ここで報告されたTCID50アッセイは、ラベルフリーのリアルタイムインピーダンス測定とシステムのウイルス学モジュールを活用し、ウイルス誘発性細胞病理効果(CPE)を客観的にリアルタイムで監視しています。この効率化されたアッセイは、手間を大幅に短縮しつつ、高スループットの定量的動力学的CPE測定をサポートし、自動化されたリアルタイムのTCID50計算を可能にします。
方法論記事
インピーダンスを用いた自動ウイルスタイター定量のための、軽量でラベルフリーのリアルタイム50%組織培養感染線量(TCID50)アッセイ
この記事について
サマリー
要約
ウイルス価、すなわちサンプル中のウイルス濃度を測定することは、ウイルス学研究における基本的な手順です。プラークアッセイやTCID50アッセイのような従来の方法は必須ですが、時間がかかり、試薬の染色や標識が必要で、特に細胞病理効果(CPE)が微妙で画像診断で定量化が難しい場合、主観的な解釈を伴うことが多いです。例えば、TCID50アッセイではMTTやMTSのような生存性染料が用いられる一方、プラークアッセイはウイルスプラークの可視化に画像診断や染色に依存しており、これらは変動性を生じさせることがあります。さらに、これらの従来の方法はウイルス感染力の静的なスナップショットしか提供できず、ウイルスと許容細胞間の動的な相互作用を捉える能力を制限しています。ウイルス価測定の現行の制約を克服するため、インピーダンスベース技術を用いて、客観的かつ非侵襲的かつリアルタイムでCPEを測定し、ラベルの必要性を排除した効率的なTCID50アッセイが開発されました。本研究では、インピーダンス-TCID50アッセイの検証に2つのウイルス許容細胞モデルが用いられました。すなわち、HEK293A細胞におけるGFP標識アデノウイルス(Adv-GFP)とMDCK細胞中のインフルエンザAウイルス(IAV)です。ワークフローはシンプルで、細胞シーディング、ウイルス接種、リアルタイムモニタリング、ソフトウェアによるTCID50の自動解析が含まれます。感染期間中、TCID50値はシステムのソフトウェアによってリード・ミュエンチ式を用いて自動的に計算され、記録されたすべての時刻点で行われました。インピーダンス読み取り で 得られるIAVのTCID50値は、従来の結晶バイオレット染色ベースのTCID50アッセイで生成される値と同等でした。これらの結果は、インピーダンス測定とシステムソフトウェアのウイルス学モジュールを組み合わせることで、ウイルス定量が正確かつ効率的に達成できることを示しています。この新しいアッセイは従来の手法を簡素化しつつ、ウイルス動態に関する洞察を強化し、先進的なウイルス学的研究を支援し、臨床応用の可能性を拡大します。
概要
ウイルス学研究が急速に進化する中で、ウイルス感染力の正確な定量化は、ウイルスメカニズムの理解、抗ウイルス療法の開発、ワクチン効果の評価において依然として不可欠です。最も重要な手順の一つは、サンプル中のウイルス粒子濃度であるウイルス価の測定です。TCID50アッセイは、接種細胞の50%でCPEを産生するために必要な感染性ウイルス粒子の数を定量化し、機能的なウイルス価を決定するために最も一般的に使われる方法の一つです。この広く使われているエンドポイントアッセイは、プラークを形成しないウイルスに特に価値があり、プラークアッセイ1の代替として機能します。
一般的に、TCID50アッセイはウイルスや許可細胞によって2日から14日かかります。細胞増殖、形態、生存率の変化を含むCPEは、(1)試薬添加後の比色測定(例えばMTT(3,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物)アッセイおよびMTS(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム)などの試薬を加えた後の比色測定で評価され、プレートリーダー2を使用しますまたは(2) 光学イメージングプラットフォームを用いた形態学的または培養関連の変化の視覚的評価(例えば、コンフルーシティ3%を測定してCPEを評価する、または(3)ウイルス処理ウェルをホルマリンまたはパラホルムアルデヒド(PFA)で固定した後の結晶バイオレット染色によるCPEの視覚検出。各ウイルス希釈時のCPE陽性複製数から導かれるウイルス感染の陽性率がTCID50計算の基礎となります。培養の50%がCPEを示す希釈は、Reed-Muench、Spearman-Karber、Improved-Karberなどの確立された式4を用いて統計的に計算され、その結果はTCID50/ミリリットル(TCID50/mL)として報告されます。
従来のTCID50およびプラークアッセイは機能的ウイルス定量のゴールドスタンダードとして広く認められており、貴重な洞察を提供します。しかし、これらのアッセイはしばしば面倒で時間がかかり、CPEを可視化するために手動染色が必要となり、処理量が少なく、人為的ミスのリスクが増え、主観性が高まります。感染力が非常に高いウイルスや致死性のウイルスの場合、ウイルスへの曝露時間を最小限に抑え、染色などの追加工程によるウイルス含有廃棄物の削減がバイオセーフティ向上の重要な考慮事項です。ラベルフリーイメージングベースのTCID50アッセイを除き、ほとんどのTCID50およびプラークアッセイはエンドポイントアッセイであり、これにより抗体価評価のタイミングが最適でなく、ウイルスと宿主細胞間の動的な相互作用の観察能力が制限される可能性があります。これらの制約を克服するために、効率的でラベル不要かつリアルタイムのTCID50アッセイが開発・確立されました。概念的には従来のTCID50アッセイと似ていますが、この新方法はRTCA MPシステムによって捕捉・解析された細胞インピーダンスの読み取りを活用し、感染を客観的かつ継続的に時間をかけて監視します。
