この記事では、 Proteus mirabilis バイオフィルム専用に設計された拡大顕微鏡技術であるPmbExMの包括的なプロトコルを紹介します。PmbExMは、バイオフィルムサンプルの段階的な酵素処理を利用して、等方性の4.3倍拡大を達成し、これらの固着性微生物群集内の細胞および細胞内構造の空間構成の超解像分析を可能にします。
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この記事について
サマリー
要約
従来の光学顕微鏡を使用して微生物学的サンプルから詳細な視覚情報や定量データにアクセスすることは、回折障壁によって制限されます。分解能を向上させるための1つのソリューションは、サンプルを元のサイズの約4倍に物理的に拡大する革新的で費用対効果の高い超解像技術である拡張顕微鏡(ExM)です。拡張を成功させるためには、生体材料の機械的特性を均質化することが不可欠です。バイオフィルムは細菌群集であり、表面に付着し、それらが生成する細胞外マトリックスに埋め込まれます。ExMプロトコルは、独自の構造コンポーネントに対応するように適合させる必要があります。本稿では、48時間成長したP. mirabilisバイオフィルムの超解像可視化を可能にするExMの特殊な亜種であるProteus mirabilis biofilm ExM(PmbExM)について紹介します。このプロトコルは、理論条件の近くで最適化された連続酵素分解によるサンプルの主要な構造成分の標的分解に焦点を当てています。PmbExMは、多糖類の加水分解のために、α-アミラーゼ、セルラーゼ、リチカーゼグリコシド加水分解酵素などの酵素の組み合わせを利用します。ペプチドグリカン加水分解のためのムタノリシン;タンパク質加水分解のためのプロテイナーゼK。これらの消化手順はゲル化プロセスとは無関係であるため、さまざまなバイオフィルムモデルで特定の均質化要件を満たすための修飾が可能です。この適応性は、さまざまな細菌種や成長条件への適用に大きな可能性を提供します。ExMは、全体的に最適ではない拡張係数を持つさまざまなバイオフィルム種に適用されています。対照的に、PmbExMは、形態やトポロジーの大きな歪みなしに、標準的なアクリルアミド-アクリル酸ExMハイドロゲルの理論上の最大膨張係数を達成します。この研究の目的は、P. mirabilisバイオフィルムの構造、アセンブリ、および細胞内および細胞内の特徴を視覚化するためのアクセス可能な超解像プロトコルを提供することです。
概要
蛍光顕微鏡は、バイオフィルムの構造、組成、および機能を研究するために広く使用されているツールです1。しかし、バイオフィルムの構造的、細胞的、および細胞内的特徴を解明する光学顕微鏡の能力は、回折障壁によって制限されます。拡大顕微鏡法(ExM)は、革新的でアクセスしやすく、使いやすい超解像技術であり、回折限界2,3を超えるバイオフィルム構造を明らかにする大きな可能性を秘めています。ExMは、生体試料を元のサイズの約4倍に等方的に拡大することにより、分解能を向上させます。この方法では、サンプル全体に膨潤性イオン性ヒドロゲルをin-situ重合し、注意して適用した場合に分子標的の相対的な空間配置を維持します4,5。
ExMが適切に機能するためには、生体材料の機械的特性を均質化することが重要なステップ6です。標準的なExMバリアントは、哺乳類の細胞培養および組織に対して開発され、プロテイナーゼKタンパク質分解4,5または界面活性剤およびオートクレーブ7による軟タンパク質変性のみによって効率的に均質化を達成し、等方性の4倍拡大をもたらしました。しかし、細菌や細菌のバイオフィルムの場合、ペプチドグリカンの細胞壁や構造多糖類などのEPSマトリックス要素が拡大に対する障害となります2,3,8,9。
この記事では、高い抗生物質耐性およびカテーテル関連尿路感染症10に関連する臨床的に関連性のあるグラム陰性菌であるP.mirabilisのバイオフィルムを拡大するために設計されたカスタマイズされたExMバリアントであるProteus mirabilis biofilm Expansion Microscopy(PmbExM)の手順について説明します。PmbExMは、ムタノリシン、α-アミラーゼ、セルラーゼ、リチカーゼ、プロテイナーゼKの酵素処理を組み合わせて、ペプチドグリカンの細胞壁、多糖類、タンパク質をそれぞれ加水分解します。その結果、この方法により、48時間齢のP. mirabilisバイオフィルムの4.3倍の等方性拡大が達成されることが示されました。この技術により、P. mirabilisのバイオフィルムの構造、アセンブリ、および細胞内の特徴を二重染色3により超解像で可視化することができます。さらに、PmbExMは、種特異的なバイオフィルム成分を標的とするように酵素処理を調整することにより、他のバイオフィルムモデルに適合させることができます。
