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方法論記事

化学遺伝学的プロファイリングデータにおける死亡制御遺伝子の同定のためのMEDUSA

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DOI：

10.3791/67892

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2025年2月7日

 , 
1Department of Systems Biology, UMass Chan Medical School

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、MEDUSA分析法を使用して、各遺伝子ノックアウトの死亡調節効果を定量化する方法について説明します。感度を最適化する実験条件を決定する手順と、分析の実行に関するステップバイステップのチュートリアルが含まれています。

要約

機能獲得または機能喪失の遺伝的摂動の系統的スクリーニングは、本質的に関心のある任意の細胞プロセスの遺伝的依存性と調節のメカニズムを特徴付けるために使用できます。これらの実験には、通常、単一遺伝子摂動のプールからのプロファイリングと、各遺伝的摂動が相対的な細胞適応度にどのように影響するかが含まれます。これらの方法は、化学遺伝学的プロファイリングと呼ばれることが多い薬効研究の文脈で適用すると、薬物の作用機序を特定するのに効果的であるはずです。残念ながら、適応度に基づく化学遺伝学的プロファイリング研究は、薬物反応のすべての要素を特定するのに効果的ではありません。例えば、これらの研究は一般的に、どの遺伝子が薬物誘発性細胞死を調節しているかを特定できていません。適応度ベースのスクリーニングにおける死亡制御を曖昧にする原因となるいくつかの問題には、増殖速度の変動、薬物による増殖と死の間の協調性の変動、場合によっては生細胞と死細胞からDNAを分離できないことなどがあります。MEDUSAは、従来の化学遺伝学的プロファイリングデータから死調節遺伝子を同定するための分析方法です。これは、コンピューティング シミュレーションを使用して、フィットネス自体をスコアリングするのではなく、観察されたフィットネス プロファイルを作成した成長率と死亡率を推定することで機能します。この分析法を効果的に使用するには、薬物の投与量、開始母集団のサイズ、アッセイの長さなど、実験条件の最適な滴定にかかっています。この原稿では、MEDUSAベースの分析のための化学遺伝学的プロファイリング研究の設定方法について説明し、化学遺伝学的プロファイリングデータの死亡率を定量化する方法を示します。

概要

化学遺伝学的プロファイリングでは、系統的な遺伝的摂動を使用して、特定の薬物応答に対する各遺伝子の寄与を理解します1,2,3。これらの実験は貴重であり、薬物の結合標的や薬物の流入/排出のメカニズムなど、薬物反応に関する重要な洞察を明らかにすることができます。しかし、これらの実験は通常、すべての遺伝子を同時に評価するプール方式で行われるため、化学遺伝学的プロファイリングデータからメカニズムの洞察を得ることは困難な場合があります。

薬物誘発性細胞死の制御メカニズムと遺伝的依存性は、化学遺伝学的プロファイリングデータで解決するのが難しい傾向があります。この問題にはいくつかの理由がありますが、これらの多くは細胞増殖の変動の影響に起因しています4。例えば、細胞は指数関数的に増殖するため、遺伝的摂動が増殖速度に及ぼす影響は、細胞死亡率の変化よりも集団サイズに大きな影響を与えます。さらに、この偏った感度は時間の経過とともに悪化し、これらの実験は通常数週間にわたって行われるため、ほとんどの研究は増殖欠陥に対して非常に敏感で、薬物誘発性細胞死の変化に対して本質的に感受性がないように最適化されています。その他の増殖関連の問題には、増殖と死の間のさまざまな調整(例えば、各クローンが死にながらどのくらいの速さで成長し、これは遺伝的摂動によって異なるか)や、薬物がない場合の各クローンの増殖速度の変動、つまり薬物が効果的でなかった場合に回収されるべき/回収できたはずの細胞の予想数が変化するなどが含まれます。要するに、化学遺伝学的プロファイリング実験では、一般的に、相対的な集団サイズに比例する測定値を使用して遺伝的摂動の影響を採点し、治療を受けた集団と未治療の集団を比較するということです。集団サイズは細胞増殖率と細胞死率の両方の積であるため、細胞死の観点から見ると、増殖は交絡的な影響を表します。

