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方法論記事

Clostridioides difficileのバイオフィルムアッセイと創薬への応用

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DOI:

10.3791/67913

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2025年7月8日

 ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology and The South Texas Center for Emerging Infectious Diseases (STCEID), The University of Texas at San Antonio

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

細菌性病原体 Clostridioides difficile のバイオフィルムと、疾患におけるそれらの重要性はよく理解されていません。最近の知見では、再発における役割が示唆されており、その重要性が強調されている。ここでは、バイオフィルムに対する創薬のためのアプリケーションと代謝リードアウトを組み合わせたバイオフィルムアッセイの適応について説明します。

要約

クロストリジオイデス・ディフィシル は、腸管内細菌叢の環境を利用して増殖し、毒素を分泌し、腸上皮に損傷を与えることができる胃腸細菌病原体です。 C. ディフィシル 感染症 (CDI) 患者のサブセットは、抗生物質 (15%-30%) または糞便微生物叢移植 (FMT) (<10%) の治療失敗を経験します。したがって、追加の治療的介入の開発は非常に重要です。 再発におけるC.ディフィシル バイオフィルムの役割は不明です。しかし、他の生物のバイオフィルムは慢性疾患や再発性疾患の原因であり、これは再発性CDIにも当てはまる可能性があることを示唆しています。 我々は、C. difficile のバイオフィルムが貴重な治療標的であると仮定しています。ここで紹介するプロトコールの目標は、確立された C.ディフィシル バイオフィルムに対して活性を持つ再配置可能な化合物を同定するためのバイオフィルム形成アッセイを適応させることです。このプロトコルは、バイオフィルムを形成するための堅牢で再現性のあるアッセイを改良し、それを代謝アッセイに結合し、創薬に適用します。このプロトコルでは、バイオフィルム形成アッセイ、バイオマスおよび代謝活性の読み出し、薬物感受性試験、リポジショニングライブラリーの薬物スクリーニング、および代表的な結果について概説しています。

概要

クロストリジオイデス・ディフィシルは、毒素を産生することによりヒトの胃腸(GI)管に深刻な損傷を与えることができる胞子形成性の嫌気性細菌性病原体です。C. difficile は、年間約 50 万人の症例に関与しており、~30,000 人が死亡しています (CDC, 2015)。C. ディフィシル感染症 (CDI) の治療は、すでに逼迫している医療制度 (~48 億ドル) に多大なコストを追加します1,2,3。最もリスクが高いのは、免疫抑制、抗生物質への曝露、および/または高齢者であり、すべての人口は米国および世界中で大幅に拡大し続けています4,5,6,7。

C.ディフィシルは、宿主の消化管微生物叢の状態に大きく依存するため、抗生物質治療はCDIの主要な素因です。C.ディフィシルの抗生物質耐性臨床分離株の同定は、治療をさらに複雑にします8,9,10。さらに、CDI の抗生物質で治療された患者の 15% から 30% は、初期治療に失敗します 5,11,12,13,14,15,16。患者が再発エピソードを経験すると、再発エピソードの可能性は45%〜64%(再発エスカレーター)に増加し(再発エスカレーター)、さらなる治療失敗のリスクの増加を伴います16,17。重要なことに、CDIのほとんどの再発例は、宿主18,19の感染の最初のエピソードを確立した元の株によって引き起こされ、治療が成功した後でもC.ディフィシルによるコロニー形成が継続することを示唆しています。胞子は消化管に持続し、ex vivoおよびマウスモデル20で再発につながることが示されていますが、C.ディフィシルバイオフィルムと疾患および再発におけるそれらの役割は十分に調査されていません。バイオフィルムは、自己生成した細胞外マトリックスによって保護された微生物群集であり、その特性により、抗生物質治療や免疫応答などの環境破壊に対して非常に抵抗性がある21。さらに、バイオフィルム形成は重要な病原性因子であり、黄色ブドウ球菌や緑膿菌によって引き起こされるものなどの細菌感染症では、バイオフィルムは再発および慢性症状の鍵となります26,27。最近、C.ディフィシルバイオフィルムは、再発性感染症28,29,30の貯蔵庫として提案されており、したがって、CDI再発の治療および/または予防のための価値の高い標的を表しています。

