方法論記事

遺伝的にコードされた電圧インジケーターを用いたミトコンドリア膜電位 のin vivo 測定

DOI：

10.3791/67911

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2025年2月21日

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1Clinical Systems Biology Laboratories, The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, 2Department of Neurology, The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, 3The Academy of Medical Sciences, Zhengzhou University

この記事について

サマリー

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このプロトコルは、ミトコンドリアを標的とする遺伝的にコードされた電圧インジケータ(GEVI)のアプリケーションについて説明しています。これらのGEVIは、ミトコンドリア膜電位の特異的、 in vivo、およびリアルタイムのモニタリングを可能にすることにより、従来のミトコンドリア膜電位色素に比べて大きな利点を提供します。

要約

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ミトコンドリア膜電位(MMP、ΔΨm)は、ATP合成、イオン輸送、活性酸素種(ROS)の生成、核にコードされるタンパク質の輸入など、ミトコンドリアの機能にとって重要です。ΔΨm を測定する既存の方法は、通常、ローダミン800やテトラメチルローダミンメチルエステル(TMRM)などの親油性カチオン色素を使用しますが、これらは特異性が低いため制限があり、 in vivo アプリケーションにはあまり適していません。これらの制限に対処するために、遺伝的にコードされた電圧インジケータ(GEVI)を利用した新しいプロトコルを開発しました。膜電位の変化に応答して蛍光シグナルを生成する遺伝的にコードされた電圧指標(GEVI)は、原形質膜およびニューロン電位のモニタリングに大きな可能性を示しています。しかし、ミトコンドリア膜への応用はまだ未開拓です。本研究では、生きた動物の細胞や運動野のΔΨm揺らぎを検出できるタンパク質をベースとしたミトコンドリア標的GEVIを開発しました。ミトコンドリア電位指標(MPI)は、ΔΨm ダイナミクスをリアルタイムで研究するための非侵襲的アプローチを提供し、正常条件と病理学的条件の両方でミトコンドリア機能を調査する方法を提供します。

概要

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ミトコンドリアは真核細胞の必須細胞小器官であり、アデノシン三リン酸(ATP)の生成を通じて主要なエネルギー供給者として機能するとともに、代謝物合成、カルシウムイオンの緩衝、熱産生、細胞生存の調節など、さまざまな重要な機能も果たしています1。その役割は、脳や心臓などの代謝性の高い組織で特に重要であり、細胞の恒常性を維持するのに役立ちます。ミトコンドリア膜電位(MMP、Ψm)は、酸化的リン酸化によるATP合成の促進、ミトコンドリア膜を介した代謝物とイオンの輸送の促進、活性酸素種(ROS)の生成に寄与するなど、これらのプロセスの中心です2,3。MMPは、マイトファジー(ミトコンドリアの選択的分解)5やアポトーシス(プログラムされた細胞死)6など、ミトコンドリアの形態と動態4にも影響を与えます。適切なΨmを維持することは、細胞機能にとって不可欠です。その調節不全は、神経変性疾患、心不全、癌など、多くの病状に関連しています。現在のΨm測定法は、TMRM(テトラメチルローダミンメチルエステル)、TMRE(テトラメチルローダミンエチルエステル)、ローダミン123、サフラニンO、ローダミン800、DiOC6、JC-1などの親油性カチオン性色素の使用を主としていました7。ただし、これらの蛍光分子にはいくつかの制限があります。これらの色素は細胞特異性を欠き、消光の影響を受けやすく、一部は有毒です。さらに、それらは時間の経過とともに拡散することがあり、ミトコンドリアΔΨが失われると漏れ出し、脱分極したミトコンドリアの膜電位を示すことができなくなります。さらに、TMRMやTMREなどのロダミンベースの色素は温度感受性があり8、特に細胞の熱発生に関与する生理活性中のミトコンドリア膜電位を測定する場合は、色素の蛍光に対する温度の影響を慎重に検討する必要があります。

遺伝的にコードされた電位指標(GEVI)は、蛍光シグナル9,10を通じて膜電位の変化を検出できるタンパク質であり、さまざまな細胞状況で膜電位を監視するための強力なツールとして浮上している11。GEVIは原形質膜の研究に広く適用されてきましたが、特にミトコンドリアの細胞内膜電位を測定するためのGEVIの適応はほとんど進んでいません。このプロトコルは、in vitro および in vivo でミトコンドリア膜電位を監視できるミトコンドリア標的 GEVI を使用して、このギャップに対処しようとしています。既存のGEVIにミトコンドリアシグナル配列を付加することにより、適切なGEVIをミトコンドリア12に標的化することができる。これらのミトコンドリア電位指標(MPI)は、ミトコンドリアの生理学に関する新たな洞察を提供し、in vivoでのさまざまな病態におけるミトコンドリアの機能を探索するための大きな可能性を提供し、ミトコンドリアのダイナミクスが正常な細胞プロセスと病理学的な細胞プロセスの両方にどのように寄与するかについての理解を深めます。