これらの問題を解決するために、私たちはシミュレーション支援アプローチを使用して死亡を評価する方法(MEDUSA)5を作成しました。MEDUSAは、観測された相対的な個体群サイズのデータを計算シミュレーションのレンズを通して解釈し、各遺伝子クローンの観察された薬物反応を生成した薬物誘発性の成長率と死亡率の組み合わせを推測します。以前のデータは、この方法が遺伝的摂動が薬物誘発死亡率にどのように影響するかを正確に推測できることを示唆しているが、この方法の精度は、細胞増殖と細胞死が薬物によってどのように調整され、これらの速度が時間とともにどのように変化するかを詳細に理解することに依存する5,6。さらに、MEDUSAに基づく推論では、薬物が実質的な細胞死を引き起こす用量で試験される必要があります。重要なことは、これらの薬物投与条件は、開始集団のサイズとアッセイの長さについて追加の懸念を生じさせるため、慎重に検討し、最適化する必要があります。このプロトコルでは、MEDUSAベースの分析のための化学遺伝学的プロファイリング研究の設定方法と、この分析方法の詳細な使用方法について説明します。MEDUSAの全体的な目標は、各遺伝子の欠失が薬物誘発性の成長と死亡率にどのように影響するかを明らかにすることです。

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プロトコル

1. 細胞死を誘導するための薬剤投与量の最適化

注:以下のプロトコルは、FLICKアッセイ7,8を使用して、細胞株、薬物、および用量の1つの組み合わせを最適化するためのものです。このプロトコルのサンプルデータは、U2OS細胞における5 μMエトポシドの最適化とスクリーニングを説明していますが、同じ最適化ステップを細胞株と薬物/用量の他の任意の所望の組み合わせに適用することができます。このプロトコルでは、死細胞の収集や分析は必要ありません。このプロトコールは、死んだ細胞が除去されていれば、懸濁培養に使用できます。懸濁培養では、生存率マーカーまたは細胞死特異的マーカーを使用して、死細胞をソーティング/分離できます。

  1. FLICKアッセイを行う前に、8に記載されている詳細なプロトコルを使用して、細胞数、Triton-X透過化、SYTOX濃度、およびプレートリーダーの取り込み設定を最適化してください。
  2. 黒色の透明底96ウェルプレートのプレートセル。典型的な播種密度はウェルあたり1500〜5000細胞であり、この数は細胞株ごとに最適化する必要があります。細胞を37°Cで5%CO2 、湿度16〜24時間インキュベートします。
  3. ステップ(1.1)で最適と同定されたSYTOXの濃度を含む培地で薬物希釈液を調製します。薬物は通常、生物学的または臨床的に関連性のある用量8〜12を含む対数希釈シリーズ全体で試験されます。
    注:特定の薬物はSYTOXと同じ波長で蛍光を発することがあるため、このアッセイでは定量できません。このような場合、異なる波長で蛍光を発するSYTOXバリアントを利用することが有益である可能性があります。さらに、このアッセイでは、SYTOXの蛍光に影響を与える薬物に対する反応を評価したり、SYTOXがDNAに結合するのを防ぐことはできません。
  4. Triton-Xを使用して、ステップ(1.1)で最適化された濃度で1つのプレート(T0)を溶解します。細胞溶解後、プレートリーダーを使用してSYTOX蛍光を測定し、蛍光と細胞数との経験的に確立された関係に基づいて総開始細胞数を決定します(FLICKプロトコル7,8を参照)。
  5. プレートリーダーを使用して、T0の実験プレート中のSYTOX蛍光を測定し、ステップ(1.1)で設定を最適化します。
  6. SYTOX信号を3日間経時的にモニタリングします。結果の動的データを制約するには、1 日に少なくとも 3 つの時点を、それぞれ 4 時間間隔で使用します。
    注:このプロトコルは、3日間にわたる細胞死と増殖を評価します。この時間の長さは、通常、死を誘発する薬物には十分です。ただし、アッセイは、代替の死動態を持つ薬物に対応するために短縮または延長することができます。
  7. 最終時点の後、実験プレートをTriton-Xで溶解し、各条件の最終的な母集団サイズを決定します。
  8. フラクショナル生存率(FV)を計算し、FLICKプロトコル7,8で説明されているように、エンドポイントデータを線量曲線に適合させます。
  9. FVの線量曲線を評価することにより、約50%の細胞死を誘発する薬物の線量を特定します。
    注:SYTOXによる死細胞の同定には、原形質膜の破裂と核膜の破壊の両方が必要です。これらのメンブレンは継続的な維持管理が必要なため、SYTOXは薬剤によって誘発される細胞死メカニズムに関係なく、死んだ細胞を特定します。しかし、これらのプロセスはすべての細胞死に対して同じ効果を発揮するわけではなく、死細胞を正確に測定するSYTOXの能力に影響を与える可能性があります。さらに、細胞死メカニズムが異なれば、安定性も異なる細胞死体が生成されます。しかし、これまでに試験されたすべての形態の細胞死は、SYTOX結合DNA(透過処理された核内または細胞培養培地)をもたらすことがわかりました。このSYTOXシグナルは、通常、72時間のアッセイ全体を通して安定していますが、アッセイの開始時と終了時に総細胞数を評価することでモニターできます。