インピーダンスベースのバイオセンシングは、細胞数、形態、細胞-基質付着強度の定性的かつ定量的な複合読み取りをラベルなしで非侵襲的に提供することが実証・検証されています5,6。過去の研究では、ウイルス誘発性CPEはRTCAインピーダンス測定7,8,9を用いてリアルタイムで正確に定量できることが示されています。生のインピーダンス値を報告する代わりに、セルインデックス(CI)と呼ばれる単位のないパラメータを用いてセルイベントによるインピーダンスの変化を反映します。例えば、細胞が井戸の底に付着し、広がり、成長するにつれて、CIは増加します。逆に、細胞が死死したり縮小したり、ウイルス感染時のように剥離したりすると、CIは減少します。
インピーダンスを用いたCPE測定の有望な報告を踏まえ、本研究はインピーダンスベースのTCID50アッセイが従来のウイルス定量の信頼性が高く正確な代替手段であることを示すことを目指しました。システムのソフトウェアにあるウイルス学モジュールは、リアルタイムCPE測定全体を通じてTCID50の自動計算を可能にし、アッセイプロセスの効率化と短縮を図るとともに、ウイルス複製の動態や許容細胞との相互作用に関する貴重な洞察を提供します。
プロトコル
試薬および使用機器は 材料表に記載されています。
1. インピーダンスベースのTCID50アッセイ
注: 図1 が示すように、インピーダンスベースのTCID50アッセイは、バイオセンサープレート上での許容細胞シーディング、ウイルス希釈の準備と接種、システム上でのCPE測定、そして最終的にシステムソフトウェアのウイルス学モジュールを用いたデータ解析とTCID50計算の4つのステップで構成されています。
- アッセイ調製:蘇生およびサブカルチャー許容細胞
注:この工程はアッセイの1週間前に実施する必要があります。実験間のばらつきを最小限に抑えるために、同じパスジ番号を持つ許容細胞バンクを準備することが強く推奨されます。携帯電話販売店から購入後は15番以上の細胞を使用しないでください。- 凍結保存許可細胞の解凍
- 温かい細胞増殖培地を37°Cの水浴で少なくとも30分間浸します。例えば、10%の胎児用牛血清(FBS)と1%のペニシリン/ストレプトマイシンを補足したDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)がHEK293A培養に使用されました。
- TCID50アッセイ用に、37°Cの水浴で1〜2分間優しく攪拌し、いくつかの氷結晶が現れるまで凍結保存した細胞バンクの細胞バイアルを解凍します。キャップを水に沈めないでください。バイアルを70%エタノールで拭き取り、ラミナーフードに入れます。
- 細胞を新しい50 mLの円錐形チューブに優しく移し、温めた培地9 mLを加えます。
- セルの懸濁液を300 x g で室温で4分間遠心分離します。
- 上清液を捨て、細胞を温めた培地15mLに再懸浮させます。新しいT75フラスコに移してください。
- 細胞を37°Cのインキュベーターで80%〜90%のコンフルエンシーまで培養し、CO2を5%にします。
- 許容細胞のサブカルチャー。
- 細胞が80%〜90%のコンバーシティに達するまで観察してください。
- フラスコから血清含有培地を取り出し、細胞単分子層をMgおよびCaフリーのドルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で優しく洗い流します。
- トリプシン化は、T75フラスコごとに0.05%トリプシン/EDTA溶液2mLを均等に分散し、フラスコを37°Cのインキュベーターに1〜3分間置くことで細胞をトリプシン化します。
注意:細胞を過度にトリプシン化しないでください。これは細胞に有害になる可能性があります。 - トリプシン化を止めるために、8 mLの血清含有培地を加えて元のトリプシン体積を少なくとも5倍に希釈します。細胞懸浮液2.5mLを新しいT75フラスコに移し、培地8mLを加えます。
注意:TCID50アッセイでは、新たに解凍した許可細胞の使用を避けてください。代わりに、培養細胞を80%〜90%のコンフルエンスで使用してください。実験間変動を減らすために、復活した細胞は解凍後最大2週間維持すべきです。2週間の培養中に高い細胞生存率と増殖を確保するために:(1) 培養培地を週に少なくとも2回交換すること;(2) サブカルチャー細胞が80%〜90%の合流度に達したとき。2週間を超える長期メンテナンスの場合は、検証が必要です。
- 凍結保存許可細胞の解凍
- ウイルス価
注意:このステップは初日に行う必要があります。- バイオセンサープレートの背景測定
- マルチチャネルピペットを用いて各ウェルに予熱された培地50μLを慎重に移し、逆ピペッティング技術を用いて気泡形成を最小限に抑え、安定した体積分配を確保します。
- プレートをプレートステーションに置く。システムのソフトウェアを開き、実験を始める前にウイルス学モジュールを選択します。関連するメモをExpNotesタブに入力し、対応する井戸を選択した後、LayoutタブのCellサブタブでセル名や番号などのセル情報を入力してください。あるいは、シーディング後にセル情報を入力することも可能です。
注意:プレートのウェルに細胞を追加する前に、プレートの背景測定を行う必要があります。すべての井戸のバックグラウンド測定値は-0.063から0.063の間であるはずです。 - スケジュールタブで「ステップを追加」ボタンをクリックすると、プレート背景測定用のステップ1を追加できます。その後、スタートボタンをクリックして録画を開始します。
- プレートをステーションから取り外し、細胞シーディングのためにフードに戻してください。
- 96ウェルバイオセンサープレートへの許容細胞シーディング
- T75フラスコから許可細胞をトリプシン化します。
- セル数を数え、セルの懸浮液を希望の濃度に調整します。この研究では、HEK293Aの濃度は60,000細胞/mLでした。
- プレートの各ウェルに100μLのセル懸濁液を加えます。
注意:適切な細胞密度が不可欠です。最適でないシード密度は実験的な成果物を引き起こす可能性があります。したがって、TCID50アッセイを行う前にシーディング密度を最適化する必要があります。 - セル添加後、プレートを室温のフード内に30分間置き、セルが井戸の底に均等に分布できるようにします。
注意:この工程を行わないと井戸間で大きな変動が生じる可能性があります。 - プレートを5%CO2の37°Cインキュベーター内のプレートステーションに入れます。
