方法論記事

カテーテル関連尿路感染症の In vitro 膀胱モデル

DOI：

10.3791/67966

⸱

2025年6月24日

 ,  , 
1The Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, The University of Liverpool, 2Department of Life Sciences, The University of Bath

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、カテーテル挿入された尿路の in vitro モデルの詳細を述べており、これは、シミュレートされたカテーテル関連尿路感染症におけるプランクトンおよびバイオフィルム関連細菌細胞集団の両方を研究するために使用できます。このモデルは、尿路感染症の制御を目的とした抗菌製品の有効性を研究するためにさらに活用できます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

カテーテル関連尿路感染症(CAUTI)は、最も一般的な医療関連感染症の1つです。尿道カテーテルでのバイオフィルム形成は、これらの感染症の病因における重要な側面であり、カテーテルの閉塞や腎盂腎炎や敗血症などの重篤な合併症につながることがよくあります。このような状況でのバイオフィルム形成をモデル化および研究するアプローチは、CAUTIの病因を支えるメカニズムの基本的な理解と、CAUTIとカテーテル閉塞を制御するための効果的な治療戦略の開発と堅牢な前臨床評価の両方に不可欠です。このプロトコルは、カテーテル挿入された尿路の in vitro モデルを記述し、臨床診療で使用されるカテーテル閉鎖ドレナージシステムを複製し、代表的な条件下でのCAUTIおよびカテーテルバイオフィルム形成の研究を促進します。さらに、このプロトコルでは、現在NHSサプライチェーンで利用可能な製品を含む、抗菌カテーテルメンテナンス製品の有効性を評価するための in vitro 膀胱モデルの適用について詳しく説明しています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

尿道カテーテルは、最も一般的に展開されている医療機器の 1 つであり、急性期医療施設での有病率は 19% と推定されています 1,2,3。カテーテルは、主に膀胱機能障害の場合の尿量管理を支援するために展開され、膀胱に直接挿入され、尿が中央の内腔2,3を介して膀胱から排尿することを可能にする。尿道カテーテルは、定期的に膀胱に挿入して尿を排出する間欠的に使用することも、カテーテルを膀胱内にその場に残して尿を連続的に排出する留置カテーテルを利用することもできます3,4。尿道カテーテルは広く使用されているにもかかわらず、尿路感染症 (UTI) の発症の最大の危険因子であり、尿路感染症は医療関連感染症の推定 5,6 を占めています。実際、カテーテル自体は、しばしば微生物のコロニー形成の初期部位として機能し、尿路病原体が尿路に付着し、さらにコロニーを形成するための表面を提供する1,6,7,8。長期の持続的カテーテル法 (カテーテルを ≥28 日間留置する) を受けているほぼすべての患者は、細菌尿を経験し、カテーテルがその場にある日ごとにリスクが ~5% 増加します 2,9,10,11。それに比例して、尿路感染症の約80%は尿道カテーテルの使用に関連しています6。

カテーテル関連尿路感染症(CAUTIs)は、医療サービスにとって大きな負担であり、合併症のない尿路感染症よりも重篤な上部尿路感染症の症状(尿管炎や腎盂腎炎など)と関連していることが多く、二次血流感染のリスクも高い1,7,12,13,14 .CAUTIの標準治療には抗生物質療法が含まれるが、これらの感染症は、カテーテル表面上の複雑なバイオフィルムコミュニティの発生の結果として、抗菌治療に対してしばしば抵抗性である15,16,17,18,19,20。実際、CAUTIの~80%はバイオフィルム形成尿路病原体に由来すると推定されています19。バイオフィルム形成は、細菌細胞のカテーテル表面への付着と、細胞外高分子物質(EPS)の広範なマトリックスに埋め込まれたコミュニティの発達によって特徴付けられます21,22,23,24。EPSの産生は、バイオフィルムコミュニティの決定的な特徴であり、抗菌剤に対する耐性の上昇や免疫クリアランス21,22,24など、バイオフィルム関連細胞が示す多くの創発特性に関与しています。EPSは、細胞を物理的に遮蔽し、抗菌剤または免疫エフェクターから保護することにより、これらの表現型において直接的な役割を果たすことができるだけでなく、バイオフィルムの物理化学的微小環境や持続性細胞の形成など、バイオフィルムコミュニティのより広範な側面の開発を促進することによって間接的に役割を果たすことができる23,24,25,26。さらに、CAUTIsの~11%を占めるProteus spp.を含む一部の尿路病原体は、強力なウレアーゼ酵素を保有しており、尿中に存在する尿素を加水分解し、尿中pH2,27,28,29,30の全体的な上昇をもたらします。このpH上昇は、カルシウムとリン酸マグネシウムの結晶の沈殿を伴い、成長するバイオフィルムに組み込むことができ、バイオミネラリゼーションとカテーテルをブロックできる高密度の結晶性バイオフィルム構造の形成をもたらします。これらの結晶性バイオフィルムは、治療を問題にするだけでなく、腎盂腎炎や敗血症などの深刻な合併症を引き起こす可能性があります2,28,31,32,33,34。

カテーテル挿入された尿路の複雑な環境ニッチ、およびこれらの感染症におけるバイオフィルム形成の重要な役割は、CAUTIの病因の研究において特定の課題を提起します。96ウェルプレートベースのアッセイなど、バイオフィルム形成を研究および定量するために広く使用されているシンプルで広く使用されているラボモデルは、CATUIでのバイオフィルム形成、特に結晶性バイオフィルムの研究には不十分です。例えば、そのようなモデルは、尿によって提供される複雑な栄養環境、カテーテル表面が接着およびその後のバイオフィルム産生にどのように影響するか、および尿媒体の継続的な流れなど、CAUTIニッチの主要な側面を考慮していない35,36,37,38,39,40.さらに、尿路病原体の抗菌薬感受性を決定するために使用される標準的なアッセイは、多くの場合、実際の臨床感受性を反映していません。最小阻害濃度アッセイおよび微生物懸濁試験は、CAUTI病原体の抗菌剤感受性を推測するために頻繁に使用されるが、典型的には、尿道カテーテルの存在およびその後のバイオフィルム形成が抗菌剤感受性に及ぼす可能性のある影響のようなCAUTI環境の重要な変数をシミュレートしない41,42,43。

この研究では、カテーテル挿入された尿路の環境をシミュレートし、1999 年に Stickler et al.44 によって最初に記述された、臨床診療で使用される標準的なカテーテル閉鎖ドレナージ システムを再現する in vitro 膀胱モデルのセットアップと実行について詳しく説明します (図 1)。このモデルは、標準サイズのフォーリーカテーテル(現在NHSサプライチェーンで利用可能)と、Nzakizwanayoら45によって以前に説明された人工尿培地(AUM)を使用して、CAUTIとバイオフィルム形成をシミュレートします。in vitro膀胱モデルは、「膀胱」として機能する二重壁のガラスチャンバーで構成され、フォーリーカテーテルを中央のガラスチャンバーに挿入できる出口があります。中央のガラスチャンバーの上部には、蠕動ポンプを使用して生物学的に適切な流量でAUMを「膀胱」に供給できる入口があり、蠕動ポンプはドレナージアイホールを介してカテーテルを通って廃棄物バッグに流れ込みます。さらに、外側のチャンバーはウォーターバス回路に接続されているため、モデルを一定の温度に保つことができます。in vitro膀胱モデルは、中央チャンバーを介して接種できるため、生物学的に代表的なニッチでのCAUTI病原体の研究が可能になります。さらに、モデルにカテーテルを挿入し、常に新鮮なAUMを供給することで、プランクトン細胞とバイオフィルム関連細胞の両方の成長と集団動態を研究することができます。

過去の研究では、Proteus mirabilisや大腸菌 43,45,46,47,48,49などの著名なCAUTI病原体におけるバイオフィルム形成の基礎研究を含む、いくつかの用途でin vitro膀胱モデルが利用されています。さらに、インビトロモデルは、CAUTIを制御するか、または閉塞を予防することを目的とした製品の有効性を評価するために利用されてきた50,51,52。最近では、AMRに関連する適応と突然変異がP. mirabilisのバイオフィルム形成とCAUTIの病因に影響を与えるかどうかを判断するためにモデルが使用されています43,46。in vitro膀胱モデルは、新たに処方されたセラノスティックカテーテルコーティングやファージ療法治療など、CAUTIの治療を目的とした新しい抗菌治療の研究にも使用されています47,48。このプロトコルには、in vitro膀胱モデルのセットアップと実行、モデルと尿道カテーテル表面からの生存可能なプランクトン細胞とバイオフィルム関連細胞の列挙、および尿路産生を監視するための尿中pHの測定が含まれます。また、現在NHSのサプライチェーンで利用可能な膀胱洗浄液や抗菌潤滑ジェルなど、CAUTIの治療または予防を目的とした抗菌製品の評価に関するプロトコルも詳細に説明されています。

