銅ナノ粒子による細菌のプログラム細胞死の研究

サマリー

銅ナノ粒子は、活性酸素種を生成することにより抗菌剤として作用します。ここでは、銅ナノ粒子が臨床的に関連する3つの病原体に対して有効であること、および特定のプログラムされた細胞死経路がこの殺菌プロセスに関与していることを示す手順を示します。

要約

近年、抗生物質の過剰使用や誤用により、多剤耐性病原体や難治病への懸念が高まっています。金属ナノ粒子や金属酸化物ナノ粒子などのナノ材料は、多剤耐性病原体に対抗するための潜在的な新しい戦略として、生物医学分野で人気を博しています。この研究では、薬剤耐性がますます高まっている3つの一般的な院内感染日和見病原体、大腸菌 (大腸菌)、 アシネトバクターバウマニー (A.バウマニー)、 黄色ブドウ球菌 (黄色ブドウ球菌)に対する殺菌剤としての銅ナノ粒子(CuNP)の使用を調査しました。2つのサイズ(20 nmおよび60 nm)のCuNPを合成し、コロニーアッセイを通じてその殺菌効果を評価するための詳細なプロトコルが提示されています。CuNPの根底にある抗菌作用のメカニズムを、活性酸素種の産生の変化を評価することで調べました。さらに、ヒトタンパク質の機能を阻害する4つのモジュレーターを適用して、プログラム細胞死(PCD)経路が細菌の死滅に関与する可能性を研究しました。このアプローチにより、銅依存性転写調節因子を含む銅恒常性タンパク質の研究に基づいて、銅耐性株の出現の可能性が示唆されています。これらの知見は、CuNPの殺菌効果と、抗生物質耐性への対処におけるCuNPの潜在的な役割を研究するための包括的な方法論を提供します。

概要

薬剤耐性菌は、医療において深刻な懸念事項です。それらの急速な出現により、従来の抗生物質の有効性が低下し、その結果、より多くの臨床的合併症が発生しています。これらは公衆衛生に大きな脅威をもたらし、新たな抗菌剤が緊急に必要とされています。研究の1つの道はナノマテリアルです。ナノマテリアルは、生存能力を損なうような方法で微生物と相互作用することを可能にする独自の物理化学的特性を持っています。例えば、銀ナノ粒子(AgNP)は細菌に酸化ストレスを誘発し、タンパク質の機能不全、膜破壊、DNA損傷、そして最終的には細胞死を引き起こします¹。一方、金ナノ粒子(AuNP)は、抗真菌性が知られており、キャリア²として働くことで抗生物質の殺菌効果を高めることができます。

さらに、銅ナノ粒子(CuNP)は、その強力な抗菌効果と製造コストの低さからも大きな注目を集めています。CuNPは、酵素活性の阻害と活性酸素種(ROS)の生成により、広域スペクトルの殺菌活性を示すことが研究で示唆されています³。CuNPの正電荷は、細菌への浸透を促進し、細胞への取り込みを促進します⁴。このメカニズムにより、CuNPは、感染を防ぐためのインプラントなどの表面コーティングの有望なオプションになります³。しかし、興味深い発見の1つは、CuNPの殺菌効果がサイズに依存しているように見えることです。いくつかの研究では、CuNPが小さいほど抗菌活性が高いことがわかっていますが、これはおそらく表面積と体積の比が優れているためです⁵。

ROSの生成は、脂質過酸化、タンパク質機能障害、DNA断片化、糖新生/グリコーゲン分解の阻害など、細胞や細菌に広範な損傷を引き起こし、壊死またはプログラム細胞死(PCD^{)に関与し}ています^6,7,8。最近の研究により、PCDシステムは細菌に存在し、真核生物のシステムと同様の作用モードとエフェクターを持つことが明らかになりました⁹。細菌群集は、毒素-抗毒素(TA)システム¹⁰を通じて、酸化ストレスを含むストレスに応答してPCDを誘発することができる。簡単に言えば、毒素-抗毒素システムは、重要な細胞プロセスを混乱させる可能性のある毒素と、毒素と安定した複合体を形成して通常の成長条件下で毒性を阻害できる抗毒素で構成されています。ほとんどの細菌や古細菌は、ゲノムにTA遺伝子座を含んでおり、多くの場合、染色体外DNAや染色体DNAの複数のコピーに存在します。TAシステムにはいくつかのタイプがあり、特に注目されているのがタイプII TA(MazE/MazFモジュール)です。ストレス条件下では、抗毒素は分解され、毒素が細胞の標的を阻害することを可能にします。大腸菌や黄色ブドウ球菌では、酸化ストレス、高温、アミノ酸飢餓などのストレス条件に応答して毒素MazFが活性化されます。その結果、抗毒素MazEの発現が減少し、毒素MazF¹⁰が放出されます。研究によると、MazFは、少数の亜集団が悪条件下で生存することを可能にするタンパク質の合成を可能にし、その一方で、ほとんどの集団がmazEFを介した細胞死を経験することがわかっています。この細胞死は、ROSが転写阻害または翻訳阻害を誘導するROS依存性、またはDNA損傷が死経路¹¹を誘発するROS非依存性のいずれかであり得る。