- ソフトウェアの スケジュール タブに移動し、デフォルトの録画設定で ステップ2 を追加してください:100回のスイープと15分間隔。これにより15分ごとにインピーダンス/CIモニタリングが開始され、ウイルス接種前の細胞の付着と増殖をリアルタイムで評価し、細胞品質管理(QC)ステップとして行えます。
注:2日目 - 実験間での再現性と一貫性を最大化するために、次のステップに進む前にシステム上の細胞性能を評価することが重要です。CIは細胞の付着と成長を反映するため、種まき後20〜28時間のCI値は重要な品質管理パラメータとなります。CIの価値と動態は細胞特異的です。本研究では、1ウェルあたり6,000細胞でシードされ、20〜28時間培養されたHEK293A細胞の場合、CIは2を超えるべきです。シードから20〜28時間以内にCIが2に達しなければ、HEK293A細胞培養は品質管理(QC)に失敗したとみなされ、その後のTCID50アッセイは実施されません。この基準により、実験結果の高い再現性が保証されます。
- ウイルスシリアル希釈の調製
- 希釈物を準備するために必要な培地(DMEM + 2% FBS + 1% ペニシリン/ストレプトマイシン)の総体積を計算し、37°Cの水浴で30分間温めます。この培地は実験の残りの部分で使われます。
- 分離したウイルスストックのバイアルを37°Cの水浴で1〜2分間急速に解凍し、すべての氷結晶が溶けるまで待つ。
- 各工程で20μLのウイルスストックを1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブに移し、180μLの予温培地を充填して10倍の連続希釈ウイルスを準備します。培地とウイルスのしっかり混ぜるためにピペットを上下に動かしてください。
注意:過剰なウイルス粒子残留物が先端の外に持ち込むのを防ぐため、ピペットの先端をウイルス溶液に深く浸さないように注意してください。これにより希釈が不正確になる可能性があります。 - 寒冷ウイルスサンプルの追加によるインピーダンス表示の変動を防ぐため、ウイルス希釈を37°Cのインキュベーターで5%CO2 と20分間培養して均等化させ、接種前に行います。
- レイアウト タブで ウイルス処理情報を入力してください
- ソフトウェアのプレートレイアウトタブでは、ウイルス価処理のためのウェルを選択し、サブタブ「Treatment」をクリックし、例えばこの実験では0.001(10-3)の初期希釈を入力してください。ここで「希釈係数」として10を登場させます。希釈の方向を左から右へ選択します。ウイルス希釈はプレートレイアウト入力に基づいて自動的に計算され、対応する各ウェルに表示されます。
- 次に、ウイルス接種 量 を入力し、「 適用 」ボタンをクリックしてすべての治療情報を保存します。このステップは、データ解析時にTCID50/mLを正確に計算するために不可欠です。
- ウイルス処理されないウェルをネガティブコントロールに割り当てるには、適切なウェルを選択し、処理タブのウェルタイプ内のネガティブCtrlを選びます。
注:ネガティブコントロール井戸は指定し、レイアウトページに追加する必要があります。省略するとTCID50の計算ができません。
- ウイルス接種
- 準備ができたら、ソフトウェアの 一時停止 ボタンを押してデータ取得を停止します。プレートをステーションから取り外し、層状フードに置いてください。
- マルチチャンネルピペットを使って培地を慎重にプレートのウェルから取り出します。
- 細胞培養の妨害を避け、マルチチャネルピペットを使って50μLのウイルス希釈を優しく加えます。
- プレートをステーションに戻し、スケジュールタブのデフォルト記録設定(100回のスイープと15分間隔)でステップ3を追加して、2時間間15分ごとにインピーダンスの記録を再開し、ウイルスが細胞に結合できるようにします。
- ウイルス接種が2時間後、録画を一時停止し、ステーションから層状フードにプレートを移します。
- 細胞単分子層の破壊を防ぎながら、マルチチャネルピペットを使ってウェルに予熱された培地150μLをゆっくりと追加します。プレートをステーションに返せ。
- スケジュールタブの「スタート」をクリックしてステップ3を再開してください。 インピーダンス信号は接種期間中、15分ごとに継続的に測定されます。
- TCID50の計算は、TCID50アッセイの進行中または終了後に行われます
- データ分析タブで、アッセイで使用されたすべての井戸を選択してプロットチャートに追加します。チャートのy軸は、Y軸のドロップダウンメニューから選択するオプションによって決まります。
- パラメーターセクションに移動します。TCID50の計算を開始するには、パラメータドロップダウンリストからTCID50を選択します。
- 特定の時点でのTCID50計算には バーチャート を選択するか、接種期間中の所望期間にわたるTCID50の時間経過を生成するには 「時間依存TCID50 」を選択してください。実行ボタンをクリックするとTCID50/mLが計算され表示されます。
- バイオセンサープレートの背景測定
2. クリスタルバイオレット-TCID50アッセイ
- インピーダンスベースのTCID50アッセイ(ステップ1-2)で記述された最適なシーディング密度で、96ウェルマイクロプレート内の許容セルをシードします。
- インピーダンスベースのTCID50アッセイで指定されたウイルスの連続希釈調製と接種を行います。
- 固定と染色
- アッセイ終了後、各ウェルから上清液を優しく除去し、4%ホルムアルデヒド100μLを加えて細胞を固定します。
- 4°Cで1時間培養し、その後固定剤を除去します。
- PBSで調製した0.5%クリスタルバイオレットで固定セルを染色します。室温で30分間孵育します。
- 皿を水道水で洗い、背景がきれいになるまで洗います。プレートを完全に自然乾燥させてからスコアをつけてください。
注:クリスタルバイオレット廃棄物は、RCRAおよびカリフォルニア州規則(CCR 66261.24)の両方で有害とされています。使用済みのクリスタルバイオレット溶液、汚染物質(例:ペーパータオル、手袋)、廃棄物は指定された有害廃棄物容器で洗浄してください。廃棄物は、機関の環境衛生・安全衛生(EH&S)または認可された有害廃棄物処理業者を通じて処分してください。