プロトコル

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in vitro膀胱モデルのセットアップの概略図を図1に示します。In vitro 膀胱モデルは、標準的な Foley カテーテルと互換性があるように設計されています (図 1 に示す寸法は、標準サイズ 14 のフランス製カテーテルと互換性があります)。すべてのin vitro膀胱モデル機器を滅菌し、使用するシリコンチューブをメディア回路にクランプしてから使用してください。in vitroモデルのセットアップ全体を通じて無菌技術を厳守する必要があり、モデルを無菌条件(つまり、カテゴリーII微生物安全キャビネットまたは層流フード)で組み立てることをお勧めします。in vitro膀胱モデル実験の統計的有意性を決定するために、最小n = 5回の反復が推奨されます。試薬や使用機器の詳細については、資料表に記載されています。

1. 人工尿培地の調製

注:人工尿培地(AUM)は、実験に必要な培地の量が多く、ヒト尿サンプルに関連する変動性があるため、 in vitro 膀胱モデルでの使用が推奨されます。このプロトコルは、前述のようにAUMの調製を詳しく説明し、Nzakizwanayoらによる in vitro 膀胱モデルでの使用に最適化されています。 (5L最終容量)43、45、46、48、53、54。

  1. AUM ソリューション 1 の準備
    1. 次の化合物を秤量し、850mLの脱イオン水で満たされた1Lのホウケイ酸ボトルに加えます:3.25gの塩化マグネシウム六水和物(MgCl2.6H 2O)、23gの塩化ナトリウム(NaCl)、11.5gの無水硫酸ナトリウム(Na2SO4)、3.25gのクエン酸三ナトリウム(Na3C6H5O7)、 0.1gのシュウ酸ナトリウム(Na2C2O4)、14gのリン酸一カリウム(KH2PO4)、8gの塩化カリウム(KCl)、5gの塩化アンモニウム(NH4Cl)、25gのゼラチン、および5gのトリプトン大豆ブロス。
  2. AUM溶液を攪拌しながら、pHメーターを使用してpHを測定し、必要に応じて3 M NaOHまたはHClを添加して5.75(± 0.02)に調整します。
    注:pH調整用のNaOH / HClは、溶液からの塩分沈殿を防ぐためにAUMに滴下する必要があります。
  3. AUMのpHを調整したら、溶液を最終容量1 Lに脱イオン水で補充し、オートクレーブ滅菌します。
    注:滅菌後、溶液は室温で最大3ヶ月間保存できます(沈殿物や曇りが観察された場合は、AUM溶液1を廃棄する必要があります)。
  4. これとは別に、125 gの尿素(CH4N2O)と2.45 gの塩化カルシウム(CaCl2)を滅菌した500 mLビーカーに400 mLの滅菌脱イオン水に加えて、AUM溶液2を調製します。
    注:カルシウム尿素溶液2を調製すると吸熱反応が起こるため、AUM溶液2をホットプレート/マグネチックスターラーで攪拌し、~50°Cに加熱し、コンパウンドを溶解させて凍結を防ぐことをお勧めします。
  5. 尿素と塩化カルシウムが溶解したら、真空ポンプと0.45μMニトロセルロースフィルターユニットを使用して溶液2を滅菌滅菌し、滅菌済みの500mLガラス瓶に入れます。滅菌後、溶液2は4°Cで3ヶ月間、または室温で1ヶ月間安定です
    注:AUMソリューション2は、降水量や曇りが観察された場合は廃棄する必要があります。
  6. 層流フードまたはカテゴリーII微生物学的安全キャビネットで、AUM溶液1および2を3.6 Lの滅菌脱イオン水と無菌の5 Lガラス吸引器ボトルに無菌的に組み合わせます。AUMは淡黄色で透明である必要があります。
  7. 血清ピペットを使用して、総AUM容量から50 mLを取り出し、50 mLの遠心チューブに分注し、後で使用するために予約します。
  8. アスピレーターボトルをゴム栓またはアルミホイルで密封し、 in vitro モデルが組み立てられるまで室温で放置します。
  9. 50 mL アリコートから 10 mL の AUM を無菌的に取り出し、残りの溶液を接種物調製用に予約します。pHメーターを使用して、10 mL AUMアリコートのpHを測定します(~pH 6.1(±0.2)である必要があります)。調製したAUMは室温で約1ヶ月間安定しており、降水や曇りが発生した場合は廃棄する必要があります。

2. 体外 膀胱モデルのセットアップ

  1. フォーリーカテーテルを in vitro 膀胱モデルの中央ガラスチャンバーに挿入します( 図1に詳述されている概略図)。付属の滅菌水の注射器でバルーンを膨らませてカテーテルを所定の位置に固定し、廃棄物バッグをカテーテルポートに取り付けます。
  2. in vitro膀胱モデルデバイス45を接続チューブを介してAUMリザーバーに接続する。製造元の指示に従って、メディア回路チューブを蠕動ポンプに接続し、チューブが伸びることなく適切な張力がかかることを確認します。
  3. in vitro膀胱モデルをクランプスタンドに取り付け、モデルの下のスタンドにゴミ袋を固定して、重力によるモデルの流れを確保します。
  4. 膀胱モデルの外側のチャンバーをシリコンチューブ を介して 循環水浴に接続します(図1B)。ウォーターバスを37°Cに加熱するように設定し、タンクサーキュレーターをオンにします。
    1. in vitro膀胱モデルに接種する前に30分間ウォーターバスを運転して、温度が37°Cで安定していることを確認し、実験期間中、ウォーターバスが適切な水位まで補充されたままであることを確認します。
  5. メディアチューブからクランプを取り外し、ペリスタルティックポンプを約0.75 mL/minで作動するように設定して、ヒトの尿産生を再現します(~1080 mL/日)。実際の流量は実験中に計算されます。
  6. 接種前に蠕動ポンプを介してin vitro膀胱モデルにAUMを30分間通し、培地の流れが一定の速度であり、滅菌ドレナージシステムが無傷であることを確認します。
  7. 実験の前に、ゴミ袋から蓄積した媒体を排出します。メディアの体積を測定して、正確な流量を計算できます(ステップ4で詳しく説明します)。

3. in vitro 膀胱モデルの接種

  1. in vitro膀胱モデル用の一晩培養物を調製するには、固体寒天培地で増殖させたループ状の細菌コロニーを10 mLのLBブロスに懸濁します。撹拌しながら37°Cで一晩インキュベートします。
    注: in vitro 膀胱モデルは、 Proteus mirabilisなどのウレアーゼ陽性株を含むさまざまなCAUTI病原体の研究に使用でき、使用する増殖培地はそれに応じて変更することができます。
  2. 4,500 x g で室温で10分間、一晩培養した全量を遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを10 mLのAUMに再懸濁し、分光計を使用してOD595 nm での吸光度を測定します。
  3. 次の式を使用して、再懸濁した培養物を外径595 nm 1.0 および最終容量 10 mL の AUM に正規化します。
    figure-protocol-1
    ここで、A1 は一晩培養したオーバーナイト培養のOD600nm での吸光度、A2 は接種材料のOD600nm での所望の吸光度(1.0)、V2 は接種した所望の容量(10mL)、V1 はノーマライゼーションに必要なオーバーナイト培養の容量である。
    注:OD595 nm 1.0懸濁液10 mLを10 mL使用することで、ほとんどの細菌株(Proteus mirabilis、Escherichia coli、Enterococcus faecalis、Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureusで検証済み)の約10 10 CFUをモデルに接種し、確立された感染を再現します。開始接種は、使用する種またはモデル化される感染の段階に応じて変更することができます(つまり、より低い接種密度を使用して初期感染をシミュレートできます)47。
  4. 70%エタノールを使用して in vitro 膀胱モデルを滅菌し、ストッパー(メディアインレット)を取り外して、内部チャンバーにアクセスできるようにします。血清学的ピペットを使用して、膀胱モデル内の容量から10mLのAUMを取り出します。
    注:中央チャンバーから in vitro モデルを接種およびサンプリングする場合は、作業が迅速かつ無菌的であることを確認し、常に適切なPPEを着用し、70%エタノールで手袋と表面を定期的に除染してください。
  5. 標準化した10mL懸濁液全体を使用して、中央チャンバーを介してin vitro膀胱モデルを接種し、血清学的ピペットで十分に混合します。血清学的ピペットを使用してin vitro膀胱モデルの中央チャンバーから10 mLを取り出し、15 mLユニバーサルに分注して、後でCFU/mL計算とpH測定を行います。
  6. 膀胱モデルとブングの外面を70%エタノールで徹底的に除染し、ストッパーを交換します。メディアの流れを短時間再開して、中央チャンバーのAUMレベルがアイホールに到達することを確認してから、流れを止めます。
  7. 膀胱モデルで培養物を 1 時間確立してから、蠕動ポンプ を介して 培地の流れを ~0.75 mL/min でオンにします。
  8. 接種物が定着している間に、中央チャンバーから採取したサンプルから希釈液を調製します。
    1. サンプルが10-7に希釈されるまで、100 μLのサンプルを900 μLの滅菌PBSで段階希釈します。希釈液の10 μLスポットを適切な固体培地に三重にプレートアウトし、37°Cで一晩インキュベートします。
    2. インキュベーション後、各希釈プレート上のコロニーをカウントし、最初の接種の正確なCFU/mLを計算します。
      注:群れをなす種、すなわち Proteus mirabilisを使用する場合は、塩分を含まないMacConkey寒天(ペプトン20.0 g / L、乳糖10.0 g / L、胆汁酸塩5.0 g / L、ニュートラルレッド0.075 g / L、寒天12.0 g / L)を使用して、単一のコロニーが見えることを確認し、カウントを容易にします。
  9. 1時間のインキュベーション後、蠕動ポンプ を介して 培地の流れをオンにし、モデルのスイッチがオンになる時間に注意しながら、 in vitro 膀胱モデルの実行を開始します。

