気に非常に敏感です。
    6. アリコートは-80°Cの暗闇で保存し、さらに使用します。または、再構成されたRAは液体N2に1.5 mLのマイクロ遠心分離管で保存することも可能です。
      注意:再構成・希釈されたRAは、ホイルで覆った状態で最大2日間冷蔵保存可能です。
  2. NTOsのRA治療18時間(図4A)
    1. アリコートを1μL、濃度100 mM、-80°Cから取り出し、室温で解凍するまで暗闇で保管します(例:手のひらの中や照明をつけていないバイオセーフティキャビネットのチューブラックで)。
      注意:RAアリコートが液体N2に保管されている場合は、すぐにマイクロ遠心分離機の蓋を開けてチューブの爆発を防ぎ、再び閉じてステップ2.2.2へ進みます。
    2. 解凍後、P1000ピペットを使って250μM濃度の予温済みN2B27diff培地400μLを加えます。均一になるように十分に混ぜてください。
      注:あるいは、RAをN2B27diff培地の代わりに純粋なDMSOで再構成・希釈することもできますが、これにより培養中のDMSO濃度が増加します。培地(N2B27diff)を調製する際、グルタミンは最大5〜10分間37°Cで、できれば常温で保存します。
    3. インキュベーターからNTOを育てている皿や皿を取り出し、滅菌されたバイオセーフティキャビネットに入れてください。
    4. 位相差顕微鏡で成長中のNTOを観察してください。NTOの形態は、培養の有効性や実験の有効性に関する情報を提供する上で極めて重要です(図4B-D参照)。
    5. 皿や皿の蓋を外し、皿を少し傾けて横に傾けます。培地はP200ピペットまたは吸引器を使い、細胞培養マトリックスを乱さずに慎重に吸引してください。培養液や細胞培養混合物の乾燥を防ぐため、NTOはできるだけ短時間培地なしで保管してください。
    6. 適切な量のN2B27diffに250 nM RA溶液を補足( 表2参照)を加え、蓋をしてからNTOをインキュベーターに戻します。
      注意:特にRAが完全に混ざっていなかった場合、通常のN2B27diffでは溶けにくい沈殿物が形成されることがあります。この場合、アリコートを廃棄し、新しいRAアリコートを作るべきです。これらの沈殿物は未知かつ制御されていないRA濃度を持つからです。

3. RAの除去およびNTOの毎日中等交換のルーチン

  1. 培養皿をインキュベーターから無菌のバイオセーフティキャビネットへ移します。
  2. 蓋を外し、プレートを少し横に傾けます。
  3. 細胞培養マトリックスに触れずに、P200ピペットまたは吸引器を用いて、RAを含むN2B27diffを慎重に吸引します。
  4. 事前に温めたPBS(細胞培養マトリックスの滴を覆うほどの量、表 2に記載されたように)を加え、プレートを再度傾けて慎重に取り除き、残ったRAを洗い流します。
  5. 適切な量のN2B27diff( 表2参照)を加え、培地をウェル/皿の壁に沿ってピペットで移動させ、細胞培養液滴を損傷しないようにします。
  6. ミディウムは毎日ステップ3.1-3.3の手順で交換し、その後ピペットでウェル/皿の壁に新鮮な予熱済みN2B27diffを優しく加え、NTOをインキュベーターに戻します。直接かつ激しいピペッティングや冷媒基/PBSの添加は、細胞培養マトリックス液滴の破損や剥離を引き起こすことがあります。
    注意:小分子や組換えタンパク質で経路を攪乱する場合は、培地を毎日交換することが重要です。薬剤を1日以上塗布する場合は、タンパク質や薬剤の安定性と適切な濃度の維持を確保するために、毎日または少なくとも2日に一度薬剤を新たに準備する必要があります。

4. NTOの固定

注:NTOはKrammerらによって記述された通り固定されています。その後に使用される抗体によっては、市販品、社内製など異なる供給源からのPFAが必要になることがあります。

  1. PFAアリコートを4°Cで一晩解凍します。
  2. 使用前にPFAを室温に保ちましょう。
  3. PFAの濃度が高い場合は、化学フードでN2B27diff培地またはPBSでPFAを4%まで希釈します。
  4. インキュベーターからNTOを取り出し、化学フードに移します。
  5. 蓋を開けて4%のPFAを1:1の比率でNTOに直接加え、最終濃度2%にします(例:96ウェルプレートの100μL N2B27diffに4% PFAを100μL加えた)。
  6. 蓋を戻し、室温で30分間培養します。タイマーをセットしてください。長時間の固定は特定の抗体治療の効果を損なうことがあります。
    注意:PFAは有毒であり、吸入してはいけません。化学フードの下で慎重に作業してください。一部の抗体は特定のPFAの使用や、より短く最適化された固定時間を必要とします。
  7. 30分後に蓋を外し、プレートを少し横に傾けてから手順3.3-3.4を進めます。
  8. 事前に温めたPBSを慎重に加え(表 2に記載されたように細胞培養マトリックスの滴を覆うほどの体積を保ち)、室温で5分間培養します。この工程を3回繰り返して、残ったPFAをすべて除去します。
  9. 最終洗浄後、適切な量のPBSを加え( 表2参照)、パラフィルムでプレートを密封し、4°Cで保存して使用を待つ。

