行動観察のためのゼブラフィッシュ幼生への揮発性麻酔薬の投与

サマリー

このプロトコルは、行動実験のためにゼブラフィッシュの幼生に揮発性麻酔薬を投与するための気密性環境を作り出すためのアクセス可能な方法を提示します。

要約

この研究では、行動実験中にゼブラフィッシュの幼生にイソフルランやセボフルランなどの揮発性麻酔薬を投与するためのユニークな方法について説明しています。ゼブラフィッシュは、脊椎動物のモデル生物として、複雑な行動、遺伝的扱いやすさ、透明な胚、急速な発生など、多くの利点を提供していますが、揮発性麻酔薬の研究におけるゼブラフィッシュの使用は限られています。揮発性麻酔薬の投与には、複雑で扱いにくい装置が必要になることが多く、広くアクセスできない可能性があり、水性モデル生物における揮発性麻酔薬の薬理学的研究に障壁が生じます。この方法は、接着シリコーンシートを使用してガラス96ウェルプレートに気密シールを作成する簡単な技術を示しています。検証は、自発的な動きの評価を通じて行われましたが、90 分間にわたって密閉されたウェルとオープンウェルの間に有意差は見られませんでした。さらに、麻酔薬の濃度は、HPLCで測定されたように、時間の経過とともに安定していました。代表的な結果には、セボフルランの有効濃度の中央値(EC₅₀)値の実験的決定が含まれます。この研究は、揮発性麻酔薬を使用した薬理学的実験のためのシンプルでアクセス可能なアプローチを提供し、他の揮発性物質や実験エンドポイントの研究に容易に適応させることができます。

概要

非水生動物モデル(ワーム、ハエ、げっ歯類、ウサギ、霊長類など)は、歴史的に麻酔薬理学の研究に最も一般的に使用されてきたモデルです。これらのいずれの種においても、揮発性麻酔薬(ガスの吸入によって投与される)は、静脈内麻酔薬(静脈内または腹腔内経路で^{投与される)}の投与よりもはるかに困難ではありません1。単に静脈内投与するという技術的な課題に加えて、揮発性物質の方が静脈内投与よりも安定した麻酔状態を達成する方がはるかに容易です²。

幼虫の水生種への静脈内麻酔薬の投与は、周囲の水性培地^からの拡散によって達成することができ^3,4、したがって、非水性種に対する揮発性麻酔薬の投与に類似しています。長年にわたり、オタマジャクシ(Xenopus laevis)は、薬物投与の容易さと、人工池^の水に麻酔薬を単純な入浴で追加することによって達成される定常状態の薬物動態により、麻酔薬を研究するためのモデルとして選択されていました^5,6。ただし、このモデルでは揮発性麻酔薬の研究の例が比較的少ないため、多くの場合、専用に構築され、使用するのが面倒なガス密装置が必要です^7,8。

近年、ゼブラフィッシュは、薬物投与の同じ容易さに加えて、それらのよく記述された複雑な行動およびこれらの行動を観察するための商用ユニットの利用可能性などの他の利点に加えて、静脈内麻酔薬の研究のための好ましいモデル^{となっている9。}最近の多くの研究では、ゼブラフィッシュの幼生^の行動を定量化するために、96ウェルおよび24ウェルプレートフォーマットを使用して、麻酔薬を含む神経活性化合物をスクリーニングするために、このような市販の観察ユニットが採用されています 4,10,11,12,13,14,15 .幼虫期は、多くの行動反応を評価する能力、その小さなサイズ、高いスループットの適合性、および十分に特徴付けられた神経回路9,16,17のために、薬理学研究に特に適しています。しかし、ゼブラフィッシュモデルにおける麻酔薬のこれらの研究における大きな制限の1つは、揮発性麻酔薬の投与が比較的難しいことです。この制限は、揮発性薬剤と静脈内薬剤の比較の例をほとんど示さなかった^4,15,18。1つの動物モデルで両方のクラスの麻酔薬を簡単に研究および比較できることは、すべてのクラスにわたる麻酔薬理学の研究を容易にするための重要なツールを追加します。

従来、水生生物の静脈内麻酔薬の研究には、使用が困難であったり、実験期間中の麻酔薬の損失を防ぐために十分な気密性がなかったりする、特殊な、多くの場合カスタムの機器が必要でした。ここで説明する手順は、市販の観察ユニットを使用してゼブラフィッシュの幼生の行動を観察するのに適したガラスチャンバー内で気密シールを製造するための簡単にアクセスできる代替手段を示しています( 材料の表を参照)。