- スコアリングとTCID50計算
- 各井戸を目視でCPEの検査を行いましょう。正の井戸では部分的または完全な単分子層破壊と薄い染色が見られます。ネガティブウェルは、濃い紫色の染色が残ったままの単層を保持します。
- 各希釈ごとに正井戸と陰井戸の数を数えます。
- 150μLの接種容積を基に、リード・ミュエンチ法を用いて手動でTCID50/mLを計算します。
結果
インピーダンスを用いたウイルス媒介CPEのラベルフリー、リアルタイム、動的モニタリング
ウイルス誘発性CPEがインピーダンスによって信頼性かつ定量的に測定できることを確認するために、まずRTCA eSightシステムを用いてAdv-GFP感染後の細胞HEK293A変化を記録しました。このシステムはインピーダンスを同時に測定し、同じ細胞集団からの生細胞画像を捉え、細胞挙動に関する洞察に富んだ情報を提供します。HEK293A細胞は96ウェルのバイオセンサープレートに、6,000セル/ウェルのシーディング密度で24時間シードされ、その後104 IFU/mLのAdv-GFPで感染させました。接種後250時間のインピーダンスおよび生細胞画像が記録されました(図2A)。細胞シーディングの違いによる変動を最小限に抑え、処理後の相対的な変化を明らかにするために、正規化細胞指数(NCI)を用いて細胞の成長、付着、生存率の時間経過による総合的な変化を表しました。NCIは、ある時点のCIを正規化時点(接種前の時間)のCIで割ることで計算されます。未感染対照群のNCI動態トレース(図2A、黒いトレース)は、最初の48時間で徐々に増加し、継続的な細胞増殖を示しています。テストの最後にプラトーが現れ、細胞が合流し、金のバイオセンサーの全表面積を覆っていることを示しています。対照的に、ウイルス感染井戸からのNCIの動態は接種後50時間でコントロール値を下回り、徐々に低下し、100時間でゼロに達しました。
同じ細胞群から取得されたライブセルイメージングは、インピーダンス信号が許容細胞がCPE連続体全体を進む際の物理的状態を確実に反映していることを視覚的に確認しました。 図2Aに示されているように、感染したHEK293A細胞におけるNCIとウイルスGFPの発現は、許容細胞が完全に溶解する前の最初の100時間以内に観察されました。さらに、指定された時間点に記録された生細胞画像(図2B)は、ウイルス感染時に許容細胞の状態であることをさらに示しています。感染後最初の48時間は細胞増殖が続き、ウイルス粒子は細胞内に低濃度のままでした。しかし、ウイルスの複製と感染が進行するにつれて細胞死が始まり、宿主細胞内の結合率の低下とGFPシグナルの増加がその証拠となりました。接種から約100時間後、ウイルスのGFP発現は生存可能な許容細胞の著しい減少により低下し始めました。この統合アプローチは、インピーダンスによるウイルス誘発CPE検出の信頼性を強化し、インピーダンスベースのTCID50アッセイの堅固な基盤を築きます。
インピーダンス読み取りから導出されたTCID50の自動計算
正のCPE井戸を正確に特定することは、信頼できるTCID50計算に不可欠です。インピーダンスベースのTCID50アッセイが、システムのウイルス学モジュールのサポートを得て正陰のCPEを正確かつ客観的に区別できるかどうかを評価するため、HEK293A細胞は接種前に6,000個の細胞/ウェルで24時間シードされ、Adv-GFPを10倍に希釈して処理し、各希釈ごとに8回の複製(ウェル)を用いました。アドバンテージによるCPEはRTCAシステム上でリアルタイムで記録されました。 図3Aでは、インピーダンス運動トレース(NCIとして示され)が記録され、実験全体を通じて自動的にプロットされました。接種後のNCIの減少は、ウイルスの添加量とインピーダンス信号減少速度との強い相関によって示される明確な線量依存性のCPEを示しています。10-3 から10-7 の高ウイルス負荷希釈にさらされた細胞は、複製ウェル全体で堅牢かつ均一なCPEを反映し、NCIが急激かつ一貫して低下しました。対照的に、10-8 ウイルス希釈時には、キネティックトレースが開始時から大きな変動を示し、特に接種後100時間以降にNCI標準偏差が著しく大きくなっていました。感染を引き起こす閾値以下、つまりこの場合は10-10 の希釈がさらに低下すると、NCIは陰性対照群と区別がつかなくなりました。これらのデータは、10-8 の希釈時には、1) ウイルスがすべての繰り返し井戸で同様の動力学でCPEを誘導できなかったこと、2) この希釈は、すべてのリピートでCPEを引き起こす濃度と、一部のまたは全くCPEを誘発しない濃度との間の境界線となります。この二値結果は、感染(CPEによるCI変化で示される)か感染していないか(CI変化なし)が、システムソフトウェア内の統計的手法を用いたTCID50の計算の基礎となります。したがって、特定のウイルス濃度で観察されるNCIの大きな変動は、部分感染の発生を示す重要な指標であり、TCID50を計算するために必要な外挿に不可欠である可能性があります。
従来のTCID50アッセイと同様に、CPE陽性の閾値を定義しなければ、内蔵ソフトウェアが自動的にCPE陽性の井戸を識別できます。異なるウイルスや許容細胞モデルによって異なる閾値が必要な場合があるため、ソフトウェアはウイルス学モジュール内でこれらの基準を設定・調整できるようにします。実証データに基づき、ソフトウェアの陽性CPEのデフォルト閾値は適用され、ウイルス処理済みの健康のNCI値が陰性(非接種)対照群の平均NCIより3標準偏差以上低いもの、すなわちNCIウイルス処理 <(NCI-3 X SD)陰性コントロール)を定義しました。個々の井戸は正(+)または負(-)のいずれかで評価されました(図3B)。この場合、Adv-GFPのTCID50/mLは、ソフトウェアに含まれる式の一つであるリード・ミュエンチ式を用いて計算されました。ポジティブCPEの基準の選択や定義以外は、ソフトウェアがプロセスを完全に自動化したため、TCID50の計算に手作業は不要でした。
ウイルス感染時のTCID50の動的追跡