5. NTOの抗体染色

  1. 抗体染色は、NTOの正しい同定やアッセイ・実験の成功を評価する上で貴重なツールです。抗体染色は、Meinhardtら24 およびKrammerら26で述べられているように実施可能です。
    注意:NTOが最適でない(図4E-G)や適切な時空間マーカー表現を示しない場合は(図5から図7)、品質基準を満たしていないとして資料は破棄してください。
  2. ブロック/透過化溶液(1xPBS、1%BSAと0.5%トリトンX)を4°Cで保ち、使用前に室温に適応させてください。
  3. 完全な3D再構成と解析のためには、抗体(第1および第 2抗体)を少なくとも1〜3夜、できれば2〜3日4°Cで保ち、良好な抗体浸透を確保してください。
    注:Alexa Fluor抗561第2次 抗体は、分化アッセイの最初の3日間で細胞培養マトリックス内でより強い背景信号を与える可能性があります。

6. NTOの清算

  1. クリア26の準備を
    1. クリアリング手順を始める前に抗体染色を完了してください(第1抗体と第2抗体の両方を培養し、十分に洗浄してください)。
    2. 透明化液にプロピルガレート(1mLの透明化液1mlあたり2mg)を加え、NTOの光漂白を最小限に抑えます。
      注意:画像撮影の1〜2時間前にクリアリングを行い、酸化(液体が薄い黄色やクリーム色から濃い明るい黄色、あるいは茶色に変わる)やクリアリング溶液の結晶化を防ぎましょう。結晶化が起きた場合は、PBSを井戸に加えて溶解します。
  2. 溶液のpHと混合の注意点
    1. 急速な酸化や細胞培養マトリックスの溶解を防ぐために、クリアリング溶液の適切なpHを維持してください。
    2. 空気の泡形成を防ぐために、激しい振る舞いや溶液の強い混合は避けてください。

7. NTOの分析

  1. 顕微鏡下の準備
    1. 抗体染色と全組織クリアリングが終わった後、10〜40倍対物レンズを持つ共焦点顕微鏡でイメージングを行います。
  2. 視覚的評価
    1. 視覚的評価と手動定量を用いて、NTOが適切な神経マーカーの発現や背腹側組織を示すかどうかを効率的に判断します。
  3. 3D解析ソフトウェア
    1. 3D解析には、CellProfiler28、29、Imaris(ファイルコンバーターおよびビューア)などのソフトウェアを活用して空間マーカーや構造の詳細を評価してください。
  4. NTOの同一性の検証
    1. 神経マーカーの時間的発現と特定の背腹側パターンマーカーの時空間的発現を評価することで、NTOsの正しい同一性を確認しましょう。このステップは、さらなる研究前に分化アッセイが成功していることを保証するために不可欠です。
  5. 特徴付けの側面:文化成功の以下の重要な側面を確認するために 、図4および 図6 、 図7 を参照してください。
    1. 図 4 およびMeinhardtら24 に示されたZO-1染色を参照し、上皮化と腔形成の成功を検証してください。
    2. 神経分化の成功は、OCT4のダウンレギュレーションとSOX1のアップレギュレーション、そしてβ3TUBULIN発現(詳細は24参照)によって特徴づけられます。神経分化が成功しているかどうかは 図6 と 図7 を参照してください。
    3. 背側パターンは、腹側のFOXA2+/SHH+ 床板の存在と対向の背側極でのPAX3+ 発現によって確認されています(詳細な腹側パターンは26で)。背腹側のパターン形成が成功しているかどうかは 図6 と 図7 を参照してください。

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結果

この原稿に示された図のすべての代表例にはR1マウスESCが使用されました。他のマウスESCは、NTOsにシードされた際に上皮化タイミング、神経分化、またはパターン効率にわずかな差を示すことがありますが、結果はここに示したデータと大きく異なるはないはずです。

適切な細胞密度(図3)にシードされた良質なESC(図2A)のみが良質なNTO(図4B)を形成します。良質なESC(図2)を適切な密度(図3)で細胞培養マトリックスにシードすると、これらの単一細胞は2日以内にクローニング的に拡大し上皮化します(図4B,C)。NTOは滑らかで丸い...

