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方法論記事

誘導型FRETバイオセンサーを用いたミトコンドリア関連小胞体膜の閉鎖性検出

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DOI:

10.3791/67914

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2026年8月7日

 ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, MassGeneral Institute for Neurodegenerative Disease, Henry and Allison McCance Center for Brain Health, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School,

この記事について

サマリー

我々は、誘導型FRETバイオセンサーのFRET値を測定する方法を説明し、in vitro でER(CFPタグ付き)またはミトコンドリア(YFPタグ付き)を標的とし、Aβ生成に影響を与えるミトコンドリア関連ER膜(MAMs)のタイトネスを評価する方法を記述し、この方法は合成または天然のMAM調節剤の初期スクリーニングに用いられます。

要約

複数の研究により、ERミトコンドリア接触部、すなわちミトコンドリア関連膜(MAMs)の数、長さ、隙間幅(厚さ)が生物学的役割に影響を与えることが示されています。私たちの以前の研究では、約7nmのギャップ幅を特徴とするタイトなMAMの安定化はアミロイドβ(Aβ)レベルの増加をもたらす一方、約40nmのギャップ幅の緩いMAMの存在はアルツハイマー病(AD)の三次元(3D)神経モデルにおいてAβ産生を減少させることを示しました。ギャップ幅の異なるMAMsの効果を調べるために、ERおよびミトコンドリア標的FRET(Förster共鳴エネルギー伝達)バイオセンサーであるER-CFP(シアン蛍光タンパク質)とMito-YFP(黄色蛍光タンパク質)が開発され、緩やかまたは非MAMとは対照的にタイトなMAM(<10nm幅)を定量化しました。FRETは、ドナー蛍光団(CFP)と受容蛍光団(YFP)が10nm以内に位置している場合に発生し、このシステムはMAMの近接度を評価するのに適しています。このプロトコルは、スペクトル比率FRETを用いて密なMAM形成の範囲を測定する方法を概説しています。

概要

ミトコンドリア関連小胞体接触(MERC)は、生化学的にミトコンドリア関連ER膜(MAMs)として単離されており、アルツハイマー病(AD)を含む複数の神経変性疾患に関与しています。最近提唱された「MAM仮説」は、MAMがアミロイドβ(Aβ)の生成に中心的な役割を果たし、ADの病原性カスケードを開始すると示唆しています。この連鎖には神経線維絡まり(NFT)、カルシウムの食虫異常、神経炎症の形成が含まれます。MAMは、小胞体および外ミトコンドリア膜(OMM)に存在するコレステロール豊富な脂質ラフト状のマイクロドメインからなり、構造的および機能的多様性に寄与する特定の結合タンパク質によって結ばれています3。ERミトコンドリア接触の安定化は、ERカルシウムシグナル伝達やアポトーシスを含むさまざまな細胞過程に影響を与えます。推定では、ミトコンドリアの5%〜20%が小胞体と物理的接触を形成し、MAMs6を形成しています。複数の研究で、MAM部位におけるERとミトコンドリア間の数、長さ、隙間幅(厚さ)が機能的役割を決定する重要な要因であることが示されています。低温電子顕微鏡およびマウス肝臓のin vivo解析により、肝細胞の代謝状態がMAMs7の厚さ(14nmから20nmの範囲)および長さ(145nmから270nmの範囲)の両方を調節することが示されています。

