フローサイトメトリーを用いた損傷脊髄のミクログリアおよび末梢浸潤マクロファージの同定

サマリー

損傷した脊髄のミクログリア(MG)と末梢浸潤マクロファージ(Mø)の同定は困難です。このプロトコールでは、フローサイトメトリー(FCM)を使用して、それぞれM1様MG、M2様MG、M1様Mø、およびM2様Møを同定しました。この技術は、MGとMøの役割を理解するために、他の中枢神経系疾患にも適用できます。

要約

健康な脊髄では、末梢浸潤マクロファージはほとんど検出されず、ミクログリア(MG)は、食作用による脊髄微小環境の安定性の維持、細胞残骸の除去、神経栄養因子の産生に関与しています。脊髄損傷(SCI)後、MGが活性化され、損傷した脊髄に末梢免疫細胞が浸潤します。これらの免疫細胞の中で、活性化されたMGと末梢浸潤マクロファージ(Mø)は、SCIの病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。これらの細胞は、炎症誘発性(M1様)と抗炎症性(M2様)の表現型に区別できます。しかし、形態や多くの細胞マーカーが類似しているため、それらを区別することは困難です。バイオメディカル分野で広く使用されている技術であるフローサイトメトリー(FCM)は、細胞サイズ、粒子サイズ、細胞表面、細胞内マーカーなどの複数の細胞パラメータを1回の実験で同時に検出することができます。長年の研究を通じて、FCMは脊髄のMGとMøを同定する試みを行い、最終的に安定した検出方法を開発するために継続的に最適化されました。この手法では、CD45、CD11b、CD68、CCR7などのマーカーの発現プロファイルを検出することで、SCI後のM1/M2様MGおよびM1/M2様Møの同定が可能になります。このプロトコルでは、CD11b⁺CD45^−/低CD68⁺CCR7⁺、CD11b⁺CD45^−/低CD68⁺CCR7⁻、CD11b⁺CD45^高CD68⁺CCR7⁺、およびCD11b⁺CD45^高CD68⁺CCR7⁻ 細胞は、それぞれM1様MG、M2様MG、M1様Mø、およびM2様Møとして識別することができる。

概要

脊髄損傷(SCI)は、さまざまな理由によって引き起こされた脊髄損傷の結果です。SCIは障害の発生率が高く、現在、有効な治療選択肢がないため、世界で最も深刻な公衆衛生問題の1つとなっています^1,2。SCIの病態生理学的プロセスは複雑で、2つの段階に分けられます。最初は、損傷による機械的外傷がすぐに急性細胞機能障害と細胞死を引き起こします。その後、二次的な損傷により、数日、数週間、さらには数か月にわたって、細胞の機能不全と細胞死がさらに進みます。二次損傷のメカニズムの中で、炎症は二次損傷の重症度の主要な決定要因であることが証明されており、最終的には細胞死と細胞機能を決定します³。炎症反応の特徴は、損傷した脊髄内の炎症細胞が浸潤して活性化することで、炎症細胞や炎症因子が増加し、炎症性微小環境を作り出し、最終的には脊髄機能障害を引き起こすことです⁴。

中枢神経系(CNS)および末梢浸潤マクロファージのミクログリアは、脊髄損傷(^SCI)5,6後の炎症反応において重要な役割を果たします。中枢神経系の常在マクロファージとして、ミクログリアはCNS細胞の5%-10%を占め、SCIの回復に不可欠である^7,8。ミクログリアは、SCI後に細胞の破片を飲み込んで除去し、治癒瘢痕の形成を媒介することができる^9,10。しかし、ミクログリアの過剰な活性化は持続的な炎症反応を引き起こし、グリア瘢痕の形成を促進し、軸索再生を妨げる^{可能性があります11}。SCI後、活性化ミクログリアは主にM1様とM2様の2つの表現型を示します^12,13。M1様表現型は炎症誘発性であり、細胞のアポトーシスおよび二次損傷に寄与する炎症因子の合成を促進する。M1様ミクログリアも神経毒性作用を持ち、損傷やニューロンのアポトーシスを悪化させます^14,15。対照的に、M2様表現型は抗炎症特性を持ち、血管新生、再髄鞘形成、軸索成長、および組織修復を促進します^16,17。M2様ミクログリアは、炎症と修復プロセスの調節に重要な役割を果たします。