この記事の目的は、PmbExMのバイオフィルムサンプルのゲル化、消化、増殖、およびマウントに関連する手順の詳細な説明を提供することです。さらに、この研究では、著者らが使用した細菌の増殖条件、サンプルフォーマット、蛍光染色技術、および画像処理の経験が限られている研究者が簡単に適用できるデータ処理および分析ルーチンについて概説しています。画像処理と解析に関するより包括的で詳細なガイドについては、Castagnini, D. et al.3を参照してください。
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プロトコル
PmbExMの全体的なプロセスを 図1にまとめます。この研究で使用したすべての名前の付いた溶液(すなわち、モノマー溶液、プロテイナーゼK消化溶液など)の組成を見つけるには、 補足ファイル1 を参照してください。同様に、画像処理の経験が豊富な研究者でも利用できる簡易なデータ処理・解析ルーチンについては 、補足ファイル2、補足ファイル3、 補足ファイル4 を参照してください。このプロトコルは、2.5〜3週間の期間にわたって快適に実行できます:最初の1週間は、カバースリップの洗浄と滅菌、バイオフィルムの成長、およびサンプルの固定に専念します。2週目はサンプル染色とPmbExMプロトコル自体、3週目はサンプルのマウントと画像取得です。さらに、必要な材料と溶液の1週間の事前準備を検討してください。この研究で使用した試薬、材料、機器、およびソフトウェアの詳細については、 資料表に記載されています。
図1: P. mirabilis バイオフィルムの増殖、観察、および分析を成功させるためのPmbExMプロトコルの固定、重合、消化、および透析。 左の列は、拡張プロトコル中に選択したステップにおけるサンプルの6つの状態を示しています。これは、固定、透過処理、染色されたバイオフィルムサンプルから始まり、4つの中間状態を経て、最終的なゲル化および膨張状態まで続き、超解像での顕微鏡検査および画像分析の準備が整います。バイオフィルムのEPSマトリックスは緑色で、細菌細胞壁は紫色の線で、一般的なタンパク質細胞構造は灰色で、アクリルアミド-アクリル酸ExMポリマーは波打つ青い線で示されています。このプロセスに関与するすべての酵素は、パックマンのシンボルで表されます:エキソ多糖類加水分解のための3つのグリコシド加水分解酵素(緑):α-アミラーゼ、セルラーゼ、およびリチカーゼ。ペプチドグリカン細胞壁の分解のためのムタノリシン(紫色)。一般的なタンパク質消化のためのプロテイナーゼK(灰色)。パックマンのシンボルの色は、それぞれのターゲット構造と一致しています。不透明度が低いオブジェクトや破線の境界線で表示されているすべてのオブジェクトは、酵素による劣化状態を表しています。この図は、Castagnini, D. et al.3 から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
1. バイオフィルム形成のためのガラスカバースリップの洗浄と滅菌
- 12 mmガラスカバーガラスを1 M水酸化ナトリウムで室温で20分間超音波処理し、次いで豊富な脱イオン水ですすいでください。
- カバーガラスを70%(v / v)エタノールで室温で15分間超音波処理し、次に95%(v / v)エタノールですすいでください。
- カバースリップを室温で風乾させます。
- オートクレーブ滅菌します。
2. Proteus mirabilisのバイオフィルムの成長
- P. mirabilisを10 mLのLuria Bertani(LB)ブロスで37°C、24時間、振とうせずに増殖させます。
注:市販の P.mirabilis タイプの株( 材料の表を参照)がこの研究で取得され、採用されましたが、容易に入手可能な 任意のP.mirabilis 株の使用が推奨されます。 - 培養物から1 mLを取り出し、9 mLの新鮮で滅菌済みのLBブロスに加えて、1:10希釈の細菌懸濁液を生成します。
- 1:10細菌懸濁液の600nmでの光学濃度(OD)が0.1であることを確認します。必要に応じて、OD600 = 0.1に達するまで、少量の新鮮なLBまたはP.mirabilis培養物を追加して調整します。
- 滅菌ポリスチレン24ウェルプレート(ウェルごとに1枚のカバースリップ)に12mmガラスカバースリップ(以前に洗浄および滅菌済み)を導入します。
注意: カバースリップの表面全体がウェルの底に接触していることを確認してください。バイオフィルムは、上を向いているカバーガラスの側面に形成されます。 - プレートのウェルに350μLのOD600 = 0.1細菌懸濁液を播種します。
