ここでは、腎皮質からヒト腎尿細管上皮細胞(HRTEC)の初代培養物を取得し、細胞外マトリックス(3D-HRTEC)上で単層および三次元培養を開発するためのプロトコルについて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
ヒト腎尿細管上皮細胞(HRTEC)初代培養物は、アルゼンチン、ブエノスアイレスの小児腎臓病ユニットが示した腎摘出術を受ける小児患者から摘出された腎臓から単離されます。肉眼的には、正常な腎皮質を腎髄質から解剖し、断片に切断します。次に、皮質断片を0.1%コラゲナーゼ1型を添加したハンク溶液で消化し、70μmの細孔サイズのメッシュでろ過して、腎尿細管を糸球体から分離します。腎尿細管は、コラゲナーゼによる2回目の消化を受けて上皮細胞を分離します。最後に、酵素消化を停止し、上皮細胞をRPMI 1640を含むフラスコで増殖させ、5%CO2未満のサプリメントを37°Cでコンフルエントするまで増殖させます。HRTEC細胞は、96ウェルプレート上で単層として増殖させたり、ガラスカバースリップを24ウェルプレートにしたり、コラーゲンでコーティングした細胞培養ホルダーとして増殖させることができます。また、基底膜(BM)マトリックス上に播種したHRTEC細胞から、三次元ヒト尿細管上皮細胞(3D-HRTEC)培養物が得られます。細胞の凝集と管状構造の形成がモニターされます。私たちは長年にわたりHRTEC初代培養法を用いて、滋賀毒素が小児腎臓に引き起こす細胞毒性作用を研究してきました。これは、溶血性尿毒症症候群(HUS)を引き起こす病態生理学的変化につながります。HRTECと3D-HRTECの両方の培養物を使用して、さまざまな毒素、合成薬物、生物学的因子、ホルモンなど、特にヒト腎近位尿細管上皮への影響を評価することができます。
概要
私たちのグループでは、単層および三次元条件(3D-HRTEC)で開発されたヒト腎尿細管上皮細胞(HRTEC)の初代培養物を用いて、志賀毒素産生 大腸菌 (STEC)の胃腸感染後に引き起こされる志賀毒素2型(Stx2)の細胞毒性作用を小児腎臓で研究しました。
Stx1 および Stx2 (Stxs) は、下痢後溶血性尿毒症症候群 (HUS) 1 を引き起こす可能性のある STEC の主要な病原性因子です。HUSは、STECに感染した小児の約5〜10%が罹患する全身性合併症で、溶血性貧血、血小板減少症、小児急性腎障害(AKI)からなり、支持療法が必要です2。アルゼンチンでは、STEC-HUSは5歳未満の小児10万人当たり年間6.52例(世界最高)の風土病であり、急性腎障害の主な原因の1つとなっています3。死亡率は4%未満ですが3、患者の約50%が腎臓の後遺症を発症し、これはわが国で腎臓移植の2番目に頻繁な原因を構成しています4,5。
Stx2は、内在化してその細胞傷害作用を発揮する前に、標的臓器の細胞表面に発現する糖脂質グロボトリアオシルセラミド(Gb3)受容体に特異的に結合します6。腎臓は、腎上皮細胞および内皮細胞7,8に生物学的に活性なGb3受容体を大量に発現するStx感受性細胞の存在により、Stxsによって損傷を受ける主要な器官である。
HRTECで単分子膜として培養した以前の研究では、Stx2がタンパク質合成を阻害し、細胞生存率と細胞増殖を低下させ、アポトーシスと壊死を誘導することが示されました9,10,11,12。さらに、3D-HRTECのStx2への曝露は、細胞遊走および腎近位尿細管12,13の特徴を有する尿細管構造の発達を阻害した。
HRTECおよび3D-HRTEC培養物の初代培養物は、細胞周期14のS期における細胞のDNAへの5-ブロモ-2-デオキシウリジン(BrdU)の取り込みを測定することにより、細胞増殖に対するエストラジオールの影響を評価するためにも使用された。
上皮細胞を単離するために、泌尿器科疾患の矯正のために示された小児腎摘出術から得られた腎断片から始めます。
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プロトコル
Hospital General de Niños Pedro de Elizaldeの倫理委員会は、研究目的の初代細胞培養の開発にヒト腎臓組織を使用することを承認しました。研究のための腎臓サンプルの使用については、子供に代わって近親者または保護者からの書面によるインフォームドコンセントが得られました。
注:ヒト腎尿細管上皮細胞(HRTEC)の初代培養物は、アルゼンチンのブエノスアイレスにあるHospital General de Pediatría Pedro de Elizaldeで腎切除術を受けている小児患者に由来し、泌尿器科疾患の矯正または腫瘍切除に適応されます。