4. in vitro 膀胱モデル流量の計算

  1. in vitroモデルに接種し、培地の流れを開始したら、モデルを4時間稼働させます。メディアの流れを一時停止し、排水ポートを介してメスフラスコ内の廃棄物バッグから残留AUMの全量を回収します。収集されたボリュームをメモします。
    注:流量は、ステップ2.7で収集したメディアの量から計算できますが、モデルを長時間(つまり、推奨4時間)実行することで、メディア回路チューブ内の残留空気が計算された流量に影響を与える可能性が減少するため、より正確な流量を取得できます。
  2. 蠕動ポンプ を介して メディアの流れを再開し、ゴミ袋の排水口が閉じていることを確認して、無菌の排水システムを維持します。
  3. in vitroモデルの実際の流量を計算するには、次の式を使用します。
    figure-protocol-2
    注:ヒトの尿産生を再現するには、0.55〜1.0mL / minの範囲の流量が推奨されます。
  4. メディアの流量が許容範囲外で計算された場合は、レプリケートを破棄し、ペリスタルティックポンプのrpmを許容範囲内に収まるように調整します。

5. in vitro 膀胱モデルからの浮遊性細胞のサンプリング

注: in vitro 膀胱モデルは、集団動態を監視するために、実験全体を通じて定期的にサンプリングする必要があります。すべてのモデルは、接種直後、AUMフロー活性化の時点、接種後4時間(流量が計算されるとき)、およびモデルが終了する時点(閉塞または所定のエンドポイント)でサンプリングする必要があります。>24時間モデルを実行する場合は、CFU/mLを監視するために24時間ごとにサンプルを採取することをお勧めします。また、ユーザーの必要に応じて追加のサンプルを採取することもできます。

  1. 膀胱モデルストッパーを70%エタノールで除染し、取り外して中央チャンバーにアクセスします。
  2. カテーテルの先端とバルーンを避けて、血清学的ピペットを使用して中央チャンバーの内容物を穏やかに混合します。
  3. 血清ピペットを使用して、10 mLのサンプルをチャンバーから取り出し、滅菌チューブに移します。直ちにストッパーを70%エタノールで除染し、交換して、無菌の閉じた排水回路を完成させます。
  4. ピペットを使用してサンプルから1 mLを取り出し、1.5 mLの微量遠心チューブに分注して段階希釈します。
  5. pHメーターを使用して残りのサンプルのpHを測定し、サンプルが完全に混合されていること、および使用前にpHメーターが校正されていることを確認します。
  6. サンプルから予約した1 mLアリコートを段階希釈し、ステップ3.8.で前述したように適切な固体培地にプレートし、すべての希釈液をメッキします。
    注:膀胱モデルから採取したプランクトンサンプルは、ゲノムまたは分子生物学アプリケーション(オプション)を含む他の分析に適しています。

6. in vitro 膀胱モデルからのバイオフィルム関連細胞のサンプリング

  1. カテーテルの取り外しと準備
    注: in vitro 膀胱モデルのバイオフィルムサンプリングはエンドポイント分析であり、モデルの非アクティブ化と処理のためのカテーテルの取り外しが必要です。
    1. ゴミ袋をカテーテルから外し、バルーンを収縮させてモデルから残留尿を排出します。滅菌鉗子を使用して、モデルの底からカテーテルを取り外します。
    2. 取り外したカテーテルを滅菌ボードに置き、滅菌メスを使用して、切片化に必要なポイントでカテーテルを切断します( 図2に概説)。
    3. カテーテルセクションが縦に切断され、内腔が露出していることを確認します。次に、滅菌鉗子を使用して、カテーテル部分を滅菌PBSに3回浸し、非接着性細胞を除去します。
      注:SEMを使用して下流のカテーテル切片をイメージングする場合は、1 cmの切片をそのままにして(縦に切らないでください)、代わりに滅菌ペーパータオルで内腔から余分な水分を取り除いてから固定します。
  2. CFU/mL 計数のためのバイオフィルムの破壊
    注:バイオフィルム関連細胞の破壊を詳述するプロトコルは、バイオフィルムが広範囲に結晶性またはムコイドである場合、さらなる最適化を必要とする場合があります。
    1. 調製したカテーテル切片を0.25%トリプシンで37°C、30分間インキュベートします。使用するトリプシンの量は、カテーテルを覆うために必要な最小量である必要があります。例えば、1cmのカテーテル切片を垂直に切断する場合、0.25%トリプシン1mLで十分です。
    2. インキュベーション後、カテーテルを含む溶液を10分間超音波処理します。その後、カテーテル部分を取り外して廃棄することができます。トリプシンを不活性化するには、ステップ3.8で前述したように、細胞溶液を直ちに滅菌PBSで希釈し、適切な固体培地でCFUカウント用にプレーティングアウトする必要があります。
  3. クリスタルバイオレット染色によるカテーテルバイオフィルム定量
    1. 準備したカテーテル切片を、適切なサイズの平底ウェルプレートのウェルに加えます。適量の0.1%クリスタルバイオレット溶液を使用してカテーテル切片を完全に沈め、室温で15分間静的にインキュベートします。滅菌カテーテル切片もバックグラウンドコントロールとして含まれていることを確認してください。
    2. カテーテル部分をプレートから取り外し、新しいプレートに移します。各カテーテル切片を蒸留水で2回洗浄します。
    3. すすぎ後、カテーテル切片を新しいプレートに移し、33%酢酸で覆います。室温で15分間インキュベートします。
    4. カテーテル切片をプレートから取り外し、プレートリーダーを使用して、滅菌カテーテル切片を含むウェルをバックグラウンドコントロールとして使用して、各反復のOD595 nm を測定します。

7. in vitro 膀胱モデルによる抗菌薬感受性試験

注:カテーテル関連尿路感染症の制御を目的としたほとんどの治療法は、標準的なフォーリーカテーテルと互換性があり、 in vitro 膀胱モデル実験を開始する前に互換性を確認してください。

  1. 抗菌潤滑剤ゲル
    注:カテーテル挿入時の潤滑剤の使用をシミュレートするには、この手順をフォーリーカテーテルを挿入する直前のステップ2.1で実行する必要があります。カテーテルを挿入した後、モデルをすぐに接続し、ステップ2.6を行う必要があります。接種前にゲルが希釈されて排出されないように、省略する必要があります。.接種はカテーテル挿入と同じ日に行う必要があります。カテーテルで使用するために設計された潤滑剤は、6 mLまたは11 mLの容量の個別の滅菌シングルユースシリンジとしてパッケージ化されています。約5mLの潤滑剤は、膀胱モデルの首を満たし、モデルのベースをコーティングするのに十分です。
    1. 無菌技術を使用して、潤滑剤を含むシリンジの端を膀胱モデルの首に挿入し、5mLのゲルを挿入して首を満たし、チャンバーのベースに入ります。
    2. ベースがゲルで均一にコーティングされるようにモデルを回転させ、カテーテルの先端をゲルに押し込んでフォーリーカテーテルをモデルに挿入し、通常どおりバルーンを充填して固定します。
    3. モデルをセットアップの残りの部分に接続し、モデルの内腔を尿で満たし、排出を開始します。尿がカテーテルのアイホールから排出され始めたらすぐに、接種前にゲルの損失を防ぐためにポンプを停止してください。
      1. モデルを30分間インキュベートして尿が37°Cに達するまで待ってから、前述のようにモデルを接種して、ゲル成分の尿量への拡散時間が均一になるようにします。
    4. ステップ3.5で説明したようにモデルを接種し、1時間インキュベートしてから蠕動ポンプをオンにします。ポンプの電源を入れた時点で、1 mLのプランクトンサンプルを採取し、ステップ3.8で説明したようにCFUカウントの希釈液をプレートアウトします。
  2. 灌漑ソリューション
    注:灌漑溶液は、多くの場合、バルクまたは個別の滅菌使い捨ての「ポーチ」として入手できます。個々の溶液を使用する場合は、実験前に使用するカテーテルのドレナージポートと互換性があることを確認してください。バルク灌漑液を使用する場合は、トリプルルーメンカテーテルが使用されていること、および製造元の指示に従って製品投与の量/時間枠を決定していることを確認してください。
    1. 治療前に、 in vitro モデルを少なくとも4時間実行して、バイオフィルム関連コミュニティが確立されるのに十分な時間があったことを確認します。モデルを4時間実行したら、メディアフローを一時停止し、ステップ5で詳述するように、 in vitro モデルの内部チャンバーから前処理サンプルを採取します。
      注:一括灌漑ソリューションを使用する場合は、手順7.2.5に進みます。
    2. 個別の灌漑用「ポーチ」を使用する場合は、廃棄物バッグをカテーテルから外し、ポーチに付属のキャップを使用して廃棄物バッグを密封します。すぐに灌漑液ポーチをカテーテルに取り付け、軽い圧力で製品を中央の内腔に押し込みます。製造元の指示に従って適用します(つまり、15分間の適用)。
    3. 推奨される治療が完了したら、残留溶液をカテーテルのアイホール を介して 内部チャンバーから洗浄ポーチに排出してから、ポーチを外します。.ポーチの残りの内容物は、廃棄するか、さらに下流の用途に使用できます。
    4. カテーテルドレナージポートとゴミ袋接続ポートを70%エタノールで滅菌し、再接続して無菌の閉鎖型ドレナージシステムを完成させます。
      注意: 灌漑ポーチを使用する場合は、手順7.2.7に進みます。
    5. トリプルルーメンカテーテルを使用する場合は、灌漑ルーメンポートを70%エタノールで消毒し、製造元の指示に従って滅菌シリンジを使用してすぐに灌漑を開始します。
      注:灌漑する前に廃棄物袋内の残留尿の量を測定して、下流の閉塞時間または流量の計算でこれを説明できるようにします。
    6. 灌漑が完了したら、シリンジと廃棄物袋に残っている残りの灌漑液を捨てます。
    7. ステップ5で詳述したように、 in vitro 膀胱モデルの中央チャンバーから治療後のサンプルを採取し、ペリスタルティックポンプ を介して AUMフローを再開して実験を続行します。