TCID50アッセイの適切な期間を決定するために、Adv-GFP TCID50値を感染後30時間から30時間単位で抽出し、最大240時間まで継続しました。アデノウイルスの複製には約30時間10秒かかると報告されているため、意図的に30時間単位の増分が選ばれました。Adv-GFP TCID50値は時間の関数としてプロットされました(図4)。注目すべき観察は、TCID50値の徐々の上昇であり、これは接種後約150時間まで続きます。この地点を超えると、平衡状態が現れ、細胞療法効果が飽和状態に達した可能性が高いことを示します。時間依存的な増加とその後の安定化は、典型的なウイルス複製曲線を示唆しています。初期段階は活発なウイルス伝播が特徴で、実験条件下で最大の細胞病理的影響を反映するピークに達します。TCID50のプラトー期は、ウイルス感染過程が許容細胞の大多数に関与し、重大な細胞死を引き起こし、さらなるウイルス複製を停止させる生物学的な天井を反映している可能性があります。TCID50の運動時間経過は、アデノウイルスHEK293Aモデルの接種後6〜7日でアッセイを終了できることを示唆しており、TCID50値は150時間には8.9×109 TCID50/mLの安定した数値が観察されました。
インピーダンスベースのTCID50アッセイを用いたインフルエンザAウイルスの定量化
インピーダンスベースのTCID50アッセイが他のウイルス宿主モデルに拡張可能かどうかを調べるため、IAVに感染したMDCK細胞でTCID50アッセイが実施されました。IAV特異的な感染培地のわずかな変動に対応しつつ、コアアッセイ手順はアデノウイルスで確立されたものと整合性を保ちました。 図5A は、接種後のMDCK細胞のNCIを示しており、IAV希釈は1×10-2 から5×10−9の範囲です。Adv感染したHEK293 A細胞で観察された結果と同様に、未感染・陰性対照ウェルでは複製体間で安定かつ一貫したNCIを示しました。しかし、ウイルス感染井戸では線量依存的なNCI変化が見られました。低用量(6.4および1.3×10-7 希釈)では、大きな標準偏差が観察されました。これは、これらの希釈時にウイルス濃度がTCID50に近づいていたことを示唆しています。
CPE陽性ウェルは、Adv-HEK293Aモデルに適用されたのと同じ基準と閾値、すなわち陰の対照ウェルの平均より3標準偏差低い基準を用いて特定されました。また、接種後のさまざまな時点で、IAVのインピーダンスに基づくTCID50値も測定されました。 図5B は、2つの独立した実験からの平均TCID50値を示しています。初期の60時間を除き、感染後90〜150時間のTCID50値は良好な安定性と一貫性を示しており、インピーダンスベースのTCID50アッセイをIAVで確実に4日間で完了できることを示しました。この一貫性はインピーダンスベースの方法の堅牢性を強化し、異なるウイルス病原体に対する適応性と信頼性を裏付けています。
従来のTCID50法を用いたインピーダンスベースのTCID50アッセイの検証
インピーダンス由来のTCID50によるIAV濃度測定の検証のために、TCID50アッセイを併用して、ラベルフリーイメージングとクリスタルバイオレット染色の2つの代替手法を用いて実施しました。簡単に、MDCK細胞を製製し、96ウェルのマイクロタイタープレートにシードしました。翌日、細胞は5日間にわたり一連のIAV希釈接種を受けました。画像を用いたTCID50アッセイでは、4時間ごとに生細胞イメージングが取得されました。検証試験では10種類のIAVサンプルの濃度が評価されました。ウイルス処理済みウェルの細胞コンフルージョン率を、システムのソフトウェアを用いて陰性で感染していないウェルと比較しました。しかし、MDCK細胞の画像解析は特に困難であり、 図6Aに示されています。MDCK細胞の平面的な形態と不明確なエッジのため、細胞と空間の正確な識別は困難であり、画像解析によるCPE陽性井戸の信頼性向上が困難でした。より高度で高度な画像解析ソフトウェアを用いることで、このような場合にTCID50計算の精度が向上する可能性があります11。この場合、現行のシステムソフトウェアを用いたラベルフリー画像ベースのTCID50評価は成功しませんでした。結晶バイオレット染色-TCID50アッセイでは、プロトコルのセクションで説明した通り、接種後5日目に細胞を固定・染色しました。 図6B は、インピーダンスベースと結晶バイオレット染色ベースのTCID50値の間に強い線形相関を示しており、回帰方程式はy = 0.9582x、R² = 0.9979です。この比較解析は、インピーダンスベースのウイルス価測定法の信頼性とTCID50アッセイへの適合性を強調しています。
図1:インピーダンスベースのTCID50アッセイワークフロー。ステップ1:バイオセンサープレート上での許容細胞シーディング。許容細胞を最適なシーディング密度でプレートに播種します。細胞の成長は、細胞品質管理(QC)手順の一環としてシステム上で監視されます。ステップ2:ウイルスの準備と接種。ユーザーが定義した希釈係数を用いて連続希釈されたウイルス株を準備します。プレートをシステムから取り出し、ウイルスを層状フード内のプレートウェルに加えます。ステップ3:ウイルス学モジュールソフトウェアを用いたCPE陽性ウェルのCPE測定およびスコアリング。プレートをシステムに戻し、ウイルス誘発CPEのリアルタイム記録を再開してください。ソフトウェアは、ユーザーが定義したCPE検出の閾値セットに基づいて、CPE陽性の井戸を自動的に識別します。ステップ4:TCID50の計算。ウイルス接種中のCPE陽性ウェルのリアルタイムスコアリングにより、ウイルス学モジュールソフトウェアはアッセイの任意の時点でTCID50値を計算できます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図2:アデノウイルス誘発CPEは、Adv-GFP感染後の時間経過でHEK293A細胞におけるインピーダンス(左y軸)および緑色蛍光(右y軸)の動的プロファイリングを用いて評価されました。アデノウイルス感染細胞の正規化細胞指数(NCI感染細胞、赤線)、陰性対照細胞(NC感染細胞、黒線)、GFPの総合濃度(GFP感染細胞感染細胞、緑線)を時間の関数としてプロットします。総統合GFP濃度は許容細胞におけるGFP発現を反映し、ウイルス感染の指標となります。正規化細胞指数(1-6)の数字は、感染過程の特定の時刻に対応しています。データは平均 ± 標準差(N = 8)として示されています。(B) アデノウイルス-GFP感染前後の細胞HEK293A連続画像。(1) ベースライン画像(0時間)の後に、感染後48時間(2)、72時間(3)、96時間(4)、120時間(5)、200時間(6)のスナップショットが続き、細胞増殖、生存率、アデノウイルス-GFP蛍光の変化を示す。スケールバー=160μm。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。