1. ヒト腎尿細管上皮細胞(HRTEC)の初代培養法の開発
注:皮質腎断片は、病院で腎摘出術を受けている小児患者から摘出された腎臓から解剖されます。HRTECの一次培養は、前述した方法に従って行われる11。
このプロトコルについては、次の手順で説明します。
- 腎臓の断片は、実験室で処理されるまで、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)またはハンクスバランス塩溶液(ハンクス)で冷蔵しておきます。
- 鉗子で腎カプセルを解剖します。.腎皮質を髄質から分離し、約1mmの小さな断片に切ります。
- 消化を行うには、腎臓断片をCa2+ およびMg2+を含まない無菌ハンクス溶液に入れ、0.1%コラゲナーゼI型を補充します。
- 腎断片を振盪しながら37°Cで30分間インキュベートします。
- 消化を停止するには、10% ウシ胎児血清(FBS)を含む PBS を 1 容量加え、4 °C で冷蔵した遠心分離機で 160 × g をそれぞれ 10 分間遠心分離してサンプルを 3 回洗浄します。 各遠心分離で、上清を捨て、ペレットを同じ溶液に再懸濁します。
- 消化産物を70μmの細孔メッシュに通して細管をろ過し、フィルターに残った糸球体を廃棄します。
- ろ過した尿細管を160 × g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットをCa2+ およびMg2+を含まない滅菌ハンクス溶液に再懸濁し、0.2%コラゲナーゼI型を添加します。
- サンプルを振とうしながら37°Cで30分間インキュベートします。
- 消化を止めるには、10%ウシ胎児血清(FBS)を含むPBSを1容量追加します。
- 4°Cで冷蔵した遠心分離機で、160 × gで各10分間遠心分離することにより、サンプルを3回洗浄します。 各遠心分離で、上清を捨て、ペレットを同じ溶液に再懸濁します。
- 最後の遠心分離後、細胞ペレットを5 mLの完全培地(RPMI 1640に5% FBS、L-グルタミン[2 mmol/L]、ペニシリン[100 U/mL]、ストレプトマイシン[100 μg/mL]、および内皮細胞増殖サプリメント[ECGS、1%])に再懸濁します。
- 通気孔付きの蓋が付いた25 cm2 培養フラスコに細胞懸濁液を播種します。
- 細胞を37°Cの湿潤な雰囲気と5%CO2でインキュベートします。
- 翌日、細胞培養液を3回洗浄し、フラスコから液体を捨て、それぞれ5 mLのPBSを加え、5 mLの完全培地をフラスコに加えます。これらの洗浄液は、完全に消化されず、培養フラスコに付着しなかった赤血球や管状の断片を排除します。
- 細胞培養インキュベーターで上皮細胞を37°Cでインキュベートし、単層で増殖させてコンフルエンスさせます。
- 3日ごとに培地を新鮮な完全培地と交換し、倒立顕微鏡で細胞培養を毎日観察します。
2. 3次元HRTEC培養物(3D-HRTEC)の開発
注:このセクションでは、三次元培養(3D-HRTEC)を開発する手順について説明します。3D−HRTEC培養は、前述した方法12に従って行われる。
- Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫のBMマトリックスを使用します。このBMマトリックスは凍結して配送され、この状態では固体のままです。BMマトリックス溶液を、メーカーが指示した4°Cの冷蔵庫の氷浴で一晩解凍します。
- BMマトリックスを配置する前にチップを冷凍庫で冷却し、マルチウェルプレートを氷上に置いて、プロセス中にマトリックスが固まらないようにします。
- 液体BMマトリックス(150 mL / cm2)のアリコートを取り、プレートの各ウェルに入れてウェルの底を覆います。プレートをセルインキュベーター内で37°Cで1時間インキュベートし、BMマトリックスをゲル状態にします。
- 一方、コンフルエントHRTEC初代培養液を分離するには、フラスコから培地を捨て、0.25%トリプシンと0.02%EDTA溶液1mLを加えます。
- 液体をフラスコの表面全体に広げ、細胞培養インキュベーターで37°Cで5分間インキュベートします。
- 倒立顕微鏡で、すべての細胞が剥離していないか観察します。
- 細胞を10 mLの培地またはPBSに再懸濁し、15 mLチューブに通し、160 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
- 上清を捨て、HRTECの初代培養に使用したのと同じサプリメントを含む完全な培養培地に細胞ペレットを再懸濁します。