注:プレートの内側のウェルのみに播種し、外側のウェル(つまり、行AとD、および列1と6のウェル)を滅菌水またはLBブロスで満たすことをお勧めします。これは、外側のウェルが内側のウェルよりも液体の蒸発速度が高く、バイオフィルムの成長に影響を与えるためです。 - 播種したプレートをインキュベーター内にセットし、45度の傾斜で配置します。
注:50 mLの遠心分離チューブやマイクロピペットチップボックスなどの一般的な実験材料を使用してください。傾斜した位置により、カバースリップの表面に空気と液体の界面が形成され、 そこでP.mirabilis バイオフィルムが最も厚い領域を確立します。 - バイオフィルムを振とうせずに、37°Cで48時間形成します。
注:このバイオフィルム成長セットアップは、培地の蒸発によるバイオフィルムの乾燥により、48時間を超えるインキュベーション時間には適していません。
3.バイオフィルムサンプルの固定と保管
- ウェルから培地を慎重に取り出し、バイオフィルムを含むカバースリップを300μLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で室温で5分間、非常に穏やかな撹拌で2回優しく洗浄します。
注:インキュベーションや洗浄に少量を使用することにより、反復的な流体交換によるバイオフィルムの破壊を避けてください。300〜400μLの液体は、バイオフィルムを24ウェルプレートに浸すのに十分です。ゆっくりとした系統的なピペッティングを行うこと、および交換された溶液がバイオフィルムに直接当たらないようにすることを強くお勧めします。 - PBSを慎重に取り外し、バイオフィルム固定のために室温で20分間、PBS中の400μLの4%(w / v)パラホルムアルデヒド(PFA)と交換します。
- PFAを取り外し、細胞透過処理のために300 μLの1% PBST(1% v/v Triton X-100 in PBS)と交換します。室温で20分間インキュベートします。
- 1% PBST溶液を300 μLの0.3% PBST(3% v/v Triton X-100 in PBS)と交換します。室温で30分間インキュベートします。
- 0.3% PBST を取り外し、サンプルの脱水のために 50:50 メタノールと 0.3% PBST の混合物 300 μL と交換します。室温で5分間インキュベートした後、混合物を1 mLの無水メタノールと交換します。
注:メタノール1mLをゆっくりと加え、ウェルの壁に向けます。この大量のメタノールは、サンプル保存中に完全に蒸発するのを防ぐために使用されます。 - サンプルを-20°Cで少なくとも1日、最長1ヶ月間保存してください。
注:サンプルのメタノール蒸発と乾燥を遅らせるために、柔軟なワックスフィルムを使用してプレートを密封することをお勧めします。 - 使用後は、メタノールをメタノールと0.3% PBSTの50:50混合物300 μLに交換し、次に室温で0.3% PBSTを300 μLに置き換えて、サンプルを順次再水和します。
4. バイオフィルム蛍光染色
- 再水和したバイオフィルムサンプルを、50 μg/mL のコムギ胚芽凝集素蛍光レクチンコンジュゲート(以下、WGAコンジュゲートと呼ぶ)とPBSで300 μLとインキュベートし、室温で20分間、細胞壁/カプセル/エキソ多糖類を染色します。
注:ディスカッションセクションの蛍光染色に関する関連トピックをご覧ください。これからは、サンプルを光から保護します。 - WGAコンジュゲート溶液を取り出し、300 μLのPBSで室温で10分間2回穏やかに洗浄します。
5. PmbExMのステップ
- MA-NHSアンカリングとアクリルアミド-アクリル酸重合
- 染色したバイオフィルムサンプルを、PBS中の1 mMメタクリル酸N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(MA-NHS)400 μLと室温で1時間、温和な攪拌を加えながらインキュベートします。
注:MA-NHSは、水性媒体中で加水分解しやすい活性化エステルですので、PBS溶液で1 mMを調製した直後にサンプルを処理してください。 - 室温で300μLのPBSを用いて10分間の穏やかな洗浄を3回行います。
- PBSを取り外し、300μLのモノマー溶液と交換します。4°Cで一晩(O.N.)インキュベートします。
- ゲル化プレチャンバーを構築します。スライドガラスをベースとして使用し、その上に折りたたまれた両面テープを2枚置き、400μmのスペーサーとして機能します。スペーサーを互いに8〜10mm離して配置します。