図3:インピーダンスで測定されたHEK293A細胞におけるアデノウイルス-GFPの線量依存CPE。 (A) HEK293A細胞を6,000細胞/ウェル密度でバイオセンサープレートにシードし、24時間後に10倍希釈されたアデノウイルス-GFPを連続的に感染させた。データは平均 ± 標準差(N = 8)として示されています。挿入:10-8 希釈時のアデノウイルス-GFP感染ウェルの正規化細胞指数。10-9、10-11、10-12 の希釈データは明確化のため省略されています。(B) 各ウイルス希釈時の個々のウェル/複製は、CPE陽性(+)またはCPE陰性(-)のいずれかで評価されました。プレートの各カラムは異なるウイルス希釈で処理され、希釈勾配は第1列の最も低いものから第10列の最大まで変化しました。11および12列はウイルス処理なしの陰性対照ウェルでした。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図4:アデノウイルス-GFP感染後のHEK293細胞におけるCPEのインピーダンス測定から導出されたTCID50値の時間経過。 5つの実験からウイルス学モジュールを用いて、特定の時間点でアデノウイルス-GFPのTCID50/mLを計算しました。ウイルス学モジュールは3つのTCID50計算式を提供しますが、TCID50の計算にはリード・ミュンチ式が選ばれました。データは平均±標準差(N=5)として提示されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図5:インピーダンスベースのTCID50アッセイを用いたインフルエンザAウイルスの抗体価評価。 (A) MDCK細胞におけるインピーダンス 測定 によるIAVの線量依存CPE。MDCK細胞は8,000細胞/ウェルでバイオセンサープレートにシードされ、24時間後にインフルエンザウイルスの5倍の連続希釈で感染させました。データは平均±標準差(N=8)として示されています。2.6 × 10⁻⁸ 希釈のデータは明確化のため省略されています。(B) IAV感染MDCK細胞におけるインピーダンス測定から導出されたTCID50値の時間経過。TCID50の計算にはリード・ミュエンチ法が用いられました。データは平均 ± SD(N = 2)として示されます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図6:インピーダンスベースとクリスタルバイオレット染色ベースのTCID50アッセイの相関。 (A) IAVを接種したMDCK細胞の画像。スケールバー = 160 μm。(B) インピーダンスベースおよびクリスタルバイオレット染色法で得られたTCID50/mLの値を10個のIAVサンプルを用いて比較しました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図7:システムのウイルス学モジュールソフトウェアの代表的なインターフェース。 このソフトウェアはインピーダンスベースのTCID50アッセイプロセスを効率化します。(1) 実験設計の記録用プレートレイアウト;(2) ウイルス接種時にソフトウェアによって自動的にプロットされ表示される細胞インデックスまたは正規化細胞インデックス;(3) ソフトウェアはTCID50計算式の正のCPE基準や選択の柔軟性を提供します。(4) TCID50/mLはアッセイの任意の時点で測定可能です。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
ディスカッション
本研究では、アデノウイルスHEK293AおよびインフルエンザAウイルスMDCKモデルを用いて、ウイルス抗体価決定におけるインピーダンスの適用可能性が示されました。他にも、オルトポックスウイルス12、ウエストナイルウイルス(WNV)、セントルイス脳炎ウイルス(SLEV)13、チクングニアウイルス14、感染性滑液球ウイルス8、キメラ黄熱病デング熱15、肝炎Aウイルス16、SARS-CoV-217、デング熱ウイルス9など幅広いウイルスでウイルス誘発性CPE検出が堅牢かつ信頼性の高いことを検証しています。
インピーダンスを通じたリアルタイムCPE記録により、特定のウイルス許容細胞モデルにおけるCI値の時間依存低下を発見できます。Fangらは、フラビウイルス誘発性CPEを特徴づける動力学的パラメータCIT50(細胞インピーダンスが50%減少するまでの時間)が、特定の範囲内のウイルス感染量に反比例することを初めて示しました。また、CIT50は中和抗体価13の逆に比例することも示しました。その後、サノフィ・パスツールのCharretierらは、キメラ黄熱病・デング熱(CYD)ワクチン製品およびプロセス15の開発におけるウイルス感染性抗体価を決定するために、このインピーダンスベースのリアルタイム細胞解析(RTCA)手法を研究しています。Charretierらは、免疫 染色を用いたCCID50アッセイを用いて、このインピーダンスベースの細胞培養感染線量50%(CCID50)をさらに検証しました。彼らは、インピーダンスベースのRTCA法が産業用の標準CCID50アッセイに比べて約5分の1の労力が少なく、3.5倍のコスト効率であることを示しました。本研究では、インピーダンスベースのTCID50が従来のCrystal Violet TCID50アッセイに対してIAV誘発CPEに対して有効であることが実証されました。さらに、RTCAソフトウェアのウイルス学ソフトウェアモジュールも利用されました。CPE陽性井戸は、ソフトウェア内でユーザーが定義したCPE陽性井戸の基準に基づき自動的に特定されました。私たちの場合、陰性対照群と比べてCIの度合いが低下します。その後、ソフトウェアによってTCID50が計算され、CIT50に依存しない正確な抗体価決定が可能となり、最適な範囲外に検査サンプルが出るリスクを避けました。CPE陽性ウェルに対して適切な閾値を設定することは、アッセイの感度や特異度に直接影響するため非常に重要です。ユーザーは、細胞インデックスの変化と検証済みの従来手法の結果を比較してウイルス特異的な基準を決定することが推奨されます。これらの経験的に導き出された閾値は、ソフトウェアのウイルス学モジュール内で設定・調整できます。