本研究では、CuNPが細菌死を誘導するメカニズムを探ります。TAシステムだけに焦点を当てるのではなく、以前に私たちの研究^で使用されていた4つのPCDモジュ^{レーター7,12}を使用して、細菌の潜在的なPCD経路を調査しました。

この研究では、2つの異なるサイズ(20 nmと60 nm)のCuNPの殺菌効果をさまざまな濃度で調べ、コロニーアッセイ、ROS検出、PCDモジュレーター(SBI、Z-VAD、NSA、およびWortmannin)などの方法を利用することにより、PCDが多細胞生物に限定されず、ストレス下の細菌群集でも発生することを強調しています。この研究は、詳細なプロトコルを提供することにより、研究者が自身のシステムでCuNPの有効性と殺菌メカニズムを評価できるようにすることを目的としています。さらに、これらの知見は、細菌性PCDの理解を前進させ、抗生物質耐性菌と闘うためのCuNPベースの治療法の開発をサポートします。

プロトコル

この研究で使用した試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. 銅ナノ粒子の調製

1. 市販の銅ナノ粉末(25nmおよび60-80nm)を市販の供給源から入手します。
2. 1.0 mMドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を、2つのサイズの1 mg/mLナノ粒子の分散剤として使用します。
3. ナノ粒子を超音波浴を用いて室温で少なくとも30分間分散させる。その後、完全に分散したナノ粒子は、その後の実験で使用する準備が整います。

2.バクテリアの調製

3. 細胞生存率評価

1. コロニーアッセイ
   1. ストックCuNP溶液(1 mg/mL)を使用して、0 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL の 2 つのサイズの CuNP をさまざまな濃度で調製します。
   2. ステップ2.3で調製した細菌培養物をマイクロ遠心チューブに分割し、室温で3300 × g で10分間遠心分離します。
   3. バクテリアペレットを保持し、2つのサイズのCuNPをそれぞれ異なる濃度で、穏やかにピペッティングします。
   4. バクテリアペレットをPBSと70%アルコールでそれぞれネガティブコントロールとポジティブコントロールとして処理します。
   5. 処理したすべての細菌を、200 rpm、37°C、24時間振とうしながらインキュベートします。
   6. インキュベーション後、処理したすべての細菌をPBSで洗浄し、LB寒天プレートに広げます。プレートを37°Cのインキュベーターに24時間置きます。
   7. 翌日、各治療群のコロニー数を数え、統計解析を行います。統計的な精度のために、これを 3 回に分けて実行することをお勧めします。
2. 殺菌機構の研究
   1. ステップ3.1.2で説明したように細菌を調製し、5 μMのSBI-0206965(SBI)で2時間、0.5 μMのネクロスルホンアミド(NSA)で1時間、100 nMのワートマニン(麦汁)で30分間、または100 nMのZ-VAD-FMK(Z-VAD)で30分間処理します。
   2. ステップ 3.1.1 で説明したように、5 μM の SBI、0.5 μM の NSA、100 nM の麦汁、および 100 nM の Z-VAD の存在下または非存在下で、異なる濃度の 2 つのサイズの CuNP 溶液で細菌を共処理します。
   3. モジュレーター処理(ステップ3.2.1)後に細菌を遠心分離し、上清を除去します。
   4. ステップ3.2.2で調製した溶液に細菌ペレットを再懸濁し、200rpm、37°Cで24時間振とうしながらインキュベートします。
   5. 細菌を70%エタノールとPBSでそれぞれ陽性および陰性のコントロールとして処理します。CuNPを含まない溶液をCuNPブランクコントロール(0 μg/mL;モック)として、各グループで同じ阻害剤条件下で使用します。すべてのサンプルをさらに24時間インキュベートします。
   6. インキュベーション後、細胞生存試薬を1:10の容量比で培養物に添加します。培養物を37°Cで振とうしながらさらに2時間インキュベートします。
   7. 2時間のインキュベーション後に培養物を遠心分離します(ステップ3.1.2)。蛍光上清を96ウェルプレートに移します。マイクロプレートリーダーで励起波長560nm、発光波長590nmを用いて蛍光を測定します。
   8. 残った上清を^10-5と^10-4 に希釈し、LB寒天プレートに広げて培養します。
   9. 翌日に単一のコロニーを数えます。