注:ゲル化プレチャンバーの構築方法のさらなる明確さについては、 図2A を参照してください。ここで使用した両面テープは厚さが約100μmだったため、トリミングして折り曲げることで3mm×5mm×0.4mmのスペーサーを作りました。利用可能な両面テープの厚さを測定し、それに応じて配置します。テープスペーサーによるゲル化溶液の吸収はごくわずかです。両面テープの代わりに、12mmの丸いガラスカバースリップを水滴と一緒に接着し、必要な高さまで積み重ねることができます。 - 重合中のサンプルを乾燥から保護するために、ウェットチャンバーを配置します。
注:マイクロピペットチップの一般的なボックスは、チップのプラスチック足場を取り外して濡れたペーパータオルと交換することで、簡単にウェットチャンバーに変換できます。 - モノマー溶液、10 % (w/v) N、N、N'、N'-テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)、0.5 % (w/v) 4-ヒドロキシ-TEMPO (4-HT)、10 % (w/v) 過硫酸アンモニウム (APS) をそれぞれ 47:1:1:1 の割合で十分に混合することにより、ゲル化溶液の新鮮なストック容量を調製します。APSを他のゲル化溶液試薬と混合するのは、5.1.5までのステップが完了した場合のみにしてください。
注:調製するストックゲル化溶液の総量は、処理されるバイオフィルムサンプルの量によって異なります。例えば、3つのバイオフィルムサンプルを処理するには、846 μLのモノマー溶液を18 μLの10 % (w/w) TEMED、18 μLの0.5 %(w/w) 4-HTを18 μL、18 μLの10 %(w/w)APSと混合して、900 μLのゲル化溶液を調製します。早期重合を防ぐために、APSは混合物の最後に、サンプル、ゲル化プレチャンバー、およびウェットチャンバーを使用する準備ができたときにのみ追加する必要があります。このステップでは、上記のすべての試薬を維持し、最近調製したゲル化溶液を冷却します。 - ゲル化溶液を調製した直後に、モノマー溶液を静かに取り除き、前者の300μLと交換してください。4°Cで5分間インキュベートします。
- ステップ5.1.7の進行中に、スライドガラス上に配置された両面テープストライプの残りの保護カバーを取り外し、それらの間のスペースに40μLのゲル化溶液を置きます。
- ステップ5.1.7が終了したら、バイオフィルムを含む各カバースリップをウェルから取り出し、スライドガラス上に前に置いた40μLのゲル化溶液の滴の上に置きます。カバーガラスの表面のバイオフィルムがゲル化溶液に接触するように、カバーガラスの向きを合わせます。
- ピンセットを使用してバイオフィルム含有カバースリップを優しく押し、両面テープスペーサーへの接着を確保して、ゲル化チャンバーの構造を終了します。
注:このサンドイッチのようなセットアップは、ゲル化チャンバーと呼ばれるもので構成されています(図2B)。 - サンプルを湿式チャンバー内で重合させ、攪拌せずに37°Cで2時間インキュベートします。
- 蛍光顕微鏡(ステップ6.2.1を参照)でサンプルを可視化し、ゲル化チャンバーを分解せずに拡張前の画像キャプチャを行います。
注:ゲル化したサンプルをウェットチャンバーから1時間以上放置しないでください。事前に膨張したゲルは乾燥しやすく、サンプルが使用できなくなります。拡張前の取得手順については、ステップSF2.3(補足ファイル2)をご覧ください。 - ゲル化チャンバーを分解し、外科用ブレードを使用してバイオフィルムサンプルの関心領域の周りの余分なゲルをトリミングします。
注:ゲルのトリミングは、拡張されたサンプルの取り扱いと取り付けを容易にするために強く推奨されます。さらに、サンプル内の関心領域の空間的な向きを追跡するには、ゲルを非対称な形状にトリミングするか、ゲルに特徴的な切り欠きを残して、正しい向きを簡単に認識できるようにします。 - トリミングされたゲルを運ぶカバースリップを新しい24ウェルプレートの中に入れ、ゲルを上に向けてください。
注:この段階では、ゲル化したサンプルは元のガラスカバースリップに接着したままにする必要があります。
- 染色したバイオフィルムサンプルを、PBS中の1 mMメタクリル酸N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(MA-NHS)400 μLと室温で1時間、温和な攪拌を加えながらインキュベートします。
- 酵素消化I-IIIおよびDNA染色
注: P. mirabilis バイオフィルムサンプルの機械的特性の均質化は、分解の対象となる生物学的構造に基づいて著者が分類した一連の酵素分解に従います:多糖類の加水分解(消化I)、ペプチドグリカン加水分解(消化II)、タンパク質加水分解(消化III)。- 消化I.