8. in vitro 膀胱モデル実験の終了

注: P. mirabilis などのウレアーゼ陽性生物は、結晶性バイオフィルム形成 を介して 尿道カテーテルの閉塞を引き起こす可能性があります。したがって、閉塞は in vitro 膀胱モデルの生物学的に関連するエンドポイントとして使用でき、結晶性バイオフィルムによるカテーテルアイホールの完全な閉塞と、ガラス「膀胱」の中央チャンバー内のAUMの体積の増加によって視覚的に識別されます(図3)。

  1. in vitro膀胱モデルが所定のエンドポイント(閉塞または定義されたランタイム)まで実行されたら、ペリスタルティックポンプを介してAUMフローをオフにし、ステップ5で説明したように中央チャンバーからエンドポイントサンプルを採取します。
  2. ウォーターバスフローをオフにし、メディア回路とウォーターバス回路チューブを invitro 膀胱モデルから外します。
  3. in vitro膀胱モデルからストッパーを取り外し、血清学的ピペットを使用して残留尿の全量を除去します。汚染されたメディアは適切に廃棄します(つまり、オートクレーブ滅菌)。
  4. ゴミ袋を空にし、残っているメディアは捨てます。カテーテルのゴミ袋をカテーテルポートから外し、廃棄します。
  5. シリンジを使用して、カテーテルバルーンをゆっくりと収縮させてから、モデルからカテーテルを取り外してください。
    注:ウレアーゼ陽性細菌種を使用すると、カテーテルが in vitro モデルのガラス壁に「詰まる」可能性があります。カテーテルに大きな力を加えることは避け、代わりに手順8.6に進みます。
  6. in vitroモデルを5%抗菌洗浄液(材料表を参照)に一晩浸し、水で十分に洗浄して、残留消毒剤が除去されるようにします。滅菌するためのオートクレーブ。
    注:ウレアーゼ陽性種を使用する場合は、消毒液に5%w / vクエン酸を加えて、中央チャンバー内のバイオミネラリゼーションを溶解します。.この酸性溶液は、結晶性バイオフィルムの沈着物を分解することにより、モデルに付着したカテーテルを解放するのにも役立ちます。
  7. メディア回路のチューブをAUMリザーバーから外し、残っているメディアを廃棄します。チューブを水で洗い流し、残留AUMとオートクレーブを除去します。
  8. 正確な閉塞時間を計算するには、廃棄物袋の最終容積をメモし、ステップ4.4の式と以前に計算された流量を使用して閉塞時間を決定します。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

in vitro膀胱モデルの運用が成功するかどうかは、優れた無菌技術を実践し、実験全体を通じて培地の濁度を注意深く観察することにかかっています(図3)。接種前、滅菌AUMは淡黄色で、in vitro膀胱モデルの中央チャンバー内では透明でした(図3A)。培地リザーバー内のAUMは、濁度の変化が発生すると、溶液からの塩の沈殿や培地の汚染を示している可能性があるため、実験中は常に透明に保つ必要があります。メディアリザーバーまたはメディア回路チューブのAUMが曇ったり、色が急激に変化したりした場合は、レプリケートを破棄して繰り返す必要があります。接種後、in vitro膀胱モデル中央チャンバー内のAUMの濁度の増加がはっきりと見えます(図3B)。濁度の変化は、P. mirabilisなどのウレアーゼ陽性生物でより顕著であることがよくありますが、ウレアーゼ陰性生物では接種後も目に見えるはずです。.AUMフローが開始された後、プランクトン細胞が洗い流されるときにAUMの濁度の減少が観察されることが多く、モデルに生存細胞が不足していることを示すものではありません。中央チャンバー内の培地レベルを観察することは、ウレアーゼ陽性生物を利用する場合の閉塞時間を決定するためにも使用できます(図3C)。モデルが稼働しているときは、カテーテルのアイホールと先端が完全に見えるようにして、廃棄物バッグに適切に排出されていることを示す必要があります。閉塞すると、中央チャンバー内のAUMのレベルがカテーテルのアイホールと先端より上に上昇し、実験がエンドポイントの読み取りと終了の準備ができていることを示します。実験中、in vitro膀胱モデル培地回路の圧力効果により、モデルが詰まって見えることがあります。閉塞が疑われる場合は、チューブ内の気泡やねじれが「エアロック」を引き起こし、カテーテルの排出を妨げる可能性があるため、アッセイを終了する前にAUM回路、カテーテル、および廃液バッグチューブがぴんと張っていることを確認してください。

in vitro膀胱モデル実験では、プランクトンサンプリングにより、モデル内の成長ダイナミクスとCAUTIの進行に関する貴重な洞察を得ることができます。細胞増殖、pH、バイオフィルム形成はすべて、モデルを終了させることなく、実験全体を通じて監視できます(図4)。ウレアーゼ陽性生物を使用する場合、閉塞時間の計算をバイオフィルム形成速度の尺度として利用し、異なる細菌株の特性を比較するために使用できます(図4)。P. mirabilisの野生型株とLPS変異体(mini-tn5 waaCへの挿入)の比較では、ブロックまでの時間が延長され、変異体でのバイオフィルム形成が減少したことが示されました(図4)。ウレアーゼ陰性生物は通常、in vitro膀胱モデルをブロックしないため、実験前に設定されたエンドポイントを決定することをお勧めします。場合によっては、ウレアーゼ陰性菌がカテーテル閉塞を引き起こす可能性があります。例えば、肺炎桿菌のウレアーゼ陰性株は、広範囲のムコイドバイオフィルムを生成することができますが、これらは通常、ウレアーゼ陽性バイオフィルムよりもはるかに長い時間をかけて排液をブロックするため、エンドポイントを設定することが推奨されます。

膀胱モデルの実験全体でpHを測定することで、ひずみ間の違いやCAUTIの進行状況についての洞察も得られます。ウレアーゼ陰性菌を利用する場合、 in vitro 膀胱モデルの中央チャンバー内のpHは実験全体を通じてほぼ安定しているはずですが、実験の過程で集団動態が変化するため、pHのわずかな変動が予想されます。 in vitro モデルにウレアーゼ陽性生物を接種すると、時間の経過とともにpHが大幅に上昇し、通常、閉塞時に最も高いpHが観察され、~8-9という高いpH測定値が観察されます(図4B)。

浮遊性CFU/mLの計数化は、in vitro膀胱モデリングの重要な要素であり、オペレーターは接種が成功したかどうかを評価し、実験の進行状況を監視することができます。実験の最後にCFU/mLを測定することで、異なる細菌株間の膀胱コロニー形成の違いを明らかにすることができます。P. mirabilisのmini-Tn5変異株を野生型と比較したところ、閉塞時のCFU/mLの有意な減少が観察されました(図4C)。さらに、カテーテル表面のバイオフィルムからCFUを列挙し、バイオフィルムバイオマスを定量化することで、カテーテルを装着した尿路にコロニーを形成するさまざまな病原体の能力についての洞察を得ることができます。クリスタルバイオレット染色を使用して、野生型P.ミラビリスHI4320株とクロルヘキシジンで継代した分離株との間のバイオフィルム形成の違いを決定しました(図5)。595 nmでの光学密度測定により、クロルヘキシジンで継代した分離株は、クロルヘキシジンの非存在下で可決された野生型および対照群と比較してバイオフィルム形成の減少を示したことが示されました。

in vitro膀胱モデルの目的はCAUTIニッチを正確に再現することであるため、モデルは、臨床的に関連性のある環境でCAUTIを治療することを目的とした抗菌治療薬の効果を研究するためにも利用できます。ウレアーゼ陽性生物の場合、処理済みモデルと未処理モデルの閉塞時間を比較することで、治療の有効性に関する有用な洞察を得ることができます。P. mirabilisを0.02%クロルヘキシジン膀胱洗浄液で接種したin vitro膀胱モデルの処理は、未処理または0.9%生理食塩水で処理したモデルと比較して、閉塞までの時間を有意に延長しました(図6A)。さらに、in vitro膀胱モデルは、抗菌治療薬の殺菌活性を研究するために利用することができます。抗菌治療後のプランクトン性およびバイオフィルム関連細胞のCFU/mLの変化をモニタリングすることで、治療が有効かどうかを示すことができます。P. mirabilisを接種したin vitro膀胱モデルの処理では、メーカーの指示に従って適用した場合、未処理の0.9%生理食塩水灌漑モデルと比較して、治療直後のプランクトンCFU / mLが>7 log減少したことが示されました(図6B)。