4. 活性酸素種の検出

1. ステップ2.3で説明したように細菌培養物を調製し、それらを微量遠心チューブに分割します。
2. さまざまなストレス条件の細菌をROS誘導陽性対照群として扱います(結果は示されていません)。処理については、手順 4.2.1 から 4.2.4 で説明します。
   1. バクテリアを405nmの紫外線に3時間さらします。バクテリアを45°Cで2時間インキュベートします。
   2. 次に、バクテリアを4°Cで2時間インキュベートします。
   3. 細菌を3%H₂O₂ で30分間処理します。
   4. ネガティブコントロールとして、LBブロス中の細菌を37°Cに維持します。
3. ステップ3.1.1で説明したように、さまざまな濃度のCuNPを調製し、細菌を20 nmまたは60 nmのCuNPで1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、および100 μg/mLの濃度で24時間処理します。
4. インキュベートした細菌をPBSで2回洗浄し、残っているナノ粒子を除去します。
5. 2′,7′-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(H₂DCFDA)色素をPBS中で最終濃度5 μMで調製します。
6. 細菌ペレットを5 μMのH₂DCFDAに再懸濁し、フローサイトメーターを使用して520/30 nm発光での蛍光強度を測定します。
   注:FL1緑色蛍光の強度は、処理した培養物中のROSレベルと相関しています。統計的な精度のために、これを 3 回実行することをお勧めします。

結果

3つの病原体における2サイズCuNPの抗菌活性
3つの日和見病原体(大腸菌、 黄色ブドウ球菌、 およびA.バウマニー)を使用して、CuNPの殺菌活性をテストしました。細菌を 0 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL、および 100 μg/mL の 20 nm または 60 nm CuNP で処理し、コロニー数から導き出された最小殺菌濃度(MBC)を使用して殺菌活性を決定しました。私たちの結果は、3つの株すべてについて、両方のサイズのCuNP(図1)の正の殺菌効果を示しました。 大腸菌では、20 nm および 60 nm CuNP 処理でそれぞれ 1 μg/mL および 5 μg/mL からコロニー数の有意な減少が観察されました(図 1A)。対照的に、 黄色ブドウ球菌 のコロニー数の顕著な減少は、両方のサイズのCuNPのすべての濃度で示されました(

ディスカッション

この研究では、 大腸菌、 黄色ブドウ球菌、 およびA.バウマニーに対する2つのサイズとさまざまな濃度のCuNPの抗菌効果とメカニズムを調査しました。確立されたプロトコルを使用して、CuNP誘発性殺菌効果には酸化ストレスと潜在的なPCD活性化が含まれることが観察されました。しかし、金属の恒常性と細菌のストレス応答との相互作用は、ほとんど解明されていません。以前の研究では、銅排出ポンプや金属結合タンパク質などの細菌耐性戦略が特定されており、CuNP感受性に影響を与える可能性があります¹⁹。さらに、銅イオンの潜在的な細胞毒性は、治療用途にとって依然として懸念事項であり、慎重な投与量の最適化の必要性が浮き彫りになっている²⁰。CuNPの殺菌メカニズムをより深く理解することは、CuNPを安全かつ効果的に利用するために不可欠です。

ここでの議論では、この方法の手続き的な側面とその...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Acinetobacter baumannii ブーベとグリモン株	American Type Culture Collection (ATCC)、マナサス、バージニア州、米国	17978	CuNP 毒素実験用細菌
Bio-Rad iMark Microplate Reader	Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA、USA	168-1130	細菌生存率アッセイの吸光度測定に使用されます。
細胞透過性2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセチンジアセチン (H2DCFDA)	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA	D6883	処理された細菌細胞の活性酸素種 (ROS) の検出に使用されます。
銅ナノ粒子 (CuNP) 25 nm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	774081	CuNP ストック溶液の調製に使用 銅
ナノ粒子 (CuNPs) 60-80 nm	Sigma-Aldrich, St. Louis,	774103	CuNP ストック溶液の調製に使用されます
Escherichia coli (Migula) Castellani and Chalmers	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA	25922	CuNP毒素実験用細菌
Gallios フローサイトメーター	Beckman Coulter, Brea, CA, USA		酸素種の検出を含む複数の実験におけるフローサイトメトリー分析に使用されます。
LB 寒天	FocusBio、苗栗、台湾	LBA500	細菌の培養に使用
Luria-Bertani (LB) ブロス	Becton、Dickinson and Company、スパークス、メリーランド州、米国	244620	細菌の培養に使用されます
ネクロスルホンアミド (NSA)	Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国	480073	細菌死経路研究における前処理のモジュレーターとして使用されます。
PrestoBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	P50200	蛍光による細胞生存率の評価に使用されます。
SBI-0206965 (SBI)	BioVision、ミルピタス、カリフォルニア州、米国	9580	死経路研究における前処理のモジュレーターとして使用されます。
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)	Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国	L4509	凝集を減らすための銅ナノ粒子の分散剤として使用されます。
黄色ブドウ球菌	American Type Culture Collection (ATCC)、バージニア州マナサス、米国 Bioresource Collection and Research Center (BCRC)、新竹、台湾	13567	CuNP 毒素実験用細菌
Varioskan LUX マルチモード マイクロプレート リーダー	Thermo Fisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国	VLBLATGD2	細胞生存率アッセイの蛍光測定に使用
Wortmannin (Wort)	米国マサチューセッツ州アブカム	ab120148	細菌死経路研究における前処理のモジュレーターとして使用されます。
Z-VAD-FMK (Z-VAD)	Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国	V116	細菌死経路研究における前処理のモジュレーターとして使用されます。