他の細胞ベースのアッセイと同様に、インピーダンスベースのTCID50アッセイで使用される許容セルの状態は、試験の成功と結果の質を判断する上で極めて重要です。高い細胞増殖と生存率を確保するために、新鮮で低通過性の細胞が推奨されます。さらに、同じ通過点に許容細胞の細胞バンクを作ることで、実験間での再現性が向上します。 図3Aに示されているように、許容セルが最適な条件にある場合、未感染対照群ではアッセイ全体を通じて安定かつ一貫したインピーダンス信号を生成しました。CPE陽性ウェルの閾値を設定するための信頼できる基準基準を提供し、正確なウイルス価決定につながりました。さらに、インピーダンスベースのTCID50アッセイは、ウイルス価評価前に許容細胞の品質管理を行う独自の能力を持っています。健康な許容細胞の特徴的な動態的CIプロファイルは信頼性の高い品質管理指標として機能し、ウイルス定量に活発かつ一貫した細胞集団のみを使用することを保証し、再現性とアッセイの精度を高めます。
新しいウイルスごとに、実装前にインピーダンスTCID50アッセイの最適化と検証も実施されるべきです。基礎培地やFBS濃度を含む細胞培養条件などの主要要素は、再現可能な細胞インピーダンスデータの取得やCPE検出の感度向上に不可欠であり、これは過去の研究で強調されています(6,16)。この点で、ラベル不要でリアルタイムのインピーダンスベースの技術は、アッセイ開発16における細胞培養条件を最適化するためのシンプルで効率的かつ価値あるツールであることが証明されています。
インピーダンス-TCID50アッセイの限界は、CPEを引き起こしないウイルスで発生します。なぜなら、このアッセイはCPEを利用してインピーダンス読み取りの変化を生み出し、これがTCID50計算の基礎となるからです。そのような場合、ウイルス誘発CPEを示せる代替の許容細胞モデルを特定するか、特定のウイルス抗原に対する適切な抗体が利用可能であれば免疫染色法を採用する必要がある場合があります。それにもかかわらず、本研究はRTCA MPシステムが線量依存的なCPEを捉え、客観的かつ高感度なインピーダンス表示 を通じて 感染細胞群と非感染細胞群を効果的に区別できることを示しました。
TCID50の時間依存分析の導入は、従来のエンドポイント測定に対する大きな進歩を示しています。これにより、TCID50のアッセイ最適化プロセスが簡素化され、ウイルス価を計算・報告する最適な時刻を単一のリアルタイムアッセイから簡単に得ることができます。画像ベースのラベルフリーTCID50アッセイも時間分解型TCID50値を提供できますが、その適用範囲はIAV-MDCKモデル(図6A)で示されているように、画像診断ソフトウェアのアルゴリズムで認識可能なCPEを示すウイルス細胞モデルに限定されています(図6A)。さらに、CPE検出にラベルフリーインピーダンスを使用することで、さまざまな試薬や複数ステップのワークフローによる人為的ミスリスクの増加を回避できます。ワークフローの簡素化に加え、システムのソフトウェアにあるウイルス学モジュールはアッセイの効率化にもつながります。まず、自動制御録画のための簡単な実験スケジュールの設定から始まります。その後、各測定後にリアルタイムで自発的なCPE陽性スコアリングが行われ、最後に感染性ウイルス粒子の分かりやすい定量化のための自動TCID50計算で締めくくられます(図7)。この自動化により、手間操作の時間が大幅に短縮され、特に感染力の強いウイルスを扱う際に重要な改善となります。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.05% トリプシン 0.53 mM EDTA (1回) | コーニング | 25-052-CI | |
| 12チャネル試薬貯留槽 | VistaLab テクノロジーズ | 3054-1011 | |
| アデノウイルス-GFP | ベクター・バイオラボ | 1060 | |
| DMEM媒体 | ATCC | 30-2002 | |
| Eプレート VIEW 96 | アジレント | 300601020 | |
| 胎児用牛血清 | アヴァントール | 97068-085 | |
| Hek293Aセル | サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック | R70507 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 | ハイクローン | SV30010 | |
| リン酸バッファー生理食塩水(1回) | ハイクローン | SH30256.01 | |
| シープラーク・アガロース | ロンザ | 50101 | |
| xCELLigence RTCA eSight システム | アジレント | S2833AA | |
| xCELLigence RTCA MP システム | アジレント | 380601040 |
参考文献
- Smither, S. J., et al. Comparison of the plaque assay and 50% tissue culture infectious dose assay as methods for measuring filovirus infectivity. J Virol Methods. 193 (2), 565-571 (2013).