figure-results-1
図1: in vitro 膀胱モデルの主要コンポーネントの概略図。 (A)膀胱モデル(クローズドドレナージシステム):(1)膀胱をシミュレートする二重壁ガラスチャンバー (2)メディアインレット、AUは蠕動ポンプ を介して 膀胱モデル内部チャンバーに供給されます (3)循環水浴 を介して 外部チャンバーに供給される水入口 (4)水出口 (5)フォーリーカテーテル、内部チャンバーに挿入されます (6)ドレナージルーメン接続ポイント;ゴミ袋/灌漑ポーチの接続ポイント (7) 尿の流出を収集する排水バッグ。(B) in vitro 膀胱モデルのセットアップと、モデルを通る媒体と水の流れの方向を示す概略図。人工尿は、室温で培地リザーバー(1)に保存され、実験期間中、蠕動ポンプ(2) を介して ~0.75 mL min-1 の一定流量でモデルに供給されます。培地は、膀胱(3)を表す二重壁のガラス容器の中央チャンバーに流れ込み、フォーリーカテーテル(4)のアイホール を通って ドレナージバッグ(5)に排出され、滅菌クローズドドレナージシステムが完成します。 in vitro 膀胱モデルは、二重壁ガラス容器の外側のチャンバーを流れる循環水浴(6) を介して 37°Cの一定温度に保たれます。破線はシリコンチューブを表し、矢印は流れの方向を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:バイオフィルム関連細胞を処理するための尿道カテーテルの切片化。 下流のバイオフィルム定量のための解剖用の尿道カテーテル上のサンプルポイント。(A)カテーテルは、最初に先端/アイホールに近位の8cm領域(ほとんどのバイオフィルム形成が観察される場所)で横方向に切片化されます。1cmの切片をメスで除去しますが、一般的には、処理の再現性が難しいため、収縮したカテーテルバルーンを含む領域を避けます(1-3)。(B)カテーテルが最初に1cmの断片に切片化されたら、中央の内腔に別の縦方向の切断が行われ、さらなるバイオフィルム定量、すなわち結晶紫色染色のCFU/mL列挙のために存在するバイオフィルムが露出します。破線は解剖点を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:in vitro膀胱モデル実験の段階。 実験のさまざまな段階にわたるin vitro膀胱モデルの中央チャンバーの画像。(A)接種前のin vitro膀胱モデル中央チャンバー内のAUM。中央チャンバー内の培地は完全に透明で、滅菌が成功したことを示しており、カテーテルの先端とアイホールは培地の線の上に見え、カテーテルが正常に排出されていることを示しています。(B)P.ミラビリスの接種後(接種後4時間)後のin vitro膀胱モデル中央チャンバー内の培地。接種の成功は、培地の濁度の増加によって示されます。カテーテルの先端とアイホールの視認性は、AUMがカテーテルを介して正常に排出されており、閉塞が発生していないことを示しています。(C)閉塞したin vitro膀胱モデルの一例。P. mirabilis の接種とそれに続くバイオフィルムの形成と石灰化により、カテーテルのアイホールが閉塞し、ドレナージが妨げられ、中央チャンバー内の媒体のレベルがカテーテル先端より上に上昇しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図4:in vitro膀胱モデルのエンドポイント測定は、閉塞するまで実行しました。 P. mirabilisの臨床株RS47(WT)と、バイオフィルム形成が弱毒化された変異株RS47-2(変異体)を接種したin vitro膀胱モデルからの閉塞時のエンドポイント測定の例。(A)WTおよびP.mirabilisの変異株の閉塞時間(h)。(B)閉塞時のin vitro膀胱モデルのpH。(C)閉塞時のin vitro膀胱モデルチャンバー内のプランクトン細胞のCFU/mL。すべてのデータは、5回の生物学的複製の平均を表しています。エラーバーは、平均の標準誤差(SEM)を示します。*p ≤ 0.05;**p ≤ 0.01.この図は、Clarke et al.46から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:in vitro膀胱モデルからのバイオフィルム関連細胞測定。 P. mirabilisのバイオフィルム形成の定量化、野生型HI4320株とクロルヘキシジン(CHD)の有無にかかわらず、結晶紫色染色および595nmでの光学密度(OD)の測定による適応集団の比較。WT:P.ミラビリスHI4320;1、3、5:CHD曝露のない通路制御。2、4、6:HI4320を4μg/ mL CHDで継代。すべてのデータは、5回の生物学的複製の平均を表しています。エラーバーはSEMを示しています。 *p ≤ 0.05;** p ≤ 0.01.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:抗菌治療後のin vitro膀胱モデルからの測定値。プランクトンサンプルは、0.02% クロルヘキシジン抗菌溶液 (100 mL) または 0.9% 生理食塩水コントロールによる灌漑後に、P. mirabilis を接種した in vitro 膀胱モデルから採取しました。(A)灌漑後のin vitro膀胱モデルの閉塞時間。(B)灌漑処理直後のプランクトン性CFU / mL。すべてのデータは、5回の生物学的複製の平均を表しています。エラーバーはSEMを示します。 *p ≤ 0.05;**p ≤ 0.01;*p ≤ 0.0001 です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

カテーテル挿入された尿路は、実験室環境で再現するのが難しい複雑な生物学的ニッチを表しています。in vitro膀胱モデルは、CAUTIをシミュレートする目的で設計されており、標準的な尿道カテーテルを使用して、臨床診療で使用される無菌の閉鎖型ドレナージシステムを再現しています。カテーテル挿入された尿路は、尿道カテーテルが CAUTI 6,55 の発症の最大の危険因子であることからも明らかなように、感染に非常に敏感です。それに見合った、慎重な無菌技術は、in vitro膀胱モデルの実行を成功させるために重要です。AUMの濁度は、汚染された培地や期限切れの培地が時間の経過とともに濁り、すべての複製物を廃棄する必要があるため、無菌性の明確な指標です。準備された接種物を追加するために中央のチャンバーを開くと、無菌の閉じた排水システムが壊れ、in vitro膀胱モデルが汚染されやすくなるため、in vitro膀胱モデルを接種およびサンプリングする際には、慎重な無菌技術も利用する必要があります。中央チャンバーの汚染を避けるために、トリプルルーメンカテーテルを使用してプランクトン細胞集団をサンプリングすることができます(廃液ルーメンをクランプオフし、追加のルーメンを介して排出することにより)。4時間の時点ではある程度のウォッシュアウトが予想されますが、この時点で生存可能なプランクトン細胞が列挙されていない場合は、トラブルシューティングが必要になることがあります。4時間後に生存細胞が列挙されない場合は、細菌のコロニー形成をより適切にサポートするために、使用する接種密度またはAUM製剤を最適化する必要があるかもしれません。さらに、接種物のウォッシュアウトは、メディア回路に問題があることを示している可能性があります。チューブ内のねじれは、適切な排水を妨げ、細菌の増殖を妨げる可能性のある有毒な代謝物の蓄積をもたらす可能性がありますが、メディアチューブを洗い流すために使用される残留消毒剤は殺菌効果を持つ可能性があります。

このプロトコルは、以前にNzakizwanayoらによって記述されたAUMの調製を詳述しており、Proteus mirabilisおよびEscherichia coli 43,45,46,48などの著名なCAUTI病原体を用いたin vitro膀胱モデルでの使用が以前に検証されています.ただし、プロトコルで使用されるAUM製剤を変更して、他の病原体の増殖を選択する余地があります。多数の多様なAUM定式化が発表されており、代わりにメディア回路28、56、57、58、59、60で使用することができる。さらに、培地リザーバー内のAUMには、特定の病原体の増殖のために選択するための栄養素や抗生物質を補給することができます。歴史的に、in vitro膀胱モデルにはプールされたヒト尿も供給されてきたが、in vitro膀胱モデルの複製を実行するために必要な大量の培地は、ヒトサンプルの収集を非現実的にする可能性がある53,54。さらに、ヒトの尿の組成は患者サンプル間で大きく異なる可能性があり、ホルモン、塩、タンパク質の濃度、ならびに水分補給状態の違いが細菌の増殖およびバイオフィルム形成に影響を与えることが示されているため、実験の再現性に影響を与える可能性がある38,39,61,62。

上記のプロトコルは、in vitro 膀胱モデルに ~1010 CFU/mL を複製する後期 CAUTI の接種について詳述しています。しかし、in vitro膀胱モデルの接種部位は、CAUTIの初期段階、すなわち尿道カテーテルの初期コロニー形成と膀胱への上昇をよりよく再現するために、将来のアッセイで変更される可能性があります。in vitroモデルをセットアップする前に、既知の細菌接種物でフォーリーカテーテルを手動で汚染することで、CAUTIの初期段階についての洞察が得られる可能性があります。実際、接種密度は以前の研究で変更され、初期段階の感染を再現しています。例えば、Nzakizwanayo et al. in vitro 膀胱モデルに、開始 CFU/mL (ca. 103 CFU/mL)を使用して、初期段階の感染を再現する47。ただし、接種密度を変更すると、閉塞までの時間が長くなる可能性があり、実験前に追加の検証が必要になることに注意してください。