2. アッセイ長さの選択

  1. ステップ1で収集したFLICKデータを使用して、FLICKプロトコル7,8で説明されているように、各条件の致死率(LF)を経時的に計算します。前述したように、動的 LF データを遅延指数関数的死 (LED) モデルに適合させます9。
  2. ステップ 1 で特定した致死量ごとに、経時的に LF をプロットします。~50% LF を生成する用量と時点を選択します。
    注:~50%の致死画分は、CRISPRスクリーニングデータ中の強力な死特異的シグナルを濃縮し、ライブラリ表現5を維持するのに十分な生細胞を残します。ただし、一部の薬物は、文献の優先順位や、特定の望ましい表現型を誘導する狭い範囲の用量によって制約されます。用量が制限されている場合は、目的の用量が~50% LFに達するように、アッセイエンドポイントを短縮または延長する必要があります。50%の致死率が不可能な場合は、開始人口のサイズを増やす必要があるかもしれません。

3. 開始母集団のサイズを決定する

  1. 上記の最適化に基づいてスクリーニングをさらに最適化するために、目的の薬物用量を選択します。
  2. 10cmの皿に細胞を完全な培地でプレート化します。各条件は、T = 0の時点を含むスクリーニングの長さについて12〜24時間ごとに細胞をカウントできるように、技術的なトリプリケートと十分な生物学的複製でプレーティングする必要があります。
    注:めっき細胞数は、正味の集団増殖速度と細胞サイズを考慮して、未処理の細胞と処理された細胞で別々に最適化する必要がある場合があります。細胞は一般に、アッセイエンドポイントで細胞の健康状態を損なわないコンフルエンシーが得られる密度でプレーティングする必要があります(つまり、多くの細胞タイプでは80%<コンフルエント)。処理した細胞と未処理の細胞は、必要に応じて、ライブラリーの表現が維持されている限り、スクリーニング中に再播種することもできます。
  3. 細胞を5% CO2で37°Cで一晩インキュベートします。
  4. 治療プレートに所望の濃度で薬物を添加する。並行して、3つの未処理プレートから細胞を採取し、血球計算盤を使用して生細胞の数をカウントします。死細胞をトリパンブルー(または同等の生存率色素)で染色し、生細胞のみがカウントされるようにします。これらのデータは、T = 0 時点におけるセルの数を確立します。
  5. 12〜24時間後、3つの未処理プレートと3つの処理済みプレートから細胞を回収し、生細胞の数をカウントします。アッセイのエンドポイントに達するまで、回収を繰り返します。薬物および細胞死の動態を完全に理解するために、ステップ(2.2)で特定した時点から24〜48時間、生細胞をモニタリングすることが推奨されます。
  6. 集団サイズ (y 軸) を経時的 (x 軸) にプロットすることにより、生存率の変化を視覚化します。
    注:観察された最大細胞数と最終的な集団サイズに基づいて、エンドポイントでの致死率の大まかな推定を行うことができます。これは、FLICKアッセイ(ステップ1.9およびステップ2.2)を使用して生成された分画生存率および致死分画データと比較し、期待される細胞死量が達成されることを確認する必要があります。
  7. 母集団サイズが最も小さい時点を特定します。薬物の存在下で発生する増殖量に応じて、これはCRISPRスクリーニングの開始時または終了時のいずれかになります。
  8. 開始母集団のサイズを選択します。セルの開始数が、画面全体で最小 500x-1000x のライブラリ カバレッジを維持するように最適化されていることを確認します。
    注:たとえば、TKOv3ライブラリには70,948個のsgRNAがあります。このライブラリを500倍のカバレッジで表すには、アッセイ全体を通じて、1回の複製あたり35,474,000個以上の細胞を1回の条件で維持する必要があります。このボトルネックとなる集団サイズは、アッセイの開始時、または未処理または増殖中の条件に対するトリプシン処理およびダウンサンプリング後によく遭遇します。対照的に、ボトルネックとなる集団規模は、多くの場合、相当な致死性を誘発する薬物治療のアッセイエンドポイントにおける集団サイズによって決定されます。
  9. 必要に応じて、CRISPRスクリーニングに使用するプレート(例:15 cmプレート)で上記の最適化を繰り返し、薬効が正しくスケールすることを確認します。