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プロトコル

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すべての動物の世話と実験は、鄭州大学の施設動物管理および使用委員会のガイドラインに従って行われました。使用前にすべての手術器具を滅菌してください。感染を防ぐために、無菌技術に従ってください。すべてのデータが取得された後、動物は吸入麻酔の過剰投与とそれに続く斬首を使用して安楽死させられました。

1. in vitro アプリケーション

  1. プラスミド構造
    1. Addgeneから、または配列から合成する活動電位1(ASAP1)およびASAP3遺伝子の加速センサーを取得します。(ASAP1、NCBIアクセッションID:AHV90412.1、Addgene ID:52519;ASAP3、Addgene ID:132331)。
    2. プラスミド構造には 、表1 にリストされているプライマーを使用してください。
    3. 細胞での発現には、EGFPN1ベクターを構築に使用します。
      1. 最初に、Cox8遺伝子配列(NP_004065、アミノ酸1〜29)を、NheIおよびXhoI制限部位に隣接する4つのタンデムリピート(4cox8)で合成します。合成した4cox8フラグメントとEGFPN1ベクターの両方をNheIおよびXhoIで消化し、続いてライゲーションして4cox8-EGFPベクターを生成します。
      2. 続いて、ASAP1配列のPCR増幅をプライマー1およびプライマー2で行います。ASAP1フラグメントと4cox8-EGFPベクターをSalIおよびNotIで消化し、続いてライゲーションして最終的なMPI-1ベクターを生成します(MPIはミトコンドリア電位インジケーターの略です)。
        注:CMV-MPI-1のベクトルマップを 図1に示します。詳細な配列はNCBI(アクセッションID:PQ678920)からアクセスできます。
    4. ニューロンでの特異的発現のためには、AAV-hSyn-EGFPプラスミド(NCBIアクセッションID:MH458079、Addgene ID:50465)のhSynプロモーター配列のPCR増幅をプライマー3およびプライマー4を用いて行いましょう。
      1. hSyn配列と4cox8-EGFPベクターの両方をAseIおよびNheIで消化し、続いてライゲーションを行い、hSyn-4cox8-EGFPベクターを生成します。続いて、ASAP3配列のPCR増幅をプライマー1およびプライマー2で行います。
      2. hSyn-4cox8-EGFPベクターとASAP3配列をSalIおよびNotIで消化し、続いてライゲーションを行い、hSyn-MPI-2ベクターを生成します。
        注:PCR条件は、特定の酵素とプライマー融解温度(Tm)によって異なります。一般的なPCR反応では、95°Cで30秒間の初期変性ステップを行い、その後、25〜35サイクルの変性(95°C、10秒)、アニーリング(55°C、30秒)、および伸長(72°C、30秒/kb)を行います。72°Cで5分間の最終的な伸長ステップにより、完全な製品合成が保証され、その後4°Cで保持されます。 アニーリング温度は、プライマーのTmより約5°C低くする必要があります。最適なPCRパラメータについては、製造元の指示を参照してください。ASAP1とASAP3のプライマーは同じです。
  2. 生細胞でのイメージング
    1. 10%ウシ胎児血清と100 mg/Lペニシリン/ストレプトマイシンを培地に添加して、DMEM培地を調製します。
    2. Ca2+ トランスフェクション試薬を調製します: 2.5 mol/L CaCl2、2x HEBS (274 mmol/L NaCl、10 mmol/L KCl、1.4 mmol/L Na2HPO4、15 mmol/L D-グルコース、42 mmol/L HEPES、pH 7.07)。
    3. イメージング中に細胞を維持するためのTyrode緩衝液を調製します(145 mmol/L NaCl、3 mmol/L KCl、10 mmol/L HEPES、10 mmol/L Glucose、pH 7.4)。
    4. 35 mmの培養皿にDMEM培養培地を投入し、温度37°C、雰囲気5% CO2/95%空気のインキュベーターでHela細胞を培養します。皿ごとに2〜3枚のカバースリップを追加して、細胞が成長できるようにします。
    5. リン酸カルシウム沈殿法によりHela細胞をトランスフェクションします。
      1. 細胞をトランスフェクションするには、まず古い培地を2 mLの無血清DMEMに交換します。35分後、10 μgのDNA、4 μLのCaCl2、およびddH2Oを微量遠心チューブ内で最終容量40 μLに混合して、DNA/Ca2+溶液を調製します。
      2. 40 μLの2x HEBSをDNA/Ca2+ 溶液に滴下しながら、激しく攪拌します。ピペットで混合物に空気を泡立てて、リン酸カルシウムの沈殿を促進します。
      3. 25分後、この沈殿液80μLを細胞と一緒に皿に加え、さらに1〜2時間インキュベーターに戻します。次に、非血清DMEMを取り出し、15%グリセロール(PBSに溶解)で細胞を2分間すすぎます。