さらに、プロトコルでは、in vitroモデルに細菌の単一培養を接種することについて詳しく説明していますが、モデルに真菌病原体を接種する余地があります。過去の研究では、CAUTIの最大8%がカンジダ属の感染に起因することが示唆されており、カンジダ属は抗真菌治療にしばしば抵抗性であるバイオフィルムを生成することができる27,63。さらに、in vitro膀胱モデルは、多微生物CAUTIの研究に対応するために変更することができます。実際、CAUTIの最大86%が多微生物性であることが示唆されており、これらの感染症はしばしば単種感染よりも重篤な症状と高い死亡率と関連しています27,64,65,69。in vitroモデルに複数の種を接種して、多微生物バイオフィルムの形成とCAUTIの進行を研究することができますが、接種前に多微生物群集の慎重な検証と接種密度の変更を行う必要があります。以前の研究では、in vitro膀胱モデルを利用して、単一種のP. mirabilis CAUTIとE. faecalisの二重種CAUTIと比較したバイオフィルム形成の違いを監視し、株間の代謝相互作用を強調しています。これにより、単一種の感染と比較してバイオフィルム形成が促進されました70。

in vitro 膀胱モデルを使用して CAUTI を研究する主な利点は、標準的な尿道カテーテルの表面でのバイオフィルム形成を観察できることです。CAUTIにおけるバイオフィルムの形成は、尿路病原体が付着できる尿の有機成分からなるカテーテル内腔上のコンディショニングフィルムの形成によって開始されることが多く、その後、増殖して成熟したバイオフィルム2,18,71,72,73を形成する。バイオフィルム形成の研究に使用される標準的なアッセイは、多くの場合、AUMではなく標準的な細菌増殖培地を利用し、ポリスチレンマイクロプレートまたはペグ、つまりカルガリーデバイスへの付着に基づいています。しかし、過去の研究では、システムの栄養環境、pH、酸素レベル、および流れや表面構造の違い(シリコーン対プラスチック)などの物理的特性がバイオフィルム形成に影響を与える可能性があることが示唆されています36,37,74,75,76,77,78。さらに、P. mirabilisのような広範なウレアーゼ活性を持つ細菌をAUMの閉鎖系で培養すると、有毒な代謝物が蓄積し、細胞死を引き起こす可能性がある78,79。これは、in vitro膀胱モデルでは、中央チャンバー内のAUMが培地回路を介して常に新鮮な培地と交換されるため、より臨床的に関連性のある条件下でのCAUTIバイオフィルムの研究が可能になる45。in vitro膀胱モデルの日常的な実行とモデルに選択されるエンドポイントは、モデルにウレアーゼ陽性または陰性の生物が接種されているかどうかに大きく依存します。理論的には、in vitroモデルは、十分な量のAUMが供給され、モデルの無菌性が維持されていれば、無期限に実行できます。ただし、実験の前にエンドポイントを選択することをお勧めします (それが閉塞であるか、任意の日数であるかにかかわらず)。ウレアーゼ陰性生物を接種したin vitroモデルは、臨床環境をシミュレートするために≤7日間実行することが一般的に推奨されます。これは通常、ほとんどの生物でバイオフィルム形成を観察するのに十分であり、臨床介入に沿って維持します。標準的なベストプラクティスでは、目に見えて感染したらカテーテルを交換する必要があることが示されています1,2。3、47、48。ウレアーゼ陽性生物は結晶性バイオフィルムを生成する可能性が高いが、in vitro膀胱モデル閉塞までの時間内にウレアーゼ陽性株内には大きな変動があり、プロテウス・ミラビリスの一部の株は10時間以内にカテーテル閉塞を引き起こし、他の株は39,46をブロックするのに30時間以上かかる。標準的なウレアーゼ試験は、in vitro膀胱モデル実験の前に使用して、モデルを閉塞または事前定義されたエンドポイント80に対して実行するかどうかを決定することができる。

おそらく、in vitro 膀胱モデルを使用してバイオフィルム形成を研究する主な制限は、バイオフィルムの測定がエンドポイントの読み取りであり、尿道カテーテルの除去と解剖が必要であることです。逆に、実験中の任意の時点で、in vitro膀胱モデルから浮遊性サンプルを採取できます。さらに、in vitro膀胱モデルからバイオフィルムサンプルを採取すると、バイオフィルムの生成をより定量化するために、多数の追加のダウンストリーム技術を使用することができます。過去の研究では、結晶性バイオフィルム中に存在するカルシウムとマグネシウムの量を定量化するためにフレームフォトメトリーを利用しており、より複雑な染色を使用して、ウレアーゼ陰性バイオフィルム45,73,81,82,83,84のEPSマトリックスの成分を正確に同定することができます。

この研究では、CAUTIの治療を目的とした治療薬の効果を研究するためのin vitro膀胱モデルの適用についても説明しています。in vitro膀胱モデルは、AUMの使用、臨床的に関連するバイオフィルムの形成、CAUTIで見られる有機負荷の増加など、CAUTIニッチの重要な側面をシミュレートします。抗生物質などの治療薬は、臨床的に関連する薬物のバイオアベイラビリティをシミュレートするためにAUMタンクに直接追加することができ、過去の研究では、チオリダジンやフルオキセチンなどの再利用された薬物を利用して抗バイオフィルム効果を実証している81。さらに、殺生物剤の抗菌活性を推測するために、最小阻害濃度アッセイと細菌懸濁試験がよく使用されますが、アッセイが実際の殺生物剤感受性と相関することを示唆する証拠はほとんどありません41,85,86,87,88。in vitro膀胱モデルは、尿道カテーテルの存在とCAUTIニッチのより代表的なシミュレーションにより、抗菌潤滑剤ジェルや灌漑液などの製品をメーカーの指示に従って試験できるため、CAUTIの治療または予防を目的とした殺生物性製品の試験に有利です。過去の研究では、ファージ療法の有効性を判断するためにin vitro膀胱モデルも使用されており、ファージ治療により、P. mirabilisがin vitro膀胱モデルをブロックできる時間が100時間以上延長できることが実証されています47。また、in vitro膀胱モデルに標準サイズのフォーリーカテーテルを使用することで、新しいコーティングされたカテーテルの抗菌活性をアッセイすることができます。Slateらによる過去の研究。 セラノスティック シプロフロキサシン コーティングでコーティングされたカテーテルが、in vitro 膀胱モデル48 で P. mirabilis の閉塞までの時間を ~60 時間延長できることを実証しました。このことは、CAUTIの治療を目的とした新規治療法の研究におけるin vitro膀胱モデルの潜在的な応用を浮き彫りにしており、生物学的に関連性のある模擬CAUTIニッチにおける抗菌薬のより正確な評価を可能にします。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示していません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルの開発において専門知識を共有してくださったJonathan Nzakizwanayo博士とAnthony J. Slate博士に感謝します。バース大学での研究は、V.B. (MR/N0137941/1) の学生として、医学研究評議会 GW4 Biomed DTP によって資金提供されました。B.V.J.は、ダンヒル・メディカル・トラスト(RPGF1906\171)からの資金提供も受けています。O.E.C.による研究は、Kidney Research Northwest(RCN:1144798)によって資金提供されました。 図 1 は Biorender.com を使用して作成されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
313 ラピッドロードポンプヘッドエクステンションWatson-Marlow313蠕動ポンプ - 追加のポンプヘッドエクステンション 
323S/D手動制御可変速ポンプWatson-Marlow323S/D蠕動ポンプ
3Lベッドバッグ、レバータップ付き滅菌 グレートベアヘルスケア GDW173
内径3mmプラチナ硬化シリコーンチューブフィッシャー10111801小型AUM回路チューブ(ポンプチューブをモデルに接続)
径5mmプラチナ硬化シリコンチューブフィッシャー10539201中AUM回路チューブ(ポンプチューブをAUMリザーバーに接続)
塩化アンモニウム(NH4Cl)ッシャー11473713
無水硫酸ナトリウム (Na2SO4)Fisher11498717
Azlon テーパーコネクタ フィッシャー10712807AUM回路の異なる長さのチューブを接続するために使用されます
ベッドバッグハンガー グレートベアヘルスケア 10705P
Bochem ピンチ コック チューブ クランプ、直径 25 mmッシャー11805101
塩化カルシウム (CaCl2)フィッシャー10021681
クエン酸一水和物 メルクC1909-500G実験後のモデルから結晶バイオフィルムを除去するために使用されます 
フィッシャーブランド ガラス目盛り付きクラスBタイプ1ピペットフィッシャー 11992168穴あけ栓ゼラチンを介してAUMのin vitroブレーダーモデルを供給するために使用されます
VWR24360.233
Graphpadプリズム10GraphPadV10.0in vitro膀胱モデルの結果と統計分析をグラフ化するために使用される分析ソフトウェア。
ハンナ HI 2211-02 pH 卓上メーターフィリップ ハリス PP00057414
In vitro 膀胱モデル --Nzakizwanayo et al. (2019) によって以前に説明されたように、特注の機器。
Instillagel 6 mL 潤滑剤ゲルmydoctorshop.co.uk40-006セクション 7.1 で使用した潤滑剤ゲル。他のサプライヤーも入手可能です。
Kartell Plastilab 不均一テーパーコネクタFisher 11914289のチューブを接続するために使用
ッシャー10472643がる細菌の単一コロニーの計数用、すなわちプロテウスミラビリス
マグネシウム六水和物(MgCl2.6H2O)フィッシャー10386743
リン酸一カリウム(KH2PO4)Fisher10573181
Nalgene Y字型コネクタFisher101860701つのAUMリザーバーから複数のAUM回路を実行するために使用されます(タンクごとに1〜4モデル) 。
塩化カリウム (KCl)フィッシャー10375810
パイレックス アスピレーター ボトル、すりガラス サイド ソケット付き、容量: 5000 mLフィッシャー11347884AUM リザーバー
ボア付きゴム栓、外径: 37mm、赤、直径: 37mmフィッシャー11517612AUM リザーバーで使用され、AUM
を備えた in vitro モデルを供給するために使用サイズ14 フレンチ100%シリコンフォーリーカテーテル、インフレーション用滅菌水シリンジ付き グレートベアヘルスケア 4833-0514
塩化ナトリウム (NaCl)フィッシャー10735921
シュウ酸ナトリウム (Na2C2O4)Fisher10442211
Teknon Biocleanse 濃縮殺生物性クリーナー 5L フィッシャー 12447580後のモデル滅菌に使用
クエン酸三ナトリウム (Na3C6H5O7)フィッシャー11434993
トリプトン大豆ブロスフィッシャー10198002
尿素(CH4N2O)フィッシャー10404185
Uro-Tainer M NaCl 0.9%B.BraunFB99833セクション 7.2 で使用される生理食塩水膀胱洗浄ポーチ。
ワトソン・マーロウ ポンプシル 内径1.6mmプラチナ硬化シリコーンチューブフィッシャー12406280厚いAUM回路チューブ(パースタルティックポンプ用)
内フィ フィ 塩なしの異なる直径のマッコンキー寒天培地(脱水)フィ群塩化実験