- サンプルを1 mLのα-アミラーゼ分解溶液に浸します。O.N.を50°Cでインキュベートします。
注:インキュベーション温度が高いことによるサンプルの乾燥を防ぐために、大量の酵素溶液(0.5〜1 mL)が使用されます。 - α-アミラーゼ溶液を取り出し、ゲルを室温で5分間、300 μLのセルラーゼ消化バッファーで洗浄します。
- セルラーゼ消化バッファーを取り出し、500 μLのセルラーゼ消化溶液と交換します。45°Cで2時間インキュベートします。
- セルラーゼ消化溶液を取り出し、ゲルを室温で300 μLのリチカーゼ消化バッファーで5分間洗浄します。
- lyticase消化バッファーを取り出し、500 μLのlyticase消化溶液と交換します。30°Cで2時間インキュベートします。
- サンプルを1 mLのα-アミラーゼ分解溶液に浸します。O.N.を50°Cでインキュベートします。
- 消化 II
- リチアーゼ消化液を取り出し、ゲルを室温で5分間、300 μLのムタノリジン消化バッファーで洗浄します。
- ムタノリシン消化バッファーを取り出し、1 mLのムタノリシン消化溶液と交換します。O.N.を55°Cでインキュベートします。
- 消化 III
- ムタノリジン消化液を取り出し、300 μLのプロテイナーゼK消化バッファーでゲルを室温で5分間洗浄します。プロテイナーゼK消化バッファーを取り出し、500 μLのプロテイナーゼK消化液と交換します。37°Cで2時間インキュベートします。
- (オプション)DNA染色
- プロテイナーゼK溶液を取り出し、ゲルを10x PBSの300μLで室温で5分間洗浄します。
- 10x PBSを取り外し、10x PBS中の300 μLの5 μM赤色蛍光核酸染色液と室温で30分間交換します。
注:ExM手順のDNA染色に関するコメントについては、ディスカッションセクションを参照してください。
- 消化I.