MAMsはがんや代謝障害を含むさまざまな疾患の潜在的な治療標的としても注目されています。MAMの厚さまたは隙間幅は細胞の生存を調節します。構成的なMAM安定化剤であるMAM 1XおよびMAM 9Xは、それぞれタイト(6 nm ± 1 nm ギャップ幅)と緩いMAM(24 nm ± 3 nm ギャップ幅)を安定化するために設計されており、タイトなMAMの安定化が新しい3D神経培養モデルにおいてAβ生成を劇的に増加させることを示しました。対照的に、緩いMAMの安定化は効果なし8。したがって、タイトなMAMの安定化を緩いMAMに変換することは、アミロイド病理の低下に有益かもしれません。構造的・機能的な複雑さと、MAMの安定化度に関する正確な定量的分析の欠如により、MAMを薬物発見のために標的とするのは困難です。ER結合ミトコンドリアの軸索速度に関する新規のライブ細胞イメージングおよびキモグラフィーに基づく解析により、ミトコンドリアの軸索速度はMAM安定化を定量的に測定する指標として用いられることが示されました。なぜなら、ERとの接触が密接にミトコンドリア軸索速度を自由ミトコンドリア8,9に比べて有意に低下させるからです。hAPP発現のニューロ2A(N2A APP細胞)におけるMAMの誘導安定剤を用い8、MAMギャップ幅を狭めることでAβ生成が線量依存的に増加することを発見しました8。誘導性MAM安定化剤は、CFP(シアン蛍光タンパク質)エピトープ標的ER標的およびYFP(黄色蛍光タンパク質)エピトープ標的ミトコンドリア標的バイオセンサーをコードし、ラパマイシン誘導性FK506ラパマイシン結合(FRB)または12-kDa FK506結合タンパク質(FKBP)ドメインに融合した発現プラスミドです。これらのバイオセンサーはそれぞれER-CFPとMito-YFPと呼ばれました。CFPは、受容蛍光体YFPが>10 nm離れたときにエネルギーを伝達するドナー蛍光色素です。誘導性バイオセンサーを発現する細胞(N2AAPP)はラパマイシン処理8時にAβ生成を増加させ、MAMのタイト化がAβ生成を増加させることを示唆しています。これらの手法は、MAMの小分子モジュレーターのスクリーニングや、最適なタイトなMAMの安定化を達成するために必要な有効濃度のスクリーニングに有益であり、これにより病原性(「Aβ増加」)MAMを治療的(「Aβ低下」)MAMに変換しつつ、ERやミトコンドリアの接触を完全に不安定化させることなく、細胞生存に重要です。

実験モデル
本研究では、APP751(N2AAPP)を一貫的に発現するNeuro2A(N2A)細胞を用いています。これらの細胞は、素朴なN2A細胞と比べて、条件付け培地(CM)に検出可能なAβを放出します。N2A APP細胞は、前述の通り10% FBS、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLのストレプトマイシン、および200 μg/mL G418を補足した2 mM L-グルタミン酸を補足したDMEMで維持されました。

発現プラスミド
発現プラスミドリア標的配列は、哺乳類 のA-キナーゼアンカータンパク質1 のYFP(黄蛍光タンパク質)標的ミトコンドリア標的配列[AKAP1(34-63])および ホスファチルノシトール-3-ホスファターゼ Sac1ホスファターゼ[Sac1(521-587])の自己切断型Tav2A配列(pYFP-AKAP1-Tav2A-Sac1-CFP8)を融合させることで生成されました.Tav2A融合した発現プラスミドは、FK506ラパマイシン結合(FRB)ドメイン[EMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPL HAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNV (K 2095P)DLTQAWDLYYHVFRRISKQ]または12-kDa FK506結合タンパク質(FKBP)ドメイン(MGVEKQVIRPGNGPPPGQTVTVHCTGFGKD GDLSQFQFQIGKGAVIKGWDEGVIGMQ IGEVARLRCSSDYAYGAGGFPAWGIQPNSVLDFEIEVLSVQ)ドメイン(MGVEKQVIRPGNGPKPPGPGQDGQ)をコードしています。FRB-YFP-AKAP1(34-63)-Tav2A-Sac1(521-587)-CFP-FKBP(ここではMAM-Tav2Aと表記)は、FRB-YFP-AKAP1(34-63)およびSac1(521-587)-CFP-FKBPの等モル発現レベルを得るために生成され、比率的FRET解析を行いました。Sac1(521-587)-CFP-FKBP(ER-CFPと表記)はドナーの蛍光色素であり、一方でMito-YFP-FRBはMito-YFPと表記され、約10 nm8分離するとFRETを生成する受容体蛍光色素です。したがって、FRTベースのバイオセンサーは狭いMAM(6〜10nm、ギャップ幅)を検出します。FRBおよびFKBPは、ラパマイシン添加時にMAMギャップ幅が線量依存的に狭まることを誘導するために導入され、FRETsignal8の増加を測定することで定量化可能でした。