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, D. R., et al. Epidemiology and health-economic burden of urinary-catheter-associated infection in English NHS hospitals: A probabilistic modelling study. J Hosp Infect. 103 (1), 44-54 (2019).
  2. Stickler, D. J. Bacterial biofilms in patients with indwelling urinary catheters. Nat Clin Pract Urol. 5 (11), 598-608 (2008).
  3. Feneley, R. C., Hopley, I. B., Wells, P. N. Urinary catheters: History, current status, adverse events and research agenda. J Med Eng Technol. 39 (8), 459-470 (2015).
  4. Lapides, J., Diokno, A. C., Silber, S. J., Lowe, B. S. Clean, intermittent self-catheterization in the treatment of urinary tract disease. J Urol. 107 (3), 458-461 (1972).
  5. Suetens, C., et al. Prevalence of healthcare-associated infections, estimated incidence and composite antimicrobial resistance index in acute care hospitals and long-term care facilities: Results from two European point prevalence surveys, 2016 to 2017. Euro Surveill. 23 (46), 1800516(2018).
  6. Nicolle, L. E. Catheter associated urinary tract infections. Antimicrob Resist Infect Control. 3, 23(2014).
  7. Jacobsen, S. M., Stickler, D. J., Mobley, H. L., Shirtliff, M. E. Complicated catheter-associated urinary tract infections due to Escherichia coli and Proteus mirabilis. Clinical Microbiol Rev. 21 (1), 26-59 (2008).
  8. Trautner, B. W., Darouiche, R. O. Role of biofilm in catheter-associated urinary tract infection. Am J Infect Control. 32 (3), 177-183 (2004).
  9. Garibaldi, R. A., Burke, J. P., Dickman, M. L., Smith, C. B. Factors predisposing to bacteriuria during indwelling urethral catheterization. N Engl J Med. 291 (5), 215-219 (1974).
  10. Warren, J. W., et al. Fever, bacteremia, and death as complications of bacteriuria in women with long-term urethral catheters. JInfect Dis. 155 (6), 1151-1158 (1987).
  11. Walker, J. N., et al. High-resolution imaging reveals microbial biofilms on patient urinary catheters despite antibiotic administration. World JUrol. 38 (9), 2237-2245 (2020).
  12. Chant, C., Smith, O. M., Marshall, J. C., Friedrich, J. O. Relationship of catheter-associated urinary tract infection to mortality and length of stay in critically ill patients: A systematic review and meta-analysis of observational studies. Crit Care Med. 39 (5), 1167-1173 (2011).
  13. Clarke, K., et al. Catheter-associated urinary tract infections in adults: Diagnosis, treatment, and prevention. J Hosp Med. 15 (9), 552-556 (2020).
  14. Tambyah, P. A., Maki, D. G. The relationship between pyuria and infection in patients with indwelling urinary catheters: A prospective study of 761 patients. Arch Intern Med. 160 (5), 673-677 (2000).
  15. Flemming, H. C., et al. Biofilms: An emergent form of bacterial life. Nat Rev Microbiol. 14 (9), 563-575 (2016).
  16. Stewart, P. S., Costerton, J. W. Antibiotic resistance of bacteria in biofilms. Lancet. 358 (9276), 135-138 (2001).
  17. Stewart, P. S. Mechanisms of antibiotic resistance in bacterial biofilms. Int J Med Microbiol. 292 (2), 107-113 (2002).
  18. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  19. Sabir, N., et al. Bacterial biofilm-based catheter-associated urinary tract infections: Causative pathogens and antibiotic resistance. Am JInfect Control. 45 (10), 1101-1105 (2017).
  20. Touzel, R., Sutton, J., Wand, M. Establishment of a multi-species biofilm model to evaluate chlorhexidine efficacy. JHosp Infect. 92 (2), 154-160 (2016).
  21. Luo, Y., Yang, Q., Zhang, D., Yan, W. Mechanisms and control strategies of antibiotic resistance in pathological biofilms. J Microbiol Biotechnol. 31 (1), 1-7 (2021).
  22. Dincer, S., Uslu, F. M., Delik, A. Antibiotic resistance in biofilm. Bacterial biofilms. , IntechOpen. (2020).
  23. Soto, S. M. Importance of biofilms in urinary tract infections: New therapeutic approaches. Adv Biol. 2014 (1), 543974(2014).
  24. Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends Microbiol. 13 (1), 34-40 (2005).
  25. Otto, S. B., et al. Privatization of biofilm matrix in structurally heterogeneous biofilms. MSystems. 5 (4), e00425-e00520 (2020).
  26. Wood, T. K., Knabel, S. J., Kwan, B. W. Bacterial persister cell formation and dormancy. Appl Environ Microbiol. 79 (23), 7116-7121 (2013).
  27. Gaston, J. R., Johnson, A. O., Bair, K. L., White, A. N., Armbruster, C. E. Polymicrobial interactions in the urinary tract: Is the enemy of my enemy my friend. InfectImmun. 89 (4), (2021).
  28. Griffith, D. P., Musher, D. Á, Itin, C. Urease. The primary cause of infection-induced urinary stones. Invest Urol. 13 (5), 346-350 (1976).
  29. Armbruster, C. E., Mobley, H. L. T., Pearson, M. M. Pathogenesis of Proteus mirabilis infection. EcoSal Plus. 8 (1), 1128(2018).
  30. Jacobsen, S. M., Shirtliff, M. E. Proteus mirabilis biofilms and catheter-associated urinary tract infections. Virulence. 2 (5), 460-465 (2011).
  31. Mobley, H. L., Warren, J. W. Urease-positive bacteriuria and obstruction of long-term urinary catheters. J Clin Microbiol. 25 (11), 2216-2217 (1987).
  32. Wasfi, R., Hamed, S. M., Amer, M. A., Fahmy, L. I. Proteus mirabilis biofilm: Development and therapeutic strategies. Front Cell Infect Microbiol. 10 (414), (2020).
  33. Broomfield, R. J., Morgan, S. D., Khan, A., Stickler, D. J. Crystalline bacterial biofilm formation on urinary catheters by urease-producing urinary tract pathogens: A simple method of control. J Med Microbiol. 58 (10), 1367-1375 (2009).
  34. Stickler, D. J. Clinical complications of urinary catheters caused by crystalline biofilms: Something needs to be done. J Intern Med. 276 (2), 120-129 (2014).
  35. Coffey, B. M., Anderson, G. G. Biofilm formation in the 96-well microtiter plate. Pseudomonas methods and protocols. , 631-641 (2014).
  36. Ceri, H., et al. The Calgary biofilm device: New technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clin Microbiol. 37 (6), 1771-1776 (1999).
  37. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J Microbiol Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  38. Bouatra, S., et al. The human urine metabolome. PloS one. 8 (9), e73076(2013).
  39. Holling, N., et al. Elucidating the genetic basis of crystalline biofilm formation in Proteus mirabilis. Infect Immun. 82 (4), 1616-1626 (2014).
  40. Lawrence, E., Turner, I. Materials for urinary catheters: A review of their history and development in the UK. Med Eng Phys. 27 (6), 443-453 (2005).
  41. Stickler, D. J. Chlorhexidine resistance in Proteus mirabilis. J Clin Pathol. 27 (4), 284-287 (1974).
  42. Fraise, A. P. Biocide abuse and antimicrobial resistance-a cause for concern. J Antimicrob Chemother. 49 (1), 11-12 (2002).
  43. Pelling, H., et al. Derepression of the smvA efflux system arises in clinical isolates of proteus mirabilis and reduces susceptibility to chlorhexidine and other biocides. Antimicrob Agents Chemother. 63 (12), e01535(2019).
  44. Stickler, D. J., Morris, N. S., Winters, C. Simple physical model to study formation and physiology of biofilms on urethral catheters. MethodsEnzymol. 310, 494-501 (1999).
  45. Nzakizwanayo, J., Pelling, H., Milo, S., Jones, B. V. An in vitro bladder model for studying catheter-associated urinary tract infection and associated analysis of biofilms. Proteus mirabilis: Methods and Protocols. , 139-158 (2019).