- 拡張
- プロテイナーゼK溶液(または、オプションのステップ5.2.4を実行した場合はDNA染色溶液)を取り出し、ゲルを60 mmのシャーレに移します。ペトリ皿ごとに1つのゲルを置きます。
注意: 小さな平らな絵筆を使用して、ゲルをガラスカバースリップに押し付けます。実験用ピンセットで、ガラスのカバースリップをつかみ、ゲルのプラットフォームとして使用します。プレートのウェルからゲルを持ち上げるときにブラシを使用して、ゲルがカバースリップから落ちるのを防ぎます。ゲルが折りたたまれないようにしてください。 - ペトリ皿に過剰な脱イオン水を入れ、ゲルを完全に沈め、室温で20分間穏やかに攪拌しながらインキュベートします。水を4〜5回交換します。
注:膨張するゲルは、水に浸すとほとんど見えなくなることに注意してください。水交換中にパスツールピペットまたはマイクロピペットからの吸引でゲルが損傷しないように、ゲルの位置を簡単にするために、ペトリ皿をライトに当てて配置します。
- プロテイナーゼK溶液(または、オプションのステップ5.2.4を実行した場合はDNA染色溶液)を取り出し、ゲルを60 mmのシャーレに移します。ペトリ皿ごとに1つのゲルを置きます。
図2:ゲル化チャンバーとサンプルの取り付け (A)プレゲル化チャンバー。スライド上に、両面テープスペーサー(黄色)を2つ配置します。ガラスカバースリップ(
= 12 mm)は、距離の基準として上部にあります。(B)ゲル化チャンバー。細菌のバイオフィルム(緑色)は、下部のカバースリップ表面に形成されます。厚さ400μmのスペーサー(オレンジ色)は、厚さ100μmの両面テープの切り欠きから作られています。スペーサーにより、ゲルはサンプル全体を埋め込むことができ、チャンバーの端からゲル化溶液がオーバーフローするのを防ぎ、サンプルがスライドとカバーガラスの間に押しつぶされるのを防ぎます。(C)3Dプリントされたイメージングチャンバー(.stlファイル https://github.com/scianlab/ExM にアクセスするには、次のリンクにアクセスしてください)。膨張ゲルサンプル(左)と脱イオン水に浸漬した膨張ゲルサンプル(右)。膨張したゲルは、浸漬するとほとんど見えなくなります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
6. 観察・分析
- 拡張サンプルの取り付け
- イメージング中にサンプルを固定化するために、ポリリジンコーティングを施したイメージングチャンバーを準備します11:イメージングチャンバーのガラス表面( 材料の表を参照)を0.1%(w / v)ポリ-L-リジンで室温で20分間浸します。
- ポリ-L-リジン溶液を取り出し、過剰な脱イオン水で2回洗浄します。1時間風乾させるか、37°Cのインキュベーター内に置いて乾燥プロセスを加速します。
- ステップ5.3.2からの5回目の透析サイクルの後、ゲルを覆っている水を取り除き、小さなフラットブラシを使用してサンプルを24 mm x 50 mmのガラスカバースリップに押し込みます。長方形のカバースリップをゲルのプラットフォームとして使用し、ペトリ皿から持ち上げます。
- ティッシュペーパーを使用してゲルから余分な水分を取り除き、ゲルの表面とイメージングチャンバーのガラス表面のポリリジンコーティングと水が直接接触するのを防ぎます。
- ゲルとガラスの間に気泡が溜まらないように、ゲルをイメージングチャンバーのガラス面に慎重に置きます。
注:イメージングチャンバーのガラス表面は完全に乾いている必要があります。膨張前の画像が撮影された場合は、膨張前のサンプルで以前にキャプチャされた視野を見つけやすくするために、膨張したゲルの正しい向きを検討してください。 - ゲルが完全に沈むまで脱イオン水を加えます( 図2Cを参照)。
注:拡張ゲルは、キャプチャ中の収縮を避けるために、イメージングプロセス全体を通して水和したままにする必要があります。
- 画像取得
- 利用可能な回折限界蛍光顕微鏡でサンプルの画像を視覚化し、キャプチャします。
注:著者らは、63倍の水浸対物レンズを1.2開口数(NA)のスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用しました。蛍光色素の励起には、488 nmおよび647 nmの固体レーザーラインを使用しました。キャプチャは、独自のソフトウェアによって制御される16ビットデジタルCMOSカメラで行われました( 資料の表を参照)。ボクセルサイズは64.4 mm x 64.4 mm x 200 nm(XYZ 軸)に設定しました。
- 利用可能な回折限界蛍光顕微鏡でサンプルの画像を視覚化し、キャプチャします。
- 画像処理
- 細菌のセグメンテーション(セクションSF2.1)、細胞幅測定(セクションSF2.2)、EF決定(セクションSF2.3)、および事前に拡張された条件(セクションSF2.4)の画像マッチングのためのデジタル画像処理ルーチンを見つけるには、 補足ファイル2 を参照してください。
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結果
PmbExMは P. mirabilis バイオフィルムを4.3倍に拡大し、形態とトポロジーを維持しました
図3A-Dは、P. mirabilisバイオフィルム細胞の物理的倍率と、この技術によってもたらされた分解能の向上を証明しています。さらに、これは、細胞が単層のようなレイアウトで組織化する薄いバイオフィルム領域だけでなく、細菌の2層または3層の密集した配置のより厚い領域でも観察されました(図3G、H)。定量的な形態学的解析により、PmbExMは細菌の最大幅を0.7μmから0.07μm±3.0μmから0.22μm±3.0μm(平均±SD)に増加させ、これは約4.3の拡張係数(EF)に変換されることが示されました(図3E
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ディスカッション
PmbExMの重要なステップ
他のExMバリアントと同様に、プロトコールの最も重要なステップの1つは、サンプルの機械的特性の均質化です。PmbExMの場合、これは一連の酵素処理によって達成されます。消化が不十分な場合、EFが低くなり、バイオフィルムの形態やトポロジーが損傷する可能性があり、解像度が最適でなく、信頼性の低い結果につながります。逆に、過度に積極的な消化、特にタンパク質分解処理は、重大な蛍光損失を引き起こし、バイオフィルムの形態と構造を損なう可能性があります。バイオフィルムの構造と組成の両方の複雑さを考慮して、PmbExMは、効果的な均質化を確保するために、ほぼ最適な条件下で消化酵素を利用するように特別に設計されました(報告された記事12,13,14,15に基づく)。...
