細菌性病原体 Clostridioides difficile のバイオフィルムと、疾患におけるそれらの重要性はよく理解されていません。最近の知見では、再発における役割が示唆されており、その重要性が強調されている。ここでは、バイオフィルムに対する創薬のためのアプリケーションと代謝リードアウトを組み合わせたバイオフィルムアッセイの適応について説明します。
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方法論記事
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細菌性病原体 Clostridioides difficile のバイオフィルムと、疾患におけるそれらの重要性はよく理解されていません。最近の知見では、再発における役割が示唆されており、その重要性が強調されている。ここでは、バイオフィルムに対する創薬のためのアプリケーションと代謝リードアウトを組み合わせたバイオフィルムアッセイの適応について説明します。
クロストリジオイデス・ディフィシル は、腸管内細菌叢の環境を利用して増殖し、毒素を分泌し、腸上皮に損傷を与えることができる胃腸細菌病原体です。 C. ディフィシル 感染症 (CDI) 患者のサブセットは、抗生物質 (15%-30%) または糞便微生物叢移植 (FMT) (<10%) の治療失敗を経験します。したがって、追加の治療的介入の開発は非常に重要です。 再発におけるC.ディフィシル バイオフィルムの役割は不明です。しかし、他の生物のバイオフィルムは慢性疾患や再発性疾患の原因であり、これは再発性CDIにも当てはまる可能性があることを示唆しています。 我々は、C. difficile のバイオフィルムが貴重な治療標的であると仮定しています。ここで紹介するプロトコールの目標は、確立された C.ディフィシル バイオフィルムに対して活性を持つ再配置可能な化合物を同定するためのバイオフィルム形成アッセイを適応させることです。このプロトコルは、バイオフィルムを形成するための堅牢で再現性のあるアッセイを改良し、それを代謝アッセイに結合し、創薬に適用します。このプロトコルでは、バイオフィルム形成アッセイ、バイオマスおよび代謝活性の読み出し、薬物感受性試験、リポジショニングライブラリーの薬物スクリーニング、および代表的な結果について概説しています。
クロストリジオイデス・ディフィシルは、毒素を産生することによりヒトの胃腸(GI)管に深刻な損傷を与えることができる胞子形成性の嫌気性細菌性病原体です。C. difficile は、年間約 50 万人の症例に関与しており、~30,000 人が死亡しています (CDC, 2015)。C. ディフィシル感染症 (CDI) の治療は、すでに逼迫している医療制度 (~48 億ドル) に多大なコストを追加します1,2,3。最もリスクが高いのは、免疫抑制、抗生物質への曝露、および/または高齢者であり、すべての人口は米国および世界中で大幅に拡大し続けています4,5,6,7。
C.ディフィシルは、宿主の消化管微生物叢の状態に大きく依存するため、抗生物質治療はCDIの主要な素因です。C.ディフィシルの抗....
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1. バイオフィルムアッセイのための細胞調製
注意: クロストリジオイデス・ディフィシル はヒトの病原体であり、BSL-2の封じ込めが必要です。
注:この研究に使用された胞子は、タフツ大学医学部のキャロル・クマモト博士から入手しました。C. difficile胞子ストックは、前述の43,44,45と同様に調製した。その後、胞子を10 μLの容量としてPCRチューブに分注し、プレートをストリーキングします。実験に必要なすべての培地とリン酸緩衝生理食塩水(PBS)は、使用の24時間前に嫌気性チャンバーで事前に還元する必要があります。これは、チャンバー内のメディアまたはPBSを含むボトルのキャップを緩めることによって達成されます。
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上記のプロトコルの目的は、 C. difficileの確立されたバイオフィルムに対して活性を持つ再配置可能な化合物を同定するための薬物スクリーニングプラットフォームとして、96ウェルプレートバイオフィルム形成モデルを適応させ、検証することです。異なる細胞密度(104、105、106、および107 細胞/mL)がバイオフィルム形成に及ぼす影響を決定し、バイオフィルム形成を前述の48と同様にクリスタルバイオレット染色によって定量した。これらの研究の結果は、 C. difficile 630 Δerm (実験室適応株)によるバイオフィルム形成が、すべての開始細胞密度間で同等であったことを示唆しています。これらの研究には、1 x 107 細胞/mLの細胞密度を選択しました。
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C. difficile バイオフィルムの形成とそれが疾患で果たす役割はよくわかっていません。最近の発見は、疾患の再発におけるバイオフィルムの役割を示唆しています28,34。バイオフィルムの形成は重要な病原性因子であり、黄色ブドウ球菌や緑膿菌によって引き起こされるものなどの細菌感染症では、バイオフィルムは再発と慢性症状の鍵であり26,27、これがCDIにも当てはまる可能性があることを示唆しています。したがって、C. diff.......
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著者には開示すべき対立はありません。
J.A.R.が研究とプロトコールをデザインし、原稿を書きました。A.S.とP.Z.が実験を行い、プロトコルの改良に貢献しました。この研究は、テキサス大学サンアントニオ校(UTSA)からJARへのスタートアップ資金によって支援され、A.S.はUTSA MARCプログラム(T34GM145507)によって支援されました。著者は、Global Health Priority Boxライブラリを提供してくれたMedicines for Malaria Venture(MMV、スイス)に感謝します。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 酢酸 SAF-CT ACS 500ML | フィッシャーサイエンティフィ | A38S500 | |
| 寒天細菌学 GR 1KG | フィッシャーサイエンティフィック | AC443570010 | |
| BioTek Synergy H1 プレートリーダー | フィッシャーサイエンティ | BTH1MG | |
| ボトル酵母エキス 500G | フィッシャーサイエンティフィ | DF0127179 | |
| 脳心臓注入ブロス | フィッシャーサイエンティフィック | CM1135R | |
| クリスタルバイオレット USP グレード 100G | VWR | 97061-850 | バイオマスアッセイ用バイオフィルム染色用 |
| CytoOne 96 ウェル TC プレート、平底、透明、個人包装、蓋付き、50/ケース | USA Scientific | CC7682-7596 | |
| D-(+)-グルコース、無水 | フィッシャーサイエンティフィ | 50712744 | |
| 分子生物学用ジメチルスルホキシド (DMSO) | ミリポアシグマ | D8418-250ML | |
| フィダキソマイシン 250MG | フィッシャー サイエンティフィック | AC468312500 | |
| L-システイン 98+% 1KG | フィッシャー サイエンティフィ | AAA104350B | C. ディフィシル メディア用 |
| メタノール 99.8 アクロソール 1LT | フィッシャー サイエンティフィ | AC364390010 | |
| メトロニダゾール、99% 5GR | フィッシャー サイエンティフィック | AC210340050 | |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS) 10X | Fisher Scientific | BP3991 | |
| PrestoBlue Cell Viability Reagent | Fisher Scientific | A13262 | |
| SILVERSEAL OPAQUE ADHES 100/CS | Fisher Scientific | 7000379 | 保存前に母と娘の薬剤プレートを密封するために使用されます |
| タウロコール酸ナトリウム 100MG | VWR | 100291-598 | |
| バンコマイシン | フィッシャー科学 | BP29581 |
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