末梢マクロファージは、損傷した血液脊髄関門および血管系^17,18を介してSCI後の病変部位に浸潤し、炎症反応、食作用、瘢痕形成、および神経組織再生^19,20をさらに調節する。末梢浸潤マクロファージは、SCI後の炎症反応、食作用組織破片²¹、神経再生、およびマトリックスリモデリングを促進することができる。しかし、末梢浸潤マクロファージによって媒介される持続的な炎症反応は、二次的な損傷につながる可能性があり、これは長期的な回復に有害である^22,23。M1様末梢浸潤マクロファージは、強力な食作用および抗原提示能力を有し、壊死細胞を透明化することができる²⁴。しかし、炎症誘発性サイトカイン、活性酸素種(ROS)、および活性窒素種(RNS)の過剰な分泌は、ニューロンやグリア細胞に損傷を与え、より深刻なニューロンアポトーシスを引き起こす可能性があります²⁵。逆に、M2様末梢浸潤マクロファージは、ニューロンのアポトーシスを阻害し、SCI後の炎症反応を緩和し、それによって神経組織の修復を促進することができる²⁶。

SCI後に活性化されたミクログリアと末梢浸潤するマクロファージは、形態学的および分子的発現の類似性を示し、それらを区別するのが困難です。フローサイトメトリー(FCM)は、広く採用されている技術であり、細胞表面および細胞内分子の発現を解析し、異なる細胞亜集団を同定し、同時に個々の細胞の複数のパラメータを評価するために採用されています。活性化されたミクログリアと末梢浸潤するマクロファージを区別するために、安定したFCMアッセイが追求されており、SCIにおけるそれらの役割の研究が容易になっています。本稿では、これまでに開発された安定した検出方法について解説します。

プロトコル

この研究は、蚌埠医科大学の動物ケア倫理委員会(No.2020-050)によって承認されました。動物の世話は、中国科学技術省によって規定された規制に準拠していました。合計18匹の8週齢の雌C57/BL6マウスを商業的に入手し、使用しました。試薬や使用した機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 実験および動物の準備

1. 手術前にマウスを換気ケージに収容します。12時間の明暗サイクルを維持し、食料と水への無料アクセスを提供します。環境室温を20〜22°C、湿度を30%〜70%に保ち、1週間の順応を行います。
2. マウスの手術器具をオートクレーブ滅菌し、使用前に乾燥させます。手術の30分前に器具と動物手術室を紫外線滅菌してください。ランダムなグループ化の原則に従ってマウスをグループ化し、ラベルを付けます。後で使用するために、ウェイトを記録して登録します。
3. 腹腔内注射により、ケタミン (80 mg/kg) とキシラジン (10 mg/kg) のカクテルでマウスに麻酔をかけます (施設で承認されたプロトコルに従います)。T8からT10の椎骨から背中の毛を剃ります。

2. SCIマウスモデルの準備

1. T9を中心に、頭から尻尾までヨウ素スワブを使用して手術部位を消毒し、続いて75%アルコールスワブで消毒します。T9を中心に皮膚に1cmの切開を行います。T9の周囲の筋膜、筋肉、靭帯を1cm解剖します。
   1. T9棘突起に隣接する筋肉を切り離して、T9を露出させます。眼科用ハサミを使用して、T9とT10の間の椎弓を覆って取り除き、直径約2mmのT9にある脊髄を完全に露出させます。
      注意: T9椎弓板を持ち上げるときは、はさみが脊髄に触れないように注意してください。
2. T7とT11の棘突起をクランプして脊椎を安定させます。直径1.3mm、力0.5Nのロッドを使用して、中程度のSCIモデルを作成します。SCI後に尾が上向きに曲がり、後肢がけいれんする様子を観察します。偽手術マウスの場合は、挫傷を伴わずに椎弓切除術のみを行います。
3. 切開部位で止血を達成します。滅菌済みの5-0外科用縫合糸を使用して層状閉鎖を行います。筋肉の近似のために、歯付きアドソン鉗子で深部筋膜をつかみ、5-0吸収性モノフィラメントを使用してパンニクルスカルノサス層を縫合し、針を創傷端から垂直に2mm挿入して、3mm間隔で対称的な全層バイト(深さ2-3mm)を実現します。
   1. 制御された張力で四角い結び目を結び、筋膜面を解剖学的に整列させます。マイクロアイリスハサミを使用して皮膚の端を再配置し、1mmの表皮外転を作成します。真皮を時計職人の鉗子に正確に合わせ、2mm間隔でシンプルな中断された5-0非吸収性縫合糸で固定し、皮下デッドスペースのない均一な凝固を確保します。
   2. 創傷の中心から外側に向かって一方向のストロークを使用して、ヨウ素スワブで縫合糸ラインを消毒します。生理食塩水で湿らせたガーゼで残った血液をやさしくたたき、切開部に沿ってトリプル抗生物質軟膏の薄層を塗ります。
4. 手術後、マウスを適切な温度と湿度に保たれたケージに入れます。1日2回(朝と夕方)の排尿ケアを行い、マウスが自立した排尿を取り戻すまでマウスを支援します。
5. 感染を防ぐために、各マウスに毎日0.5 mLの生理食塩水と抗生物質(ゲンタマイシン、2000-2500 U /マウス)を皮下注射します。