C. difficileのバイオフィルムを研究するための現在のモデルには、コロニーバイオフィルムモデル31,32、マイクロ発酵槽33、ケモスタット腸モデル34,35、およびフラスコまたはウェルプレートを使用した液体培養システム36,37が含まれる。これらすべてのモデルは、C. difficile バイオフィルムに関する重要な情報を、異なる開発段階および異なる環境においてもたらしました。ただし、これらのモデルの一部(すなわち、マイクロ発酵槽、ケモスタット腸モデル、コロニーバイオフィルム)は、創薬の取り組みに適していません。今日まで、創薬活動を含むほとんどの研究は、C.ディフィシル38,39,40,41のプランクトン生活様式に焦点を当ててきました。したがって、ここで説明するプロトコルは、既存の96ウェルプレートバイオフィルムモデルを適応、標準化、および検証することを目的としており、確立された(24時間前の)C.ディフィシルバイオフィルムを殺す能力を持つ再配置可能な分子をスクリーニングするためのライブラリのプラットフォームを開発することを目的としています。プロトコールの検証は、実験室に適応した株(630 Δerm)と流行性の臨床分離株(2006年に英国のストーク・マンデビル病院でアウトブレイク中に分離されたUK1株)との間のバイオフィルム形成能力を比較することによって行われた42。バイオフィルムの形成は、バイオマスを測定するための古典的なクリスタルバイオレットアッセイと、バイオフィルムの生存率を測定するための代謝アッセイを使用して定量化されました。菌株間のバイオフィルム形成能力の有意差が特定され、潜在的な臨床的意味が示唆されました。さらに、このアッセイは、確立されたバイオフィルムの抗生物質感受性プロファイルを決定するために利用されました。最後に、概念実証として、マラリアなどの顧みられない疾患に対する新しい治療法の発見に焦点を当てた非営利団体であるMedicines for Malaria Venture(MMV)のGlobal Health Priorityボックスをスクリーニングし、C.ディフィシルの確立されたバイオフィルムに対して活性を持つ化合物を特定しました。ここで説明するプロトコルは、成熟したバイオフィルムを標的とする薬物スクリーニングプラットフォームとして使用するための古典的なバイオフィルムアッセイを適応させ、検証します。

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プロトコル

1. バイオフィルムアッセイのための細胞調製

注意: クロストリジオイデス・ディフィシル はヒトの病原体であり、BSL-2の封じ込めが必要です。

注:この研究に使用された胞子は、タフツ大学医学部のキャロル・クマモト博士から入手しました。C. difficile胞子ストックは、前述の43,44,45と同様に調製した。その後、胞子を10 μLの容量としてPCRチューブに分注し、プレートをストリーキングします。実験に必要なすべての培地とリン酸緩衝生理食塩水(PBS)は、使用の24時間前に嫌気性チャンバーで事前に還元する必要があります。これは、チャンバー内のメディアまたはPBSを含むボトルのキャップを緩めることによって達成されます。

  1. 嫌気性チャンバー内で0.1%(w / v)タウロコール酸と0.1%(w / v)L-システイン(BHIS)を補充したBrain Heart Infusion寒天培地を、できれば一晩または少なくとも3時間、完全に減少させるために事前に減らします。.嫌気性チャンバーの温度を37°Cに設定します。
  2. 10 μLの胞子を含むPCRチューブを70°Cで20分間加熱します。 これは、ウォーターバスまたはサーモサイクラーで行うことができます。
  3. 胞子を嫌気性チャンバーに持ち込み、5x-6xを穏やかにピペッティングして混合し、事前に還元されたBHISプレートで10μLをピペットします。前述の46のように4象限ストリークを行い、プレートを37°C(嫌気性チャンバーの温度)で一晩インキュベートする。
  4. 成長の24時間後、分離されたコロニーが見えるはずです。1つのコロニーを選択し、使い捨てループを使用して、10 mLのBHIS液体が入ったチューブに移します。一晩(14-18時間)インキュベートします。
  5. チャンバー内で一晩培養液を連続希釈することにより、細胞密度を決定します。
    1. 一晩培養の10倍希釈を行います。103 希釈により、このプロトコルで使用される各菌株の可算サンプルが得られます。ただし、このステップの標準化は、成長差のある臨床分離株に必要になる場合があります。
    2. チューブを嫌気性チャンバーから取り出し、各サンプルを10μLを血球計算盤に入れ、血球計算盤の製造元が説明している明視野顕微鏡を使用してカウントします。
    3. メーカーの指示に従って、カウント後の細胞濃度を測定してください。