プロトコル

すべてのゼブラフィッシュの実験は、IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)が承認した動物使用プロトコルに従って行われました。成魚のゼブラフィッシュは、University Laboratory Animal Resources(ULAR)の監督の下、ペンシルベニア大学の水生施設で飼育されていました。テュービンゲンのロングフィン野生型ゼブラフィッシュは、すべての実験で社内で飼育され、受精後5日(dpf)に達するまで、13/11時間の明暗サイクルで標準的な飼育条件下で維持されました。実験は生物学的複製を使用して行われ、クラッチは適切な生物学的多様性を確保するために異なる交配ペアから派生しました。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 接着性シリコーンシートの製作

注:この素材の同等物(シリコーンシートと接着剤)は商業的に調達できますが、多くの場合、費用がかかり、入手性が低くなります。

1. 0.5mmのシリコンシートを清潔で平らな面に広げます。
2. シートにしわがないか調べ、可能な限り避けてください。
   注:折り目のあるシリコンシートは、テープに適切に接着せず、ウェルのシールが不十分になったり、ゼブラフィッシュの視認性が低下したりする可能性があります。
3. シートを70%アルコールで拭いて、油や破片を取り除き、乾かします。
4. 絵筆などのアプリケーターを使用して、シリコーンシートに接着剤プライマーを薄く均一に塗ります。過度の塗布を避けるために、接着剤のプロモーターが急速に乾くため(1〜5秒でセット)、小さなセクションで作業します。
   注意: この接着プロモーターがないと、テープはシリコンシートに適切に接着されません。
5. 粘着プロモーターを塗布したら、両面テープをシリコンシートに合わせ、紙の裏面を上にして貼り付けます。
6. ローラーを使用してテープをシリコンに徐々に貼り付けて、表面を滑らかにし、気泡を取り除きます(最初の貼り付け後、シリコン側を上にして作業すると、気泡の視覚化と除去に役立ちます)。
7. 接着剤プロモーターを平らな面で24時間完全に硬化させます。
8. 接着剤のシリコーンを少なくとも10 mm幅(ウェル径7.5 mmプラス両側の重なり)のストリップにカットします。
   注:ウェルプレートの1列おきに使用する場合、ストリップのばらつきが広くても隣接する列のウェルに悪影響を及ぼさず、塗布が容易になるだけでなく、ウェルの全周にシールを張る必要も生じる可能性があります。
   1. ストリップが、少なくともウェルプレートの1列の幅をカバーするのに十分な長さであることを確認してください。
      注:24ウェルプレートや48ウェルプレートなど、96ウェルではないウェルプレートを使用する場合は、プレートの特定の寸法に合わせてストリップサイズを調整またはカットできるため、プレートサイズに関係なく適切なカバレッジを確保できます。

2. 溶液の調製

注:揮発性麻酔薬のすべてのストック溶液とアッセイ溶液は、揮発性化合物濃度の損失を避けるために実験の直前に作られました。

1. 各溶液(ストック溶液または作業溶液)について、不揮発性溶媒(E3胚水、DMSOなど)をHPLCまたはシンチレーションバイアルに加え、揮発性麻酔薬の最終希釈と組み合わせることで、総容量がバイアルに十分に充填され、最小限のヘッドスペースが残ります( 図1Aを参照)。
2. ハミルトンの気密シリンジで揮発性麻酔薬を追加し、バイアルをすばやく密封します。.
   注:セプタム蓋付きのバイアルに入ったストック溶液は、気密シリンジによる溶液の移し替え により 、さらなる希釈を容易にするために使用できます。
3. 次に、必要に応じてバイアルを混合(ボルテックス、超音波処理)し、ゼブラフィッシュプレートを調製しながら一時的に保管します。