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プロトコル

本研究で使用される試薬および機器は 材料表に記載されています。

1. トランスフェクション

  1. MAM-Tav2A発現プラスミドを用いたN2AAPP 細胞のトランスフェクト(14-18時間)。
    1. 開始前に、6ウェルプレートの10個×6個のN2Aアプリ細胞をプレートし、ガラスカバースリップを行い、培養培地内で細胞を12〜16時間保持します。
    2. 製造元のプロトコルに従いリポフェクタミントランスフェクション試薬を使用したMAM-Tav2Aプラスミド(補足ファイル1)をトランスフェクト1-3 μgで提供。
    3. 12〜16時間のトランスフェクション後に薬物治療を行います。
      注意:FRET背景として使用するなら、必ずドナー(ER-CFP)または受容体(ミトYFP)のみをコードする発現プラスミドをトランスフェクトしてください。

2. 薬物治療

  1. MAM-Tav2A発現のN2AAPP 細胞はラパマイシン(ラパ)またはラパログ(Log)(3〜6時間)で処理します。
    1. 処理前に、ラパとログのストック溶液(10 mM)を準備します。
    2. 培地は0 nM、100 nM、または250 nMのRapaまたはLogを含む新しいメディアに交換してください。
    3. 3時間の治療後に、細胞を固定するために3.3%のパラホルムアルデヒド(PFA)を加えます。
    4. 蛍光共焦点顕微鏡用にアンチフェード試薬を1滴置いてスライドを準備します。
    5. カバースリップをドロップレットの上に装着し、鉗子で優しく押します。
      注意:ガラスのカバースリップは壊れやすいため注意が必要です。ガラスカバースリップの代わりに、ガラス製の底板を使いましょう。ガラス底板を使用する主な欠点は、アンチフェード試薬を使用できず、蛍光色素の漂白によるイメージングが困難であることです。DAPI(4′,6-ジアミジノ-2-フェニリンドール)を含むアンチフェード試薬は使用しないでください。その青色蛍光はCFPとYFP間のFRETに干渉するためです。

3. 蛍光共鳴エネルギー伝達(FRET)のための共焦点顕微鏡

  1. スライドを逆さま顕微鏡の下に置き、顕微鏡の焦点を調整して細胞が見えるようにします。
  2. 440 nmレーザーで蛍光色分子を励起し、ドナーCFP(FKBP-CFP-ER)では468-503 nmの発光、YFP受容体(FRB-YFP-Mito)では525-565 nmの発光で画像をキャプチャします。
  3. 内蔵蛍光フィルターを使って信号強度を調整し、背景信号が消散するまで(ほぼ黒色になるべきです)。
    注:NIS Element ARソフトウェアを用いて蛍光画像を撮影するために共焦点顕微鏡を使用しました。60倍倍の倍率で512ピクセルの解像度が使用されました。
  4. 画像は.ndsファイルとして保存してください。
  5. スペクトル比率FRET解析を行います。

4. 比率法FRT解析(6 - 12時間)

注:ドナーER-CFP(468-503 nm)および受容体Mito-YFP(525-565 nm)からの蛍光放出は、共焦点顕微鏡を用いて検出されました。ImageJソフトウェアは背景減算後の平均ピクセル蛍光強度を定量化するために使用されました。YFPとCFPの放射強度の比率を計算し、スペクトルFRET解析の読み取りとして使用しました。

  1. Open Image J (フィジー)。
  2. .ndsファイルを画像Jにドラッグするか、ファイル->開いて画像を選択してください。
  3. 次の画面で「 スプリットチャンネル」 ボックスを選択してください。
  4. C = 0のパネルをクリックしてください。
  5. 「 分析 」をクリックして「 測定>」をクリックしてください。
    注意:後で計算するために平均値を書き留めてください。
  6. プロセスをクリックしてください -> 数学 -> 引き算。
  7. ここで平均値の登場です。
  8. C=1パネルでもステップ4を繰り返します。
  9. フリーハンド選択ツールをクリックしてください。
  10. 興味のあるセルに丸をつけてから、 Ctrl+T を押してROIに記録します。
  11. ROIの下部にある「 すべて表示 」をクリックすると、すでに選択した項目が表示されます。
  12. 選択したすべてのセルを選択して「 測定」をクリックし、「これらの値をExcelに記録してください」
  13. C = 1パネルをクリックし、「すべて表示」をクリックしてください。
  14. すべてのセルを選択して再度 「測定」をクリックし 、 これらの値をExcelの別の列に記録してください。
  15. Excelで、ドナー信号の値を受信側(C0/C1)に割り当てる関数を作成します。これがFRET比率です。