2.バイオフィルム形成

注:このプロトコルは、異なるウェルサイズに適応できますが、96ウェルプラットフォーム用に最適化されています。ウェルサイズを変更する場合は、ウェルの表面積に基づいて細胞濃度を調整する必要があります。

  1. 一晩培養して細胞濃度を決定した後、BHISで細胞濃度を1 x 107 細胞/mLに調整します(10%(w/v)L-システインと0.1Mグルコースを補充)。
    注:0.1Mグルコースの補給は、以前にC.ディフィシル630Δerm株47によるバイオフィルム形成を増加させることが示されている。このプロトコルでは、異なる開始濃度をテストした後、1 x 107細胞/mLの濃度を選択しました(図1)。グルコースを補給しなくても、強固なバイオフィルム形成を達成することができます。
  2. 100 μLの細胞を96ウェルマイクロタイタープレート(平底および組織培養処理済み)のウェルに分注し、コントロール(細胞のみ)およびブランク(培地のみ)のカラムを残します。嫌気性チャンバー(37°C)で24時間インキュベートします。
    1. 媒体の蒸発が問題になる場合は、バイオフィルムプレートを加熱ユニットから離して配置します。あるいは、バイオフィルムを追加の容器に入れるか、透過性の96ウェルプレートメンブレンで覆います。
  3. すべてのウェルから、ブランクからメディアを静かに取り出します。これにより、非接着性細胞が除去され、バイオフィルムが残ります。バイオフィルム内の細胞のみが対象であるため、このステップは非常に重要です。
  4. バイオフィルムを200μLの還元済みPBSで2回優しく洗浄します。この洗浄を穏やかに行うには、96ウェルプレートを少し傾け、ピペットチップをウェルの壁に挿入し、底をこすらずにチップをウェルの底に近づけてスライドさせ、ゆっくりと吸引します。PBSが下部に残っている場合は、プロセスを再度繰り返します。この段階では、非接着性細胞を除去でき、正常です。プレートを嫌気性チャンバーから取り出す前に、PBSを取り外してください。
  5. この時点で、バイオフィルムを次の目的で使用します:バイオマス測定(ステップ3を参照)。代謝活動測定(ステップ4を参照)。薬物感受性および薬物スクリーニングアッセイ(ステップ5を参照)。
    注:このプロトコルは、ラボに適合した630 Δerm 株と流行性のUK1株で検証されています。異なる臨床分離株と株は、弱いバイオフィルム形成能力を示す可能性があります。バイオフィルムの乱れを最小限に抑えるには、PBS 1xではなくPBS 1xで洗浄し、洗浄量を100μLに減らします。

3. クリスタルバイオレットアッセイによるバイオフィルムバイオマスの測定

注:クリスタルバイオレット染色は、前述のプロトコル48に基づいていました。

  1. 嫌気性チャンバーでバイオフィルムを洗浄した後(ステップ2.4を参照)、プレートを取り外し、化学ドラフトに移します。
  2. バイオフィルムを固定するには、各ウェルに150μLのメタノールを静かに加えます。プレートを蓋で10分間覆います。
  3. メタノールを取り除き、蓋を外した状態でウェルを完全に乾かします。これには 30 分から 45 分かかります。
  4. 0.3% Crystal violetを100 μLをすべてのウェルに加え、10分間染色します。Crystal violetを慎重に取り除き、ウェルの縁や壁の汚れを防ぐと、読み出しに影響を与える可能性があります。
  5. 蓋を外した状態でプレートを乾かします。これには 30 分から 45 分かかります。
  6. ウェルを200μLの蒸留水で3回洗浄し、プレートを完全に乾かします。これには 30 分から 45 分かかります。
  7. 乾燥したら、明視野顕微鏡を使用してバイオフィルムをイメージングします(図2A)。このステップはオプションですが、バイオフィルム内の細胞をより徹底的に観察することができます。
    1. 96ウェルプレートをプレートアダプター付きの倒立明視野顕微鏡に置きます。テストした各ひずみの代表ウェルを特定します。
    2. 各ウェルの画像を希望の倍率で撮影します。このプロトコルで提示された画像は、40倍の倍率で撮影されました。
  8. 目的の画像を取得したら、プレートを化学ドラフトに戻して除染します。
  9. バイオフィルムを脱染するには、33%酢酸150μLを加え、中速で10分間シェーカーに置きます。
  10. 各ウェルから90μLを取り出し、新しい96ウェル平底プレートに移します。プレートリーダーを使用して595nmで吸光度を読み取ります(図2B)。