  46. Clarke, O. E., et al. Lipopolysaccharide structure modulates cationic biocide susceptibility and crystalline biofilm formation in Proteus mirabilis. Front Microbiol. 14, 1150625(2023).
  47. Nzakizwanayo, J., et al. Bacteriophage can prevent encrustation and blockage of urinary catheters by proteus mirabilis. Antimicrob Agents Chemother. 60 (3), 1530-1536 (2015).
  48. Slate, A. J., et al. Infection-responsive coatings to reduce biofilm formation and encrustation of urinary catheters. J Appl Microbiol. 134 (6), lxad121(2023).
  49. Maierl, M., Jörger, M., Rosker, P., Reisner, A. In vitro dynamic model of a catheterized bladder and biofilm assay. Bio Protoc. 5 (2), e1381(2015).
  50. Stickler, D., Clayton, C., Chawla, J. The resistance of urinary tract pathogens to chlorhexidine bladder washouts. J Hosp Infect. 10 (1), 28-39 (1987).
  51. King, J., Stickler, D. An assessment of antiseptic bladder washout solutions using a physical model of the catheterized bladder. J Hosp Infect. 18 (3), 179-190 (1991).
  52. King, J., Stickler, D. The effect of repeated instillations of antiseptics on catheter-associated urinary tract infections: A study in a physical model of the catheterized bladder. Urol Res. 20, 403-407 (1992).
  53. Morris, N., Stickler, D. Encrustation of indwelling urethral catheters by Proteus mirabilis biofilms growing in human urine. J Hosp Infect. 39 (3), 227-234 (1998).
  54. Stickler, D., Morgan, S. Observations on the development of the crystalline bacterial biofilms that encrust and block foley catheters. J Hosp Infect. 69 (4), 350-360 (2008).
  55. Stamm, W. E. Catheter-associated urinary tract infections: Epidemiology, pathogenesis, and prevention. Am J Med. 91 (3, Supplement 2), S65-S71 (1991).
  56. Sarigul, N., Korkmaz, F., Kurultak, I. A new artificial urine protocol to better imitate human urine. Sci Rep. 9 (1), 20159(2019).
  57. Brooks, T., Keevil, C. A simple artificial urine for the growth of urinary pathogens. Lett Appl Microbiol. 24 (3), 203-206 (1997).
  58. Ipe, D. S., Horton, E., Ulett, G. C. The basics of bacteriuria: Strategies of microbes for persistence in urine. Front CellI Infect Microbiol. 6 (14), 3389(2016).
  59. Ipe, D. S., Ulett, G. C. Evaluation of the in vitro growth of urinary tract infection-causing gram-negative and gram-positive bacteria in a proposed synthetic human urine (SHU) medium. J Microbioll Methods. 127, 164-171 (2016).
  60. Chutipongtanate, S., Thongboonkerd, V. Systematic comparisons of artificial urine formulas for in vitro cellular study. Anal Biochem. 402 (1), 110-112 (2010).
  61. Saude, E. J., Adamko, D., Rowe, B. H., Marrie, T., Sykes, B. D. Variation of metabolites in normal human urine. Metabolomics. 3, 439-451 (2007).
  62. Andersen, S., et al. Proteomes of uropathogenic Escherichia coli growing in human urine and in j82 urinary bladder cells. Proteomes. 10 (2), 15(2022).
  63. Uppuluri, P., Dinakaran, H., Thomas, D. P., Chaturvedi, A. K., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of Candida albicans biofilms grown in a synthetic urine medium. J Clin Microbiol. 47 (12), 4078-4083 (2009).
  64. Gaston, J. R., et al. Enterococcus faecalis polymicrobial interactions facilitate biofilm formation, antibiotic recalcitrance, and persistent colonization of the catheterized urinary tract. Pathogens. 9 (10), 835(2020).
  65. Warren, J. W., Tenney, J. H., Hoopes, J. M., Muncie, H. L., Anthony, W. C. A prospective microbiologic study of bacteriuria in patients with chronic indwelling urethral catheters. The JI Infect Dis. 146 (6), 719-723 (1982).
  66. Armbruster, C. E., et al. Genome-wide transposon mutagenesis of Proteus mirabilis: Essential genes, fitness factors for catheter-associated urinary tract infection, and the impact of polymicrobial infection on fitness requirements. PLoS Pathog. 13 (6), e1006434(2017).
  67. Armbruster, C. E., et al. The pathogenic potential of Proteus mirabilis is enhanced by other uropathogens during polymicrobial urinary tract infection. Infect Immun. 85 (2), e00808(2017).
  68. Siegman-Igra, Y., Kulka, T., Schwartz, D., Konforti, N. Polymicrobial and monomicrobial bacteraemic urinary tract infection. J Hosp Infect. 28 (1), 49-56 (1994).
  69. Nye, T. M., et al. Microbial co-occurrences on catheters from long-term catheterized patients. Nat Commun. 15 (1), 61(2024).
  70. Hunt, B. C., et al. Metabolic interplay between Proteus mirabilis and Enterococcus faecalis facilitates polymicrobial biofilm formation and invasive disease. mBio. 15, e02164(2024).
  71. Stickler, D., Ganderton, L., King, J., Nettleton, J., Winters, C. Proteus mirabilis biofilms and the encrustation of urethral catheters. Urol Res. 21, 407-411 (1993).
  72. Donlan, R. M. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
  73. Habash, M., Reid, G. Microbial biofilms: Their development and significance for medical device-related infections. J Clin Pharmacol. 39 (9), 887-898 (1999).
  74. Ommen, P., Zobek, N., Meyer, R. L. Quantification of biofilm biomass by staining: Non-toxic safranin can replace the popular crystal violet. J Microbiol Methods. 141, 87-89 (2017).
  75. Wilson, C., et al. Quantitative and qualitative assessment methods for biofilm growth: A mini-review. Research and Reviews: J Eng Technol. 6 (4), 30214915(2017).
  76. Niebergall, A. K., et al. Influence of polymerized siloxane coating on growth and biofilm formation of aerobic grown nosocomial bacteria. J Cell Biotechnol. 3 (2), 107-115 (2018).
  77. Ionescu, A., Brambilla, E., Sighinolfi, M. C., Mattina, R. A new urinary catheter design reduces in vitro biofilm formation by influencing hydrodynamics. J Hosp Infect. 114, 153-162 (2021).
  78. Pelling, H., et al. Bacterial biofilm formation on indwelling urethral catheters. Lett Appl Microbiol. 68 (4), 277-293 (2019).
  79. Schaffer, J. N., Pearson, M. M. Proteus mirabilis and urinary tract infections. Microbiol Spectr. 3 (5), 1128(2015).
  80. Konieczna, I., et al. Bacterial urease and its role in long-lasting human diseases. Curr Protein Pept Sci. 13 (8), 789-806 (2012).
  81. Nzakizwanayo, J., et al. Fluoxetine and thioridazine inhibit efflux and attenuate crystalline biofilm formation by Proteus mirabilis. Sci Rep. 7 (1), 12222(2017).
  82. Strathmann, M., Wingender, J., Flemming, H. C. Application of fluorescently labeled lectins for the visualization and biochemical characterization of polysaccharides in biofilms of Pseudomonas aeruginosa. J Microbiol Methods. 50 (3), 237-248 (2002).
  83. Van Den Driessche, F., Rigole, P., Brackman, G., Coenye, T. Optimization of resazurin-based viability staining for quantification of microbial biofilms. J Microbiol Methods. 98, 31-34 (2014).
  84. Trafny, E. A., Lewandowski, R., Zawistowska-Marciniak, I., Stępińska, M. Use of MTT assay for determination of the biofilm formation capacity of microorganisms in metalworking fluids. World J Microbiol Biotechnol. 29, 1635-1643 (2013).
  85. Chapman, J. S. Biocide resistance mechanisms. Int Biodeterior Biodegrad. 51 (2), 133-138 (2003).
  86. Cloete, T. E. Resistance mechanisms of bacteria to antimicrobial compounds. Int Biodeterior Biodegrad. 51 (4), 277-282 (2003).
  87. Maillard, J. Y. Resistance of bacteria to biocides. Microbiol Spectr. 6 (2), 1128(2018).
  88. Maillard, J. Y. Bacterial resistance to biocides in the healthcare environment: Should it be of genuine concern. J Hosp Infect. 65, 60-72 (2007).

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