3. C57/BL6マウスからの脊髄組織の単離

1. 手術前にマウスに麻酔をかけます(ステップ1.3)。完全に麻酔をかけたら、仰臥位で手術台に固定します。偽マウスも同様に扱われます。
2. 胸腔内、胸骨の下、横隔膜に沿って横切開を行い、心臓を露出させます。止血剤で心臓を穏やかに安定させ、灌流カニューレを頂端左心室に挿入し、大動脈に進めます。
   1. 直ちに右耳介を切断し、10 mL の PBS 溶液で 250 mL/h の速度で灌流を開始します。灌流は、右耳介から排出される液体が血まみれの赤から透明で無色に変わるとき、または肝臓が赤から白に移行するときに成功したと見なされます²⁷。
3. マウスの尾端で脊椎を横断して、椎骨孔を露出させます。眼科用ハサミを使用して、損傷部位の上下0.5cmの脊髄組織を慎重に解剖します。単離した脊髄組織を、5%染色バッファーを含む無菌の酵素フリー培養皿に入れ、後でコロイダルシリカ被覆ポリビニルピロリドン(PVP)密度勾配遠心分離で使用するために4°Cの氷上に保存します。
   注意: 損傷中心の近くで脊髄を解剖するときは、損傷部位の脊髄が裂けたり損傷したりしないように、組織の完全性を確認してください。5% Staining Buffer (SB) は、2.5 mL のウシ胎児血清 (FBS) と 47.5 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で構成されています。

4. ポリビニルピロリドンをコーティングしたコロイダルシリカを用いた密度勾配遠心分離

1. 脊髄組織を300メッシュのセルストレーナーに入れ、5 mL/10 mLの使い捨てシリンジのプランジャーを使用して粉砕します。粉砕後、細胞懸濁液を300メッシュストレーナで15 mLの遠心チューブにろ過し、遠心分離します(5分間、110 x g、室温)。
   1. 遠心分離後、1 mLのトリプシン細胞消化溶液を細胞沈殿物に加え、細胞培養インキュベーターで37°Cで15分間インキュベートします。1.5 mLのウシ胎児血清を加えて消化を停止し、再度遠心分離します(110 x g、5分間、室温)。細胞沈殿物を1 mLの5%染色バッファー(SB)に再懸濁します。
2. 70%コロイド状シリカ被覆ポリビニルピロリドン溶液4mL、30%コロイド状シリカ被覆ポリビニルピロリドン溶液4mL、および5%SB再懸濁細胞溶液1mLを15mL遠心チューブに順次加えます。混合物を遠心分離します(300 x g、30分、20°C)。
   注:コロイダルシリカ被覆ポリビニルピロリドン分離試薬を、コロイダルシリカ被覆ポリビニルピロリドンと10×PBSの9:1混合物として調製します。70%コロイド状シリカ被覆ポリビニルピロリドン溶液を1×PBSで希釈し、30%コロイド状シリカ被覆ポリビニルピロリドン溶液をDMEMまたはRPMI 1640細胞培養培地で希釈します。
3. 遠心分離後、細胞は遠心チューブ内に層を形成します(図1)。8 mLのキャリブレーションマークより上の細胞残骸と血小板層を廃棄します。残りの溶液(1.5 mLのキャリブレーションマークまで)を慎重に吸引し、マークの下の沈殿物を廃棄します。
   1. 残りの溶液を新しい15 mL遠心チューブに移し、1× PBSを加えて、遠心分離(400 x g、5分、4°C)のために総容量を15 mLにします。
4. 上清を捨て、細胞沈殿物を5% SBに再懸濁し、溶液をフローサイトメトリー(FCM)チューブに移し、洗浄および遠心分離(110 x g、5分、4°C)します。細胞沈殿物をFCMチューブ内に200μLの5%SBで再懸濁します。