- Pourianfar, H. R., Javadi, A., Grollo, L. A colorimetric-based accurate method for the determination of enterovirus 71 titer. Indian J Virol. 23 (3), 303-310 (2012).
- Hochdorfer, D., Businger, R., Hotter, D., Seifried, C., Solzin, J. Automated, label-free TCID50 assay to determine the infectious titer of virus-based therapeutics. J Virol Methods. 299, 114318(2022).
- Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the Calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virol Sin. 36 (1), 141-144 (2021).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (17), 7896-7900 (1991).
- Atienza, J. M., et al. Dynamic and label-free cell-based assays using the real-time cell electronic sensing system. Assay Drug Dev Technol. 4 (5), 597-607 (2006).
- Cheung, C. Y., Leung, C. K., Peiris, J. S. Potential of the real-time and label-free cell sensor impedance technology to transform cell-based infectivity assays for influenza viruses. Influenza Other Respir Viruses. 5 (Suppl 1), 151-154 (2011).
- Ebersohn, K., Coetzee, P., Venter, E. H. An improved method for determining virucidal efficacy of a chemical disinfectant using an electrical impedance assay. J Virol Methods. 199, 25-28 (2014).
- Goh, V. S. L., et al. Evaluation of three alternative methods to the plaque reduction neutralizing assay for measuring neutralizing antibodies to dengue virus serotype 2. Virology J. 21 (1), (2024).
- Crisostomo, L., Soriano, A. M., Mendez, M., Graves, D., Pelka, P. Temporal dynamics of adenovirus 5 gene expression in normal human cells. PLOS One. 14 (1), e0211192(2019).
- Wang, T. E., et al. Differentiation of cytopathic effects (CPE) induced by influenza virus infection using deep convolutional neural networks (CNN). PLoS Comput Biol. 16 (5), e1007883(2020).
- Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochem Biophys Res Commun. 401 (1), 37-41 (2010).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. J Virol Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- Marlina, S., Shu, M. -H., Abubakar, S., Zandi, K. Development of a real-time cell analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasites & Vectors. 8 (1), (2015).
- Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. J Virol Methods. 252, 57-64 (2018).
- Lebourgeois, S., et al. Development of a real-time cell analysis (RTCA) method as a fast and accurate method for detecting infectious particles of the adapted strain of Hepatitis A virus. Front Cell Infect Microbiol. 8, (2018).
- Suryadevara, N., et al. Real-time cell analysis: A high-throughput approach for testing SARS-CoV-2 antibody neutralization and escape. STAR Protoc. 3 (2), 101387(2022).
再版と許可