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ディスカッション

ここでは、高品質NTOを生成するための元のプロトコルの最適化や改良をいくつか提示し、研究室間の標準化を促進することを目的としています。主な改良点には、異なるESC培養条件、入力細胞数の減少、改良された分化培地、改良された分化プロトコル、そして多ウェルプレートを用いた高スループット解析のためのシーディング密度調整が含まれます。プロトコルのいくつかの側面は、信頼性が高く再現可能な結果を得るために特に重要です。まず、適切なタンパク質濃度を持つ適切な細胞培養マトリックスを使用する必要があります。なぜなら、不適切な濃度はNATOパターニング効率に悪影響を及ぼす可能性があるからです( 表3参照)。次に、細胞は適切な密度で単一細胞としてシードされなければなりません。種子の塊は「ブドウ状」の形成や多ルーメンを持つ非上皮化NTOを引き起こすことがあります。第三に、シーディング前にESC維持培地から2iLIFを完全に除去することが不可欠であり、いかなる残留もNTO上皮化を損なう可能性があります(

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開示事項

著者たちは利益相反を一切認めていない。

謝辞

このプロトコルの開発に関わる田中研究室の現職および元メンバーの皆様に感謝申し上げます。特に、原稿を批判的に読み、意見を提供し、回路図作成を支援してくれたA. ペルツル氏、そして原稿の批判的な読解、編集、設計図支援、さらにユルゲン・A・ノブリッヒ氏と共にPUD 25の資金調達を行ってくれたE. チャツィダキ氏に感謝します。この出版物はオーストリア科学基金(FWF)の資金提供を受け、「独立出版物プロジェクト番号PUD 25」によって提供されました。さらに、このプロジェクトは欧州研究評議会(ERC)のHorizon 2020研究・イノベーションプログラム(助成金契約ERC AdG 742046)およびオーストリア科学基金(FWF)[10.55776/ F7803-B](幹細胞調節)からも資金提供を受けています。オープンアクセスの目的で、著者は本投稿に基づき、著者受理原稿(AAM)版にCC BYパブリック著作権ライセンスを適用しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
35mmディッシュ|No. 1.5 カバースリップ |14 mm ガラス径 |コーティングされていないマテック・コーポレーションCat# P35G-1.5-14-C
アキュターゼインビトロジェン猫#00-4555-56
アルブミン(BSA)フラクションV(pH 7.0)Panreac AppliChemカタログ# A1391
オールトランスレチノイン酸メルクカタログ# R2625
B-27サプリメント(50X)、血清不使用ギブコキャット#17504044
基底膜マトリックス(マトリゲル)コーニングキャット# BDL354234タンパク質濃度:10 mg/mlおよびnbsp;
CellCarrier-96 ウルトラマイクロプレートパーキンエルマーキャット# 6055302
セルプロファイラー4Stirlingら 2021年https://cellprofiler.org
CHIR 99021トクリス猫#4423
立方次元R+(N)松本ら、2019年該当なし
ジメチルスルフォキシドシグマ・オルドリッチカテゴリー# D2650
DMEM/F-12、グルタミンなしギブコキャット#21331020
ダルベッコsリン酸塩緩衝生理食塩水(DPBS、1X)ギブコキャット# 14190144
エッペンドルフ遠心分離機 5810 Rエッペンドルフ猫#5811000015
エッペンドルフ・マイクロチューブ 3810Xメルクキャット# EP0030125150
ファルコン円錐遠心分離機チューブコーニングキャット# 352095
ゼラチンメルクCat# G2500
L-グルタミン(200 mM)ギブコキャット#A2916801
HeracellVIOS 160i CO2インキュベーター、165Lサーモフィッシャー・サイエンティフィックキャット# 51033557
イマリスオックスフォード・インストゥルメンツhttps://imaris.oxinst.com
逆LED位相コントラスト顕微鏡(CKX53)オリンポス
2-メルカプトエタノール(50 mM)ギブコ猫#31350010
モノクローナルマウス抗OCT-3/4サンタクルーズ・バイオテクノロジーカタログ#sc-5279;リッド:AB_6280511:200を使ってください
モノクローナルマウス抗PAX3DSHBCat# PAX3-C;リッド:AB_5284261:100を使ってください
モノクローナルウサギ抗SHHセルシグナル伝達技術カタログ#2207;リッド:AB_21881911:300をご利用ください
モノクローナルウサギの抗・ベータ;3-チューブリンセルシグナル伝達技術カタログ#5568;リッド:AB_106945051:500を使え
モノクローナルマウス抗ZO-1インビトロジェンCat#33-9100;リッド:AB_25331471:200を使ってください
マウスLIFクキンCat# Qk018-1000
N-2サプリメント(100X)ギブコキャット# 17502048
神経基底培地ギブコキャット# 21103049
パラホルムアルデヒド、試薬グレード、結晶性メルクカタログ# P6148
PD 0325901トクリスカタログ#4192
ペニシリン・ストレプトマイシン溶液ギブコキャット# 15140130
位相差顕微鏡
多クローナルヤギ抗FOXA2R&DCat# AF2400;リッド:AB_22941041:400を使いましょう
ポリクローナルヤギ抗SOX1R&DシステムズCat# AF3369;リッド:AB_22398791:200を使ってください
図6に関連するRNA-Seqデータ石原ら、2022年ジオ:GSE214368
SafeFAST プレミアム微生物安全キャビネットダシットグループ FASTERキャット# F00025200000
ピルビン酸ナトリウム(100 mM)ギブコキャット# 11360070
回転円盤共焦点逆立型顕微鏡(IX3)オリンポス
トライトン X-100シグマ・オルドリッチ猫#9036-19-5

参考文献

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