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開示事項
著者は、この作品に関連する金銭的または個人的な利益相反を宣言しません。
謝辞
著者らは、SCIAN-Labでの拡張技術の実装に貢献してくれたJuan Eduardo Rodríguez博士とUlrich Kubitschek教授(U-Bonn)に感謝の意を表します。この作業は、ANID プロジェクト ICM P09-015-F (SH、DC、KP、JJW)、FONDECYT 1211988 (SH、DC、KP)、FONDECYT 3220832 (JJW)、FONDEQUIP EQM210020 (DC、KP、JJW、JT、NCH、PS、SH) によって資金提供されました。Núcleo SELFO NCN2024_068 (SH、KP、JJW)、CORFO 16CTTS- 66,390、MINEDUC GRANT RED 21994 (SH)、BASAL FB210005 (SH)、DAAD 57519605 (SH、NC)、Centro CTI230006 (SH)、FONDEF ID 23I10337 (SH)、およびRegional Binational Project Cooperación SUR-SUR AUCI / AGCID BIL-URY-2019-661 (SH、NCH、PS、MJG)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| &α;-Bacillus sp. | Sigma-Aldrich | 10070 | 多糖類消化 |
| 0.1% (w/v) ポリ-L-リジン水溶液 | Sigma-Aldrich | P8920 | イメージング用サンプル固定化 |
| 12 mm ガラス カバーガラス | Chemglass Life Sciences | CLS-1760 | ゲル化チャンバーコンポーネント |
| 16 ビット C13440-20CU カメラ | Hamamatsu Photonics | 利用できません | 画像取得用 CMOS デジタルカメラ |
| 24 mm x 50 mm ガラスカバーガラス | Chemglass Life Sciences | CLS-1764 | サンプル操作/取り扱い |
| 3Dプリントイメージングチャンバー | 内設計 | - | イメージングチャンバーオプション |
| 4-ヒドロキシ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル(4-ヒドロキシ-TEMPO) | シグマ-アルドリッチ | 176141 | ル化溶液成分 |
| 黒い壁の6ウェルガラス底板 | CelVis | P06-1.5H-N | イメージングチャンバーオプション |
| 酢酸 | Sigma-Aldrich | 818755 | 素緩衝成分 |
| アクリルアミド | Sigma-Aldrich | A4058 | モノマー溶液成分 |
| 過硫酸アンモニウム | Sigma-Aldrich | A3678 | ゲル化溶液成分 |
| Axiovert 200 顕微鏡 | Zeiss | 利用不可 | 共焦点顕微鏡 |
| 塩化カルシウム | Sigma-Aldrich | C8106 | 酵素緩衝成分 |
| C-Apochromat 63x 1.2 NA 水浸対物レンズ | Zeiss | 微鏡の対物レンズ | が利用できません |
| Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | 22178 | 多糖類消化 |
| Chamlide CMB 35 mm 皿磁気イメージングチャンバー | ライブセル装置 | 利用不可 | イメージングチャンバーオプション |
| ジメチルスルホキシ | Sigma-Aldrich | 472301 | MA-NHS アンカリング試薬ストック溶液 |
| リン酸二ナトリウム | シグマ・アルドリッチ | S3264 | 酵素緩衝成分 |
| エタノール | シグマ・アルドリッチ | E7023 | 洗浄・滅菌 |
| エチレンジアミン四酢酸 | メルク | 324503 | 酵素緩衝成分 |
| ファルコン ポリスチレン 24 ウェルプレート | Corning | 351147 | 一般手順プラットフォーム |
| FIJI ソフトウェア | 国立衛生研究所画像 | 処理ソフトウェア | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | 酵素緩衝成分 |