4. 代謝染料PrestoBlueを用いたバイオフィルム生存率の測定

  1. 代謝活性の測定は、主要な変更を加えたアッセイの製造元のプロトコルに従って実施します。アッセイ用のバイオフィルムを調製する前に、プレートリーダーを37°Cに温めます。蛍光を測定できるプレートリーダーをお勧めします。
    注:あるいは、代謝活性はOD600で読み取ることができます。しかし、このアプローチがこれらのアッセイに十分な感度を持つとは見なされていません。ユーザーは、製造元のプロトコルを確認し、必要に応じて標準化することをお勧めします。
  2. 上記のように嫌気性チャンバー内でバイオフィルムをPBSで洗浄した後(ステップ2.4を参照)、プレートをチャンバーから取り外します。
  3. プレートとともに、還元前のBHIS9 mL(10%(w / v)L-システインと0.1 Mグルコースを補充)を取り除きます。
  4. Pre-Reduced BHISおよびボルテックス9 mLにPrestoBlue試薬1 mLを素早く加えます。試薬の着色に影響を与える可能性があるため、試薬を事前に減らさないでください(ディスカッションを参照)。
  5. 各ウェルに100 μLのBHIS-PrestoBlue混合物を加えます。プレートを次の設定でプレートリーダーに置きます:温度37°C、アッセイタイプをキネティックとして;読み取り時間は30分です。2分ごとの読み取り頻度。蛍光強度は、利用可能なプレートリーダーのタイプによって異なります。このプロトコルに記載されている測定は、それぞれ560nm/590nmの励起/発光波長を使用して行われました。
  6. 読んだ後、プレートを捨ててください。
  7. プレートの読み出しから蛍光値を取得したら、ブランク(培地のみ)のウェルを使用して、すべてのサンプルウェルからノイズを差し引きます。この後、各化合物で処理したバイオフィルムウェルを未処理(100%)のバイオフィルムを含むコントロールウェルで分けて代謝活性を得る。

5. バイオフィルムへの薬剤の添加

注:以下に説明するセットアップは、薬物感受性アッセイおよび固定濃度薬物スクリーニング用に変更できます。以下で説明する両方の方法において、PrestoBlueアッセイが推奨されます。

  1. 異なる抗生物質の最小阻害濃度(MIC)の測定
    注:バイオフィルムは48時間にわたって取り扱われるため、汚染の可能性が高まります。最初にブランクウェルを処理し、無菌手順に従うことが非常に重要です。他の C.ディフィシル 株および試験用量反応アッセイの文献で報告されたMIC値を使用して、このプロトコルで提示されたMICアッセイの開始抗生物質濃度を通知しました。このアプローチは、臨床分離株を扱う際の開始抗生物質濃度を決定するのに役立ちます。
    1. 上記のように、成熟した(24時間経過した)バイオフィルムを嫌気性チャンバーでPBSで洗浄します(ステップ2.4を参照)。
    2. 200 μLの還元済みBHIS(10%(w/v)L-システインと0.1Mグルコースを添加)培地に、試験用抗生物質の2倍希釈液を含有し、プレート内のコントロール(細胞のみ)カラムとブランク(培地のみ)カラムを除く各ウェルに加えます。
    3. さらに24時間インキュベートします。この研究では、バンコマイシン(開始濃度200 μg/mL)、メトロニダゾール(開始濃度16 μg/mL)、およびフィダキソマイシン(開始濃度4 μg/mL)を使用してアッセイを検証しました。MIC 値は表 1 で報告されます。
    4. プレートの乾燥を防ぐため、アネロビックチャンバー内の加熱ユニットから遠ざけるか、ガス透過性メンブレンを使用してください。
      注:あるいは、事前に還元されたPBSまたは培地モート(300μL)をプレートの外側ウェルに使用することもできます。
    5. 薬物との24時間のインキュベーション後、培地を取り出し、バイオフィルムをPBSで1回穏やかに洗浄します。Crystal violetアッセイまたはPrestoBlueアッセイを使用してバイオフィルムを処理。
  2. 薬物ライブラリーのスクリーニング
    1. 上記のように、成熟した(24時間経過した)バイオフィルムを嫌気性チャンバーでPBSで洗浄します(ステップ2.4を参照)。
    2. プレート内のコントロール(抗生物質を含まない培地中の細胞)およびブランク(抗生物質を含まない培地)カラムを除く各ウェルに、固定濃度の薬物ライブラリー化合物を含む200 μLの培地を加えます。さらに24時間インキュベートします。プレートの乾燥を防ぐため、アネロビックチャンバー内の加熱ユニットに近づけないでください。
    3. 薬物との24時間のインキュベーション後、培地を取り出し、バイオフィルムをPBSで1回穏やかに洗浄します。Crystal violetアッセイまたはメタボリックアッセイを使用してバイオフィルムを加工します。