3. 行動実験のセットアップ

注:プロトコルのこの手順には、ある程度の練習が必要な場合があります。技術に慣れるまで、魚や貴重な材料を含む溶液を使用せずに作業することをお勧めします。

1. ゼブラフィッシュの幼生1匹(5 dpf)をガラス製96ウェルプレートの1列おきに移します。
   注:1行おきに空欄にすると、ステップ3.4でウェルが密封されるため、隣接するウェルがスピルオーバーで汚染される可能性を減らすことができます。
2. 各ウェルからE3溶液を慎重に取り出します。これは、一度に1列ずつ行うことも、迅速に作業できる場合はプレート全体で行うこともできます。
   注:幼虫が溶液から出ていた時間は、潜在的なストレスを軽減するために最小限に抑えられました。ストレスを最小限に抑えるために、薬物含有溶液を添加する前に溶液を部分的にのみ除去するなど、さまざまな実験的ニーズに基づいて代替手順を使用できます。プロトコルは、潜在的なストレスを補償するために動物に与えられる平衡化時間、溶液混合効率、薬物含有溶液の濃度の精度など、実験のニーズに合わせて適合させる必要があります。
3. 次に、トランスファーピペットを使用して、行の各ウェルに実験溶液を充填します。気泡が入らないように注意してください。各ウェルを過剰に充填します(図1B)。
4. 手順1で作成した粘着性シリコンストリップを使用して、ストリップをすばやく下に押し下げます(図1C)。これにより、気泡の形成を防ぎ、魚が隣接する井戸に溢れるのを防ぎます。
5. プレートの上部をしっかりと押して、各ウェルが密封されていることを確認します。
6. 溶液が交換され、ウェルプレートの他のすべての列のウェルが密封されるまで、手順2〜5を繰り返します(図1D)。
7. プレートを静かに裏返し、気泡がないか調べます。
   注:気泡の存在は、ゼブラフィッシュの動きの視覚化を不明瞭にします。
8. プレートを行動観察ユニット(シリコーン接着剤面を下にして)に置き、行動実験を行います(詳細については、結果のセクションを参照)。

結果

従来のオープンウェル観察との比較
接着剤のシーリングが自発的な動きに影響を与えるかどうかを評価するために、オープンウェルとシーリングウェルのコントロールを比較しました。 図 2A に見られるように、この記事で説明した実験で使用した標準的な ~30 分間、これらのグループ間で運動に統計的に有意な差は観察されませんでした。他の実験パラダイムがより長い実験曝露を必要とする可能性があることを認識して、2時間の時間経過が実行され、2時間のマークまで動きに統計的な差がないことが示されました( 図2Bを参照)。実験時間が長くなると、動きの差がさらに大きくなる可能性があります。以前の研究では、低酸素症が遊泳行動¹⁹に及ぼす悪影響が定量化されており、最終的には実験結果の完全性が損なわれています。したがって、低酸素症および/またはCO₂ 産生が、オープンウェルコントロールと比較してSMのこの偏差の最も可能性の高い原因であると仮定さ...

ディスカッション

この記事では、野生魚の揮発性麻酔薬の効力を定量化するために使用された、セボフルランのような揮発性麻酔薬をゼブラフィッシュの幼生に容易に投与する方法について説明します。この手法は概念的には単純ですが、揮発性物質の損失を最小限に抑えるために、短時間で適切に密閉された気泡のないウェルの列を確保するには練習が必要です。この方法は揮発性化合物を対象としているため、ウェルプレートにシリコーン接着剤を慎重に塗布するだけでなく、揮発性化合物濃度の精度を最適化するための実験溶液の慎重な調製も必要です。