4. CRISPRスクリーニングの実施

注:細胞は、薬物投与量とアッセイ長の最適化に続いて、確立されたCRISPRスクリーニング法を使用してスクリーニングできます。Moffatラボ10,11のTKOスクリーニングプロトコルなどの確立されたプロトコルを使用して、CRISPRスクリーニングライブラリーの調製、ウイルスの産生、CRISPRスクリーニングの実施、およびシーケンシング用のライブラリーの調製を行うことができます(図1A-B)。以下のプロトコルでは、シーケンシング後のカウントレベルのデータで実施する必要があるMEDUSA解析に固有の手順を説明しています。

  1. 各sgRNA(図1C)について実験的に観察された倍率変化を、以下に説明するように計算します。
    1. sgRNAレベルのカウントテーブルを生成して、解析用のシーケンシングデータを準備します。5,12で説明されているように、標準パイプラインを使用してシーケンシングライブラリをトリミングおよびマップします。
    2. シーケンシングライブラリの深さを正規化します。ライブラリの正規化は、手動で行うか、5,12 のように DESeq2 などの組み込み関数を使用して行います。すべてのガイドに対して正規化を実行するか、非ターゲット ガイドの分布を使用して正規化を実行します。
    3. 非標的化sgRNAを非標的遺伝子にランダムに割り当てます。例えば、遺伝子ごとに4つのsgRNAを持つライブラリーは、非標的遺伝子ごとに4つの非標的sgRNAを持つべきです。
    4. 対象(未処理/T0および/または処理済み/未処理)の各比較について、log2(fold-change)を計算します。これは、DESeq2 のパラメトリック フィットを使用して計算することをお勧めしますが、折り畳み変更を手動で計算することもできます。
    5. カウント数が少ないsgRNAをトリミングします。正しいトリミング戦略は、反復間のノイズのレベルと、これがカウントによってどのように変化するかによって異なります。これらの機能はCRISPRライブラリによって異なり、新しいデータについては複数のカットオフを並行してテストします。文献の先例に基づく一般的なカットオフ戦略には、ガイドの下位5%を削除するか、または名目上のしきい値13を下回るガイドを削除することが含まれます。
  2. 各単一遺伝子ノックアウトが増殖速度に及ぼす影響を、以下で説明するように決定します。
    1. 未処理の細胞の正味の集団増加率(NPG)を計算します(つまり、観察された集団倍加時間、 図1D)。これは、ステップ1のFLICKデータ、ステップ3の経時的な生細胞数、または目的の細胞株の以前の実験測定値から抽出できます。
    2. MEDUSAは、未治療の状態をモデル化するために3つのパラメータを必要とします:NPG:純人口増加率、倍増/ h;Tstart: 開始時点 (h)。これはデフォルトの 0 に設定されています。Tendunt: 未治療の状態の最終時点 (h)。
    3. NPG レートに考えられるすべての摂動をシミュレートします。for ループを使用して、可能な NPG 値の範囲を評価します。相対的な成長率ごとに、アッセイエンドポイントで観察されるlog2(倍率変化)を計算します。
    4. ステップ4.1.5の各実験sgRNAについて、観察データに最も近いシミュレートされた倍率変化を特定します。シミュレートされた倍率変化をもたらした相対的な増殖速度をそのsgRNAに割り当てます。
  3. 成長と死の間の調整を以下に説明するように特徴付けます。
    注:MEDUSAに必要なパラメータは、GRADE解析法14で解析すると、FLICKスタイルのデータから抽出できます。これには、(1)と(2)のデータを使用することも、追加のパラメータ化実験を行うこともできます。
    1. MEDUSAは、薬物の存在下での成長と死亡との間の調整を特徴付けるために4つのパラメータを使用します: GRdrug1:死亡発症前の薬物誘発成長率、倍増/ h;DO: 死亡開始時間 (h)。GRdrug2: 死亡発症後の薬物誘発成長率 (倍増/時間)。DR薬物:薬物誘発死亡率(致死率/hの単位)。DOをパラメータ化するには、LFキネティクスを使用します。LEDフィットから死亡発症時間を抽出します。