| 塩酸グアニジン | Thermo Scientific | 24115 | 酵素緩衝成分 |
| Huygens Software | Scientific Volume Imaging-Deconvolution | 画像復元用ソフトウェア | |
| 酸 | Supelco | 1.00317 | バッファー調製 |
| Kimwipes ティッシュペーパー | Fisher Scientiffic | 06-666 | 余分な水分除去 |
| 実験室用ピンセット | 電子顕微鏡 Sciences | M5E | 一般的なサンプル操作/取り扱い |
| Luria Bertani ブロス | Invitrogen | 12795-027 | バイオフィルム増殖培地 |
| Arthrobacter luteus | からのリチカーゼシグマ・アルドリッチ | L4025 | 多糖類消化 |
| 塩化マグネシウム | シグマ・アルドリッチ | D5652 | 酵素緩衝成分 |
| メタクリル酸 N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル | シグマ・アルドリッチ | 730300 | アンカリング試薬 |
| メタノール | シグマ・アルドリッチ | 32213 | サンプルの脱水と保管 |
| 微生物J | - | - | 画像処理ソフトウェアプラグイン |
| 顕微鏡スライドガラス | Chemglass Life Sciences | CG-8221 | ゲル化チャンバー成分 |
| リン酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | S9638 | 素緩衝成分 |
| Streptomyces globisporus | Sigma-Aldrich | M990 | ペプチドグリカン消化 |
| N、N、N'、N'-テトラメチルエチレンジアミン | Sigma-Aldrich | T7024 | ゲル化溶液成分 |
| N,N′-メチレンビスアクリルアミド | Sigma-Aldrich | M1533 | モノマー溶液成分 |
| Nunc 40.4 mm ガラス底ペトリ皿 | Thermo Fisher | 12-567-400 | イメージングチャンバーオプション |
| パラホルムアルデヒド | Sigma-Aldrich | 158127 | サンプル固定 |
| リン酸緩衝液生理食塩水 | Sigma-Aldrich | 79383 | モノマー溶液成分、洗浄、酵素緩衝液 |
| Engyodontium album | Invitrogen | 25530-031 | タンパク質消化 |
| Proteus mirabilis ATCC 12453 | 微生物製剤 | 0440P | 研究対象 |
| 小型フラットペイントブラシ | 地元の金物店 | - | サンプルの操作/取り扱い |
| 酢酸ナトリウム | シグマ・アルドリッチ 241245 | 酵素緩衝成分 | |
| アクリル酸ナトリウム | シグマ・アルドリッチ | 408220 | モノマー溶液成分 |
| 重炭酸ナトリウム | シグマ・アルドリッチ | S5761 | 酵素緩衝成分 |
| 塩化 | ナトリウムSigma-Aldrich | S9888 | モノマー溶液成分、酵素緩衝成分 |
| 水酸化ナトリウム | Sigma-Aldrich | 221465 | スライドガラス洗浄 |
| 固体レーザーライン | オミクロン | 利用不可 | 488、568、647 nm 励起レーザーライン |
| SYTO 61 核酸染色 | Invitrogen | S11343 | 蛍光色素 |
| トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩 | SAFC | 108219 | 酵素バッファー成分 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | サンプル透過処理、酵素バッファー成分 |
| Volocity 7.0.0 キャプチャーソフトウェア | Quorum | Technologies-Microscoy 取得コントローラーソフトウェア | |
| Volocity ViewVox スピニングディスクシステム | Perkin-Elmer | 利用不可 | 共焦点用スピニングディスクシステム顕微鏡 |
| 小麦胚芽凝集素–Alexa Fluor 488蛍光レクチン複合体 | Invitrogen | W11261 | 蛍光色素 |
参考文献
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