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結果

FACS富集N2AAPP 細胞でMAM-Tav2Aを発現した比率計測FRET解析では、ラパマイシン治療後にAβ40レベルが用量依存的に増加することが示されました。ラパマイシンは哺乳類の標的であるラパマイシン(mTOR)シグナル伝達経路を阻害することで作用し、これによりミクログリア内のTREM2(骨髄細胞に発現するトリガー受容体2)の発現をダウンレギュレートし、5XFADのアルツハイマー病マウスモデルにおけるAβプラーククリアランスが低下します。ラパマイシン類似体AP21967、一般にラパログ(Log)と呼ばれるものは、mTORへの親和性が低いため、細胞に対して比較的無毒です。しかし、FRBドメイン12に代償的空洞形成変異(K2095P)が導入されたため、ラパマイシンと同じ親和性でFRBドメインに結合する能力は保持しています。

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ディスカッション

MAMsの調節は、がん、代謝障害、神経変性疾患など様々な疾患に対する潜在的な示唆を持つ新興の研究分野です。ダイニン受容薬LDC-3/ダイナレスチン、抗糖尿病薬メトホルミン、抗がん剤スルフォラファンなど多くの薬理学的薬剤はMAMを破壊し、現在がんおよび代謝障害の前臨床および臨床試験が進行中です。これらの薬理学的薬剤は、PTPIP51、VAPB、VDAC1、PACS2、MFN2、VDAC1、IP3R3 14,15,16,17,18,19,20などのMAMテザーリングタンパク質間の相互作用を調節することで、ERミトコンドリア接触またはMAM接触幅を調節します。

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謝辞

マサチューセッツ総合病院(MGH)のルドルフ・E・タンジ教授に、原稿に関する洞察に満ちたコメントを心より感謝いたします。MIHの助教授である前坂正人博士に、FLIMアッセイの専門知識を共有していただき、感謝いたします。フィラデルフィアのトーマス・ジェファーソン大学教授、ジョルギー・ハイノツキー博士にER-CFPまたはミトYFPをコードする発現プラスミドを寛大に提供していただき、感謝申し上げます。この研究は、キュア・アルツハイマー基金の支援を受けてRBに提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BSAフィッシャーサイエンティフィック501781532
共焦点顕微鏡 オリンパス FV3000RS (東京、日本)N/A
GlutaMAX補充剤付きDMEMジブコ/Thermo Fisher Scientific10564011
EDTA  ライフテクノロジーズ41116134
ファルコン6ウェルプレート VWRインターナショナル41122107
GAPDHポリクローナル抗体Thermo Fisher ScientificPA1-988
ゼラチン VWRインターナショナル9000-70-8
ジェネティック（G418硫酸塩）ジブコ/Thermo Fisher Scientific10131035
GFPモノクローナル抗体InvitrogenMA5-15256
Graphpad Prism N/APrism 9、バージョン9.5.0N/A
ヘパリンSigma-Aldrich H0200000
ImageJソフトウェア ImageJ 1.53aN/A
倒立型共焦点顕微鏡 日立（C2 Eclipse Ti2）N/A
Lipofectamine2000Invitrogen11668027
MS Excel  Microsoft Excel、バージョン2302N/A
NaCl  フィッシャーサイエンティフィック7647145
NuPAGE 4–12% Bis-Trisゲル  InvitrogenNP0321BOX
ペニシリン/ストレプトマイシン/アンホテリシンB ロザ 17-745E
フォトショップAdobe Photoshop CC 20.0.10 N/A
Tris-HCL、pH 7.6  ボストンバイオプロダクツ42000000
トリトンX-100  Sigma-AldrichT8787
トリプシン-EDTAジブコ/Thermo Fisher Scientific25200056
Tween 20フィッシャーサイエンティフィック501657287

参考文献

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