  4. LFキネティクスを使用してDR薬物 を決定します。平均死亡率は、最終LFを死亡発症後の時間(h)で割ることにより決定します。
  5. ステップ3の生細胞計数データからGRdrug1 を同定します。死亡する前に、データを単純な指数方程式に当てはめて、薬物誘発性増殖速度を決定します。
    1. ステップ 3 と薬剤 GRADE14 のデータを組み合わせて GRdrug2 を決定します。選択した薬物用量のGRADEを計算し、GRADEプロットにプロットします。GRADE = 0 の場合、GRdrug2 を 0 と仮定します。GRADE > 0 の場合は、GRADE を使用して母集団の平均成長率を算出します。GRdrug1 の実験的に決定された値に基づいて、観測された平均成長率をもたらす GRdrug2 の値を決定します。
      注:平均薬物誘発成長率は、観察されたデータポイント(つまり、薬物のGRデータとFVデータのペア)とGRADEスペースを構成する各ポイントとの間のペアワイズ距離を計算し、最も近いポイントを特定することにより、GRADEプロットから推測できます。詳細な手順については、参照14 を参照してください。薬物誘発性増殖率と死亡率は、薬物ごとに固定された値ではなく、特定の細胞状況で特定の用量の薬物に特異的です。
  6. 以下で説明するように、成長率と死亡率のすべての可能な組み合わせに対してシミュレートされた倍率変化を生成します。
    1. 実験的に決定された薬物誘発性成長率と死亡率の調整を使用して、薬物誘発性人口サイズを経時的にシミュレートするモデルを構築します(図1D)。このモデルは、薬物応答の 2 つの独立したフェーズ (死亡前と死亡後の発症時間) を組み合わせた区分関数として構築できます。
    2. 完全なMEDUSAモデルには、次の8つのパラメーターを含めます:NPG:純人口増加率、倍増/時間。GRdrug1: 死亡発症前の薬物誘発性成長率 (2 倍/時間)。DO: 死亡開始時間 (h)。GRdrug2: 死亡発症後の薬物誘発成長率 (倍増/時間)。DR薬物:薬物誘発死亡率、致死率/ hの単位。Tstart: 開始時点 (h)。これはデフォルトの 0 に設定されています。Tendunt: 未治療の状態の最終時点 (h);Tendtr: 治療された状態の最終時点 (h 単位)。
    3. ベースライン モデルでは、考えられるすべての成長率と死亡率の摂動をシミュレートします。各組み合わせについて、観測される log2 (fold-change) を計算します。
      注:MEDUSAでは、成長率への摂動は、NPG、GR薬品1、およびGR薬品2に比例すると仮定されます。例えば、NPG率が80%減少すると、薬剤誘発性の両方の成長率も80%減少します。
  7. 以下に説明するように、各ノックアウトの死亡率を推測します(図1D-E)。
    1. 各sgRNAについて、観察された倍率の変化を引き起こしたであろう薬物誘発死亡率を三角測量します。まず、ステップ(4.2.4)で決定した相対成長率を抽出します。
    2. GRdrug1 と GRdrug2 の料金を決定します。NPGからの相対成長率を適用して、GRdrug1/GRdrug2の比例成長率を計算します。
    3. NPG、GRdrug1、および GRdrug2 に対する制約を使用して、各 sgRNA (処理済み/未処理) の観察されたフォールド変化に最も近いシミュレートされたフォールド変化を特定します。これらの観測値を組み合わせて、薬物誘発性死亡率を逆算します。
  8. 遺伝子レベルの成長率と死亡率を以下のように計算します。
    1. ライブラリ内の各遺伝子の遺伝子レベルの速度を決定します。特定の遺伝子に関連するすべてのsgRNAの各成長率と死亡率の平均を計算します(通常は4〜10)。
    2. 経験的p値を計算するには、sgRNAレベルのデータをブートストラップします。Benjamini-Hochberg プロシージャーを使用して FDR 補正を実行します。
      注:MEDUSAを使用してCRISPRスクリーニングデータを分析するための補足的な手順とサンプルデータは、GitHubリポジトリ(https://github.com/MJLee-Lab/MEDUSA)に含まれています。