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結果

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CMV-MPI-1プラスミドを構築した後、ミトコンドリアを標的とするその能力を、染色用のミトコンドリアマーカーRhodamine 800を使用してHela細胞でテストしました。共局在実験では、MPI-1の蛍光シグナルとローダミン800からのシグナルとの間には高い重なりが見られ、MPI-1がミトコンドリアに首尾よく局在していることが示されました(図3)。

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図3:Hela細胞におけるMPI-1とミトコンドリアの共局在。 CMV-MPI-1をHela細胞にトランスフェクションし、ミトコンドリア膜電位感受性色素であるローダミン800で染色しました。スケールバー:5μmこの

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ディスカッション

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ミトコンドリア膜の電圧は、休止条件下では-120-180mVに維持され、代謝状態の変化に伴って変動します。現在、ミトコンドリア膜電位の測定は、電気生理学的方法や蛍光色素法を用いて行うことができます。ミトコンドリアパッチのクランプには、ミトコンドリアの単離と細胞構造の破壊が必要です13。このアプローチでは、生理学的条件から逸脱した測定につながる可能性があります。蛍光プローブ法は、MMP測定の一般的なアプローチです。しかし、これらの蛍光分子は特定の細胞を染色することができず、消光しやすく、一部の色素は有毒です。さらに、これらの色素は、細胞特異性や長時間スケール(~30分)での平衡性の欠如など、固有の制限があるため、 in vivo アプリケーションには適していません。

このプロトコルは、特に in vivoでMMPをモニタリングする新しい方法を提供します。この方法の鍵は、ミトコンドリアのN末端をミトコンドリアのターゲティングシグナルに融...

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開示事項

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著者は何も開示していません。

謝辞

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中国国家自然科学基金会(NSF)のJSK(32071137および92054103)の支援と、鄭州大学第一付属病院の科学研究イノベーションチームへの資金提供(ZYCXTD2023014)に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BamHIThermoFD0054
塩化カルシウムΣC4901
CCCP SigmaC2759
遠心分離機eppendorf5430R
遠心分離機(細胞培養)eppendorf5810R
CO2 cell incubatorESCO170L IR Sensor
CoverslipsGlaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co.KG92100100030
Dental adhensive resin cementSun医療会社(株)スーパーボンドC&Bキット
D-グルコースΣG7021
DNAライゲーションキット Ver.2.1タカラ6022
ダルベッコ改型イーグルミディアムギブコ11965092
電動ドリル RWD Instruments78001
ウシ胎児血清GibcoA5670701
光ファイバーカニューレRWD InstrumentsR-FOC-L200C-39NA
ファイバー測光検出器ThinkerQAXK_FPS-TC-MC-LED
蛍光顕微鏡 オリンパス IX83
ガラスピペット(注射用)ドラモンドサイエンティフィック社3.5インチ ドラモンド#3-000-203-G / X
HEK293tATCCCat#CRL-3216
Hela細胞ATCCキャット#CCL-2
HEPESシグマH3375
インジェクションポンプドラモンドサイエンティフィック社3-000-207
イソフルランRWD機器R510-22
レーザー走査型共焦点顕微鏡ZeissLSM980
MluIThermoFD0564
NheIThermoFD0974
光ファイバーRWD機器R-FC-L-N3-200-L1
パラフィンオイルサンゴンB500301
PCRサーマルサイクラーanalytik イェナバイオメトラトーン 96G
ペントバルビタール ナトリウムシノファーム 化学試薬 Co.LTD57-33-0
塩化カリウムシグマP5405
PrimeSTAR HS DNA ポリメラーゼタカラR010A
プログラム可能なマイクロピペット プーラーサッター機器P2000
クイック自己硬化型アクリル樹脂 YamahachiV-PINK Real-time
PCR  Thermal Cycleranalytik jenaqTOWER³ auto
Rhodamine 800Sigma83701
SalIThermoFD0644
塩化ナトリウムΣS9888
リン酸二塩基性ナトリウムΣ9763
脳定位固定装置RWDインスツルメンツE06354
医眼科軟膏PuralubeNA
XhoIThermoFD0694
獣

参考文献

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  1. Vyas, S., Zaganjor, E., Haigis, M. C. Mitochondria and cancer. Cell. 166 (3), 555-566 (2016).
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