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結果

上記のプロトコルの目的は、 C. difficileの確立されたバイオフィルムに対して活性を持つ再配置可能な化合物を同定するための薬物スクリーニングプラットフォームとして、96ウェルプレートバイオフィルム形成モデルを適応させ、検証することです。異なる細胞密度(104、105、106、および107 細胞/mL)がバイオフィルム形成に及ぼす影響を決定し、バイオフィルム形成を前述の48と同様にクリスタルバイオレット染色によって定量した。これらの研究の結果は、 C. difficile 630 Δerm (実験室適応株)によるバイオフィルム形成が、すべての開始細胞密度間で同等であったことを示唆しています。これらの研究には、1 x 107 細胞/mLの細胞密度を選択しました。

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ディスカッション

C. difficile バイオフィルムの形成とそれが疾患で果たす役割はよくわかっていません。最近の発見は、疾患の再発におけるバイオフィルムの役割を示唆しています28,34。バイオフィルムの形成は重要な病原性因子であり、黄色ブドウ球菌や緑膿菌によって引き起こされるものなどの細菌感染症では、バイオフィルムは再発と慢性症状の鍵であり26,27、これがCDIにも当てはまる可能性があることを示唆しています。したがって、C. diff...

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開示事項

著者には開示すべき対立はありません。

謝辞

J.A.R.が研究とプロトコールをデザインし、原稿を書きました。A.S.とP.Z.が実験を行い、プロトコルの改良に貢献しました。この研究は、テキサス大学サンアントニオ校(UTSA)からJARへのスタートアップ資金によって支援され、A.S.はUTSA MARCプログラム(T34GM145507)によって支援されました。著者は、Global Health Priority Boxライブラリを提供してくれたMedicines for Malaria Venture(MMV、スイス)に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
酢酸 SAF-CT ACS 500MLフィッシャーサイエンティフィA38S500
寒天細菌学 GR 1KGフィッシャーサイエンティフィックAC443570010
BioTek Synergy H1 プレートリーダーフィッシャーサイエンティBTH1MG
ボトル酵母エキス 500GフィッシャーサイエンティフィDF0127179
脳心臓注入ブロスフィッシャーサイエンティフィックCM1135R
クリスタルバイオレット USP グレード 100GVWR97061-850バイオマスアッセイ用バイオフィルム染色用
CytoOne 96 ウェル TC プレート、平底、透明、個人包装、蓋付き、50/ケースUSA ScientificCC7682-7596
D-(+)-グルコース、無水フィッシャーサイエンティフィ50712744
分子生物学用ジメチルスルホキシド (DMSO)ミリポアシグマD8418-250ML
フィダキソマイシン 250MGフィッシャー サイエンティフィックAC468312500
L-システイン 98+% 1KGフィッシャー サイエンティフィAAA104350BC. ディフィシル メディア用
メタノール 99.8 アクロソール 1LTフィッシャー サイエンティフィAC364390010
メトロニダゾール、99% 5GRフィッシャー サイエンティフィックAC210340050
リン酸緩衝生理食塩水(PBS) 10XFisher ScientificBP3991
PrestoBlue Cell Viability ReagentFisher ScientificA13262
SILVERSEAL OPAQUE ADHES 100/CSFisher Scientific7000379保存前に母と娘の薬剤プレートを密封するために使用されます
タウロコール酸ナトリウム 100MG VWR100291-598
バンコマイシンフィッシャー科学BP29581
ック フィック ック ック ック ック