空気が閉じ込められると、正確な視覚化と追跡が妨げられる可能性があります。実際のシーリングに加えて、シーリング前に存在する気泡がシーリングプロセス中に除去される可能性が低いため、各ウェルの慎重な充填と検査が重要です。ウェルの過剰充填は、各ウェル内の空気の閉じ込めを防ぐのにも役立ちます。ただし、過充填が多すぎると、魚が隣接する井戸に意図せずに移動する可能性があります。このような場合は、過剰に充填する量を減らしてください。過剰な過剰充填を最...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェルガラスマイクロプレート	ジンサー北米	3600500	「これらのガラスマイクロプレートは、特殊な高純度で耐熱性のあるホウケイ酸ガラスで作られており、表面は酸研磨されています。プレートは、標準のSBSマイクロプレートフットプリント(85 x 127 mm)で長方形です。これらのガラスリアクターマイクロプレートは、主に化学用途で使用するために設計されており、530°Cまでの温度に耐性があります。C. オートクレーブ滅菌できます。均質なガラスシートから機械加工され、井戸間で一貫した温度(標準0.2°C以内)を提供する均一な形状と形状が特徴です。」
2.0 mL 透明、大きな開口部、9 mm スレッドバイアル	ケムグラスライフサイエンス	CV-1150-1232	「開口部が 40% 大きくなったこれらのバイアルは、ロボットアームのオートサンプラーで動作するように特別に設計されています。また、バイアルのネックに限られた容量のインサートを正確に中央に配置する独自のステップバイアル設計も組み込まれています。"
3M両面テープ9490LE	アッヴィ社	24WG90	「3M ラミネート接着剤 300LSE を使用した 3M 両面テープ 9490LE は、ポリプロピレンや粉体塗装塗料などの多くの低表面エネルギープラスチックを含む、ほとんどの表面に高い接着強度を提供します。アクリル系接着剤は、機械部品に通常使用される油で軽く汚染された表面にも優れた接着力を発揮します。3M両面テープ9490LEは、片面に3Mラミネート接着剤300MPの追加機能を提供し、さまざまなフォームや布地素材(6インチ x 5ヤード)に優れた接着強度を提供します。
DanioVision観測室	ノルドゥス	DVOC-0041	「DanioVisionは、マルチウェルプレートでのゼブラフィッシュ幼虫のハイスループットテスト用に設計された完全なシステムです。これには、観察室と有名なビデオ追跡ソフトウェア EthoVision XT が含まれています。」
DanioVision温度制御ユニット	ノルドゥス	DVTCU-0011	「DanioVision温度制御ユニットはフロースルーシステムです。水は、選択した温度でウェルプレートの下に均等に流れます。温度はウェルプレート全体で同じです。」
Ethovision XT16ソフトウェア	ノルドゥス	NSE-EV-ベース	「EthoVision XTは、Noldusが商標登録したあらゆる動物の行動、動き、活動を追跡および分析する、最も広く適用されているビデオ追跡ソフトウェアです。」
イソフルラン	ピラマル救命救急	NDC # 66794-017-10	吸入用液体、不燃性の非爆発性吸入麻酔薬で、イソフルラン100mLを配合。制御された室温20ºで保管;25ºに;C
スコッチウェルド瞬間接着剤プライマーAC79クリア	3メートル	「62-3916-0860-1 (品番) C2103N (ロット)」	「3M Scotch-Weld Instant Adhesive Primer AC79 は、EPDM、シリコーン、その他のゴムなど、接着が困難な低表面エネルギー エラストマーに使用するように設計されています。表面処理と塗布は簡単で、接着剤プライマーは速乾性があるため、作業を迅速に進めることができます。」
厚さ0.5mmのシリコンシート	さまざまなサプライヤー	該当なし	半透明のシリコンシートは複数のサプライヤーから購入しました
スピードボール ポップイン ハード ラバー ブレイヤー プラスチック フレーム付き、4 インチ"	速球	793728	「スピードボール ポップイン ハード ブレイヤーには、簡単に掃除できるようにスナップアウトするローラーが付いています。プラスチック製の一体型フレーム、取り外し可能な4インチ幅のローラー付き。純天然ゴムを使用し、研磨仕上げを施しています。硬質ゴム製のブレイヤーは幅 4 インチで、頑丈なプラスチック フレームで接着剤の塗布に最適です。」
SureSTART 9 mm スクリュー キャップ、レベル 2 ハイスループット アプリケーション、タイプ: AVCS スクリュー キャップ ブラック PP、ホワイト シリコン/レッド PTFE セプタム 1.0 mm	サーモサイエンティフィック	6ASC9ST1B	「Thermo Scientific SureSTART 9 mm スクリューキャップは、開口部が 9 mm のスクリューバイアルで使用してください。パフォーマンスレベル2のキャップは、yルーチンのGC-MSおよびLC-MS分析において、低ブリーディング、堅牢性、および結果の再現性を保証するために製造およびテストされています。オートサンプラーの針の問題を軽減するように設計された、さまざまな硬度値の万能シリコン/PTFEセプタムを備えたポリプロピレンキャップからお選びください。当社のAVCSキャップには、バイアルを閉じる際の最適なシール圧縮を保証するAdvanced Vial Closure Systemテクノロジーが組み込まれています。」
ウルタンセボフルラン	アッヴィ社	NDC # 0074-4456-04	吸入用揮発性液体は、250 mL のセボフルランを含む琥珀色のボトルに包装されています。制御された室温15ºで保管;30ºまで;C
ウィートン液体シンチレーションバイアル、バイアルに取り付けられたキャップ、ガラス、金属箔/パルプ、24-400、20 mL	DWKライフサイエンス	986561	タイプ I ホウケイ酸ガラス管、PET、または HDPE から変換された 20 mL シンチレーションバイアル。キャップ付きでご利用いただけます。