5. FCM染色

1. 200 μLの細胞懸濁液を2つの新しいフローサイトメトリーチューブに均等に分割します。一方のチューブに「Isotype Control」とラベルを付け、もう一方に「Specific Staining」とラベルを付けます。
2. 染色手順
   1. 「アイソタイプコントロール」チューブに、PE標識ラットIgG2bカッパ、FITC標識ラットIgG2bカッパ、APC標識ラットIgG2bカッパ、およびAPC-eFluor 780標識ラットIgG2bカッパのアイソタイプマッチ抗体を追加します。
   2. 「Specific Staining」チューブに、推奨希釈比に従って蛍光標識抗体のパネルを添加します:Rat anti-mouse CD45 APC、Rat anti-mouse CD11b PE、Rat anti-mouse CD68 FITC、Rat anti-mouse CCR7 APC-eFluor 780。
   3. チューブを室温で、光から保護して30分間インキュベートします。
3. 染色した細胞を2回洗浄し、毎回1 mLのSBを加えます。細胞を遠心分離します(110 x g、5分、4°C)。最後に、フローサイトメトリー分析のために細胞を2%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定します。

6. FCM検出

注: 手順の詳細については、前のレポート^27,28 を参照してください。

1. フローサイトメーターと互換性のあるソフトウェアを使用してサンプルを解析します( 材料表を参照)。
   1. まず、アイソタイプコントロールチューブを分析して、プライマリグラフ(x軸にFSC、y軸にSSC)を確立します。前方散乱(FSC)と側方散乱(SSC)の電圧を調整して、細胞集団を適切な範囲内に配置します。
   2. 2つの追加グラフを設定します:1つはX軸にIgG-APC、Y軸にIgG-PEです。もう1つは、x軸にIgG-FITCを、y軸にIgG APC-Cy7(注:APC-eFluor 780はこのチャネルで検出されました)です。
   3. IgG-APC、IgG-PE、IgG-FITC、およびIgG APC-Cy7の蛍光チャネル電圧を調整して、細胞集団をダブルネガティブ領域の10:³ 内に配置します。
2. アイソタイプコントロールチューブを使用してFSCおよびSSC電圧、および蛍光チャネル電圧を調整および最適化した後は、これらの設定を変更しないままにする必要があります。抗体染色した実験チューブの解析に進みます。
   1. CD11b-PEをx軸に、SSCをy軸にプライマリグラフを作成します。CD68-FITC を x 軸に、CCR7 APC-Cy7 を y 軸に別のグラフを設定します。アイソタイプコントロールチューブを基準として、ベースライン値を設定し、CD11b⁺ 細胞の「領域」を描きます。プライマリグラフで、CD11b⁺ 細胞領域をゲートし、それを「P₁ ゲート」と定義します。
   2. 次に、CD68-FITCをx軸に、CCR7 APC-Cy7をy軸にしたグラフを選択します。右クリックして [人口の表示] を選択し、[P1] を選択します。これにより、CD68⁺/CCR7⁺またはCD68⁺/CCR7^-のいずれかを発現するCD11b⁺グループ内の細胞集団が表示されます。サンプルごとに 50,000 個のイベントを収集します。
   3. データを取得した後、必要に応じて蛍光補正を調整します。CD11b⁺ CD68⁺ CCR7⁺ (M1様)細胞およびCD11b⁺ CD68⁺ CCR7^- (M2様)細胞の割合を解析し、決定します。陽性とマークされた細胞の平均パーセンテージは、全サンプル集団のパーセンテージとして表されます。
3. アイソタイプコントロールチューブから十分に調整された電圧パラメータを使用して、実験チューブの分析を進めます。
   1. まず、CD45-APCとCD11b-PEのグラフを作成し、続いてCD68-FITCとCCR7 APC-Cy7の2つのグラフを作成します。サンプルごとに50,000のイベントを収集し、データを取得した後、蛍光補償を調整します。
   2. CD45/CD11b擬似カラープロットで、各サンプルのCD11b+ CD45^−/low およびCD11b⁺ CD45^高 細胞の「領域」を分析します。次に、これら2つの領域内のCD68⁺ CCR7⁺ 細胞とCD68⁺ CCR7^- 細胞を分析します。
   3. 解析を統合して、次の細胞集団の割合を決定します: CD11b⁺ CD45^−/低 CD68⁺ CCR7⁺ (M1 様ミクログリア)、CD11b⁺ CD45^−/低 CD68⁺ CCR7^- (M2 様ミクログリア)、CD11b⁺ CD45^高 CD68⁺ CCR7⁺ (M1 様マクロファージ)、CD11b⁺ CD45high CD68⁺ CCR7^- (M2 様マクロファージ)。
      注:陽性とマークされた細胞の平均パーセンテージは、全サンプル母集団のパーセンテージとして表されます。