参考文献

  1. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S88-S92 (2012).
  2. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
  3. Sheitoyan-Pesant, C., et al. Clinical and healthcare burden of multiple recurrences of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 62 (5), 574-580 (2016).
  4. Abou Chakra, C. N., Pepin, J., Sirard, S., Valiquette, L. Risk factors for recurrence, complications and mortality in Clostridium difficile infection: A systematic review. PLoS One. 9 (6), e98400(2014).
  5. Aslam, S., Hamill, R. J., Musher, D. M. Treatment of Clostridium difficile-associated disease: Old therapies and new strategies. Lancet Infect Dis. 5 (9), 549-557 (2005).
  6. Brown, K. A., Khanafer, N., Daneman, N., Fisman, D. N. Meta-analysis of antibiotics and the risk of community-associated Clostridium difficile infection. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2326-2332 (2013).
  7. Dicks, L. M. T., Mikkelsen, L. S., Brandsborg, E., Marcotte, H. Clostridium difficile, the difficult "kloster" fuelled by antibiotics. Curr Microbiol. 76 (6), 774-782 (2019).
  8. Sholeh, M., et al. Antimicrobial resistance in Clostridioides (Clostridium) difficile derived from humans: A systematic review and meta-analysis. Antimicrob Resist Infect Control. 9 (1), 158(2020).
  9. Peng, Z., et al. Update on antimicrobial resistance in Clostridium difficile: Resistance mechanisms and antimicrobial susceptibility testing. J Clin Microbiol. 55 (7), 1998-2008 (2017).
  10. Dilnessa, T., Getaneh, A., Hailu, W., Moges, F., Gelaw, B. Prevalence and antimicrobial resistance pattern of Clostridium difficile among hospitalized diarrheal patients: A systematic review and meta-analysis. PLoS One. 17 (1), e0262597(2022).
  11. Hopkins, R. J., Wilson, R. B. Treatment of recurrent Clostridium difficile colitis: A narrative review. Gastroenterol Rep (Oxf). 6 (1), 21-28 (2018).
  12. Bartlett, J. G. Treatment of antibiotic-associated pseudomembranous colitis. Rev Infect Dis. 6 (Suppl 1), S235-S241 (1984).
  13. Merino, E., Salavert, M. Treatment of Clostridioides difficile infection: From guidelines to clinical practice. Rev Esp Quimioter. 35 (Suppl 3), 97-101 (2022).
  14. Pepin, J., et al. Increasing risk of relapse after treatment of Clostridium difficile colitis in Quebec, Canada. Clin Infect Dis. 40 (11), 1591-1597 (2005).
  15. Cornely, O. A., Miller, M. A., Louie, T. J., Crook, D. W., Gorbach, S. L. Treatment of first recurrence of Clostridium difficile infection: Fidaxomicin versus vancomycin. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S154-S161 (2012).
  16. Mcfarland, L. V., Elmer, G. W., Surawicz, C. M. Breaking the cycle: Treatment strategies for 163 cases of recurrent Clostridium difficile disease. Am J Gastroenterol. 97 (7), 1769-1775 (2002).
  17. Mcfarland, L. V., et al. A randomized placebo-controlled trial of Saccharomyces boulardii in combination with standard antibiotics for Clostridium difficile disease. JAMA. 271 (24), 1913-1918 (1994).
  18. Kamboj, M., et al. Relapse versus reinfection: Surveillance of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 53 (10), 1003-1006 (2011).
  19. Figueroa, I., et al. Relapse versus reinfection: Recurrent Clostridium difficile infection following treatment with fidaxomicin or vancomycin. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S104-S109 (2012).
  20. Castro-Cordova, P., et al. Entry of spores into intestinal epithelial cells contributes to recurrence of Clostridioides difficile infection (vol 12, 1140, 2021). Nat Commu. 13 (1), 2456(2021).
  21. Orazi, G., O'toole, G. A. "It takes a village": Mechanisms underlying antimicrobial recalcitrance of polymicrobial biofilms. J Bacteriol. 202 (1), e00530-e00619 (2019).
  22. Costerton, J. W., et al. Bacterial biofilms in nature and disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
  23. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
  24. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  25. Donlan, R. M. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