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結果

このプロトコルを使用して、U2OS細胞におけるエトポシド誘発死の遺伝的依存性を調査しました。エトポシドは、一般的に使用されるDNA損傷化学療法です15。この化学遺伝学的プロファイリング実験は、Cas9を発現するU2OS細胞5のGeCKOv2ライブラリ16を用いて行った。これらのタイプの実験では、通常、薬物処理された集団と未治療の集団を比較する際に、特定のノックアウトクローンの相対的な存在量から遺伝子機能が推測されます(図1A-B)。しかし、処理された状態と未処理の条件でノックアウト細胞の数を直接比較することはできません。これは、処理された集団と未処理の集団の合計サイズが非常に異なる可能性が高いためです。したがって、一般的な分析法は、一般に、ノックアウト細胞数を、例えば、非標的化sgRNAを含む細胞17,18

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ディスカッション

このプロトコルでは、遺伝的摂動が薬物誘発性増殖率と死亡率をどのように変化させるかをスコアリングするための化学遺伝学的プロファイリングデータを定量化するためのMEDUSA分析法の使用について説明します。化学遺伝学的プロファイリング実験の主要な出力は、率ではなく集団サイズに関連しているため、基礎となる率はシミュレーションを使用して推測されます。したがって、この方法の重要なステップは、未処理の細胞増殖速度、薬物誘発性死亡開始時間、薬物誘発性死亡率、および成長と死亡率の間の薬物GRADE推定調整を含む、薬物応答速度論の正確な実験的パラメータ化です。これらの機能は、観測された集団を基礎となる運動速度にマッピングすることを可能にするルールをまとめて生成します。

薬物特異的なパラメーター化は MEDUSA の推論の精度にとって重要ですが、理論的には、この分析方法は薬物特異的な情報がなくても使用できます。例えば、薬剤の投与量、アッセイの長さ、増殖速度、細胞死のレベルは、特別な機械や専門知識がなくても定量化できる可能性がありますが、...

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開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

私たちは、薬物反応の評価に関する私たちの研究室の視点に貢献してくださった、過去と現在のLee Labのすべてのメンバーに感謝します。この研究は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)からのMJLとMEH(U01CA265709、R21CA294000、R35GM152194はMJL、F31CA268847はMEH)、MJLはJayne Koskinas Ted Giovanis Foundationからの資金提供によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
100mm フィッシャーブランドTCディッシュフィッシャーサイエンティフィックFB012924細胞の増殖と集団サイズの最適化用
150mm フィッシャーブランドTCディッシュフィッシャーサイエンティフィックFB012925細胞の増殖とポピュレーションサイズの最適化用
DESeq2R パッケージv1.44.0倍数変化の計算用
DMEMコーニング10017CV播種および薬剤化用細胞
DMSOフィッシャーサイエンティフィックMT-25950CQC細胞の播種および薬剤化用
フィッシャーブランド96ウェル、細胞培養処理済み、U字型底マイクロプレートフィッシャーサイエンティフィックFB012932細胞の播種および薬剤化用(ピンプレート)
Greiner Bio-One セルスター & ミュー;Clear 96-well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom MicroplateGreiner655090細胞の播種および薬剤化用
MATLABMathworks R2024aFLICK、GRADE、MEDUSAの実施用
マイクロプレート蛍光リーダーTecanSparkデッドセル測定用
Sytox GreenThermo Fisher ScientificS7020デッドセル測定用
TKOV3 CRISPRライブラリAddgene125517CRISPRスクリーニングの実施用
Triton-X 100サーモフィッシャーサイエンティフィックJ66624-AP細胞の透過処理に
トリパンブルー コーニングMT25900CI生細胞/死細胞の測定用

参考文献

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