- ノイバウアーチャンバー内の細胞の数を数えます。
- ウェルあたり4×104細胞/150μLをBMマトリックスに播種します。細胞培養物を37°Cの細胞培養インキュベーターで数日間インキュベートし、湿度の高い雰囲気と5%CO2で培養します。
- 2日ごとに新しい培地と媒体を交換してください。
- 細胞の凝集と管状構造の形成を倒立光学顕微鏡で観察します。
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結果
Confluent HRTEC 初代培養液は、光学顕微鏡下で観察された同様の形態を示しました(図 1)。細胞は、アクアポリン1(AQP1)およびPECAM CD31 9,12,13に対する抗体を使用した以前の出版物に記載されているように、免疫蛍光によって特徴付けられました。免疫蛍光研究では、HRTECの90%以上がAQP1陽性であることが示され、その起源がヒト腎近位尿細管にあることが示されています。また、どの細胞も内皮抗体PECAM CD319に陽性ではありませんでした。
図2に示すように、HRTECは管状構造(尿細管形成)を形成し、これはヒトの腎臓の元の尿細管と類似しています。BMマトリックスへの播種から約4〜10時間後、HRTE...
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ディスカッション
初代培養は、腎摘出術の同日に行う必要があります。HRTEC初代培養物は、細胞の形態形成安定性を保証するために、1〜5継代で使用することができます。5回目の継代後、細胞は形態を変化させ始め、線維芽細胞のような外観または液胞の増加を示し、静止状態になることがあります。
より大きな腎臓断片を使用すると、消化後の細胞溶解によって放出されるDNAが洗浄プロセスを妨げる可能性があります。この場合、大量の消化液と洗浄液を使用することをお勧めします。さらに、0.04%DNase IVも消化溶液に添加することができる6。
HRTECの初代培養物は、以前にAQP1の免疫蛍光法によって特徴付けられ、細胞の90%以上がAQP1に対して陽性であったことを示しており、HRTEC初代培養物が腎近位尿細管起源を有することを示している13。また、どの細胞も内皮抗体PECAM CD31
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開示事項
著者は、利益相反を宣言しません。
謝辞
アルゼンチンのブエノスアイレスにある「Sección de Cirugía Pediátrica, Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde」の小児泌尿器科チームには、腎臓のサンプルを提供していただき、感謝しています。この研究は、ブエノスアイレス大学(UBACYT20020190100072BA)のC.シルバースタインと、全米科学技術研究評議会(CONICET:PUE 0041)のC.イバラとCシルバースタインへの助成金によって支援されました。この作業は、Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED) (Red STEC/SUH Nº 224RT0152を通じて) によって部分的に支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| コラゲナーゼI型 | Sigma Merck、米国ミズーリ州セントルイス | 637958 | |
| 内皮細胞増殖サプリメント | Sigma Merck、米国ミズーリ州セントルイス | E2759 | |
| マトリゲル基底膜マトリックス | BD Biosciences、米国。Sigma Merck、米国ミズーリ州セントルイス | 356234 | |
| 70 & ムー;Mポアメッシュフィルター | BD Bioscience、マサチューセッツ州、米国 | css010070 | |
| L-グルタミンを含むRPMI 1640培地 | Sigma Merck、米国ミズーリ州セントルイス | R8758-500ミリリットル | |
| ハンクスのバランス塩溶液 Ca2+およびMg2+フリー | Gibco Invitrogen、ニューヨーク州、米国 | 14175046 | |
| トリプシン-EDTA溶液 | Sigma Merck、米国ミズーリ州セントルイス | T4049 |
参考文献
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