  26. Scherr, T. D., Heim, C. E., Morrison, J. M., Kielian, T. Hiding in plain sight: Interplay between Staphylococcal biofilms and host immunity. Front Immunol. 5, 37(2014).
  27. Thomsen, K., et al. Animal models of chronic and recurrent Pseudomonas aeruginosa lung infection: Significance of macrolide treatment. Apmis. 130 (7), 458-476 (2022).
  28. Normington, C., et al. Biofilms harbour Clostridioides difficile, serving as a reservoir for recurrent infection. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 16(2021).
  29. Frost, L. R., Cheng, J. K. J., Unnikrishnan, M. Clostridioides difficile biofilms: A mechanism of persistence in the gut. PLoS Pathog. 17 (3), e1009348(2021).
  30. Meza-Torres, J., Auria, E., Dupuy, B., Tremblay, Y. D. N. Wolf in sheep's clothing: Clostridioides difficile biofilm as a reservoir for recurrent infections. Microorganisms. 9 (9), 1922(2021).
  31. James, G. A., et al. Analysis of Clostridium difficile biofilms: Imaging and antimicrobial treatment. J Antimicrob Chemother. 73 (1), 102-108 (2018).
  32. Brauer, M., et al. What's a biofilm?-how the choice of the biofilm model impacts the protein inventory of Clostridioides difficile. Front Microbiol. 12, 682111(2021).
  33. Poquet, I., et al. Clostridium difficile biofilm: Remodeling metabolism and cell surface to build a sparse and heterogeneously aggregated architecture. Front Microbiol. 9, 2084(2018).
  34. Crowther, G. S., et al. Comparison of planktonic and biofilm-associated communities of Clostridium difficile and indigenous gut microbiota in a triple-stage chemostat gut model. J Antimicrob Chemother. 69 (8), 2137-2147 (2014).
  35. Crowther, G. S., et al. Development and validation of a chemostat gut model to study both planktonic and biofilm modes of growth of Clostridium difficile and human microbiota. PLoS One. 9 (2), e88396(2014).
  36. Dawson, L. F., Valiente, E., Faulds-Pain, A., Donahue, E. H., Wren, B. W. Characterisation of Clostridium difficile biofilm formation, a role for spo0a. PLoS One. 7 (12), e50527(2012).
  37. Dubois, T., et al. A microbiota-generated bile salt induces biofilm formation in Clostridium difficile. NPJ Biofilms Microbiomes. 5 (1), 14(2019).
  38. Abdelkhalek, A., Mohammad, H., Mayhoub, A. S., Seleem, M. N. Screening for potent and selective anticlostridial leads among fda-approved drugs. J Antibiot (Tokyo). 73 (6), 392-409 (2020).
  39. Chen, J., Lu, Y., Du, Y., Wang, H., Wu, Q. Recent development of small-molecular inhibitors against Clostridioides difficile infection. Bioorg Chem. 125, 105843(2022).
  40. Katzianer, D. S., Yano, T., Rubin, H., Zhu, J. A high-throughput small-molecule screen to identify a novel chemical inhibitor of Clostridium difficile. Int J Antimicrob Agents. 44 (1), 69-73 (2014).
  41. Pal, R., Dai, M., Seleem, M. N. High-throughput screening identifies a novel natural product-inspired scaffold capable of inhibiting Clostridioides difficile in vitro. Sci Rep. 11 (1), 10913(2021).
  42. Sun, X., et al. Mouse relapse model of Clostridium difficile infection. Infect Immun. 79 (7), 2856-2864 (2011).
  43. Edwards, A. N., Mcbride, S. M. Isolating and purifying Clostridium difficile spores. Methods Mol Biol. 1476, 117-128 (2016).
  44. Romo, J. A., Kumamoto, C. A. Characterization of the effects of Candida gastrointestinal colonization on Clostridioides difficile infection in a murine model. Methods Mol Biol. 2542, 271-285 (2022).
  45. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. Chapter 9 (Unit9A), 1(2009).
  46. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Plating methods. J Vis Exp. (63), e3064(2012).
  47. Dapa, T., Unnikrishnan, M. Biofilm formation by Clostridium difficile. Gut Microbes. 4 (5), 397-402 (2013).
  48. O'toole, G. A. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis Exp. (47), e2437(2011).
  49. Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J Bacteriol. 195 (3), 545-555 (2013).
  50. Morais, M., et al. Comparative biofilm-forming ability between Clostridioides difficile strains isolated in Latin America and the epidemic nap1/027 strain. Front Cell Infect Microbiol. 12, 1033698(2022).

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