7. FCMデータ解析

1. フローサイトメトリー解析ソフトウェアを起動し、フローサイトメトリー実験ファイルをインターフェースの「All Samples」セクションにドラッグします。フローサイトメトリーの実験は、インターフェースの「All Samples」の下に表示されます。まず、アイソタイプコントロールチューブを分析して、正と負の蛍光シグナルの間の閾値を決定します。
   1. アイソタイプコントロールチューブサンプルをダブルクリックすると、2次元のドットプロットを表示するグラフィカルウィンドウが表示されます。 x軸にFSC-A、y軸にSSC-Aを選択します。インターフェイスの上部にある[Rectangular Gate]ボタンをクリックし、四角形を使用して、細胞の破片を除去した後の領域を選択します(図2A)。
   2. 選択した領域をダブルクリックすると、新しいグラフィカルウィンドウが生成されます。X 軸に FITC を選択し、Y 軸に Histogram を選択します。インターフェースの上部にある Region Gate ボタンをクリックして、単一パラメータヒストグラムにゲートを設定し、ネガティブ蛍光シグナルとポジティブ蛍光シグナルの間の閾値を決定します。領域ゲートは正の領域を定義します(図2A)。
      注意: FSC値が小さい領域は、細胞の破片を表します。
   3. 実験で使用した4つの蛍光抗体のそれぞれについて、アイソタイプコントロールチューブサンプルを使用して、陰性シグナルと陽性シグナルの間の閾値を決定します。X 軸で、蛍光色素を PE、APC、および APC-Cy7 に順次変更し、Y 軸をヒストグラムのままにします。
   4. 単一パラメータヒストグラムの 領域ゲート ツールを使用してゲートを設定し、4つの蛍光抗体のそれぞれについて陰性シグナルと陽性シグナルの間の閾値を決定します(図2A)。
2. M1様細胞とM2様細胞の割合を解析するには:
   1. 実験用チューブサンプルをダブルクリックすると、2次元のドットプロットが表示されます。x軸にFSC-A、y軸にSSC-Aを選択します。インターフェイスの上部にある[Rectangular Gate]ボタンをクリックし、四角形を使用して、細胞の破片を除去した後の領域を選択します(図2B)。
   2. 選択した領域をダブルクリックすると、新しいグラフィカルウィンドウが生成されます。 x軸はCD11b-PE、y軸はSSC-Aを選択します。インターフェースの上部にある「Rectangular Gate」ボタンをクリックし、アイソタイプ制御によって設定されたPEの正/負のしきい値を参照として使用して、CD11b⁺ゲートを定義します(図2B)。
   3. CD11b⁺ ゲート領域をダブルクリックして、新しいグラフィカル ウィンドウを生成します。x軸はCD68-FITC、y軸はCCR7 APC-Cy7を選択します。「Cross Gate」ボタンをクリックします。アイソタイプコントロールによって設定されたFITCおよびAPC-Cy7の陽性/陰性の閾値を基準として、クロスゲートを使用して細胞を分類し、CD11b + CD68+ CCR7+(M1様)細胞とCD11b ⁺ CD68⁺ CCR7^-(M2様)細胞の割合を決定します(図2B)。
      注:M1様マクロファージ(M1様Mø)、M2様マクロファージ(M2様Mø)、M1様ミクログリア(M1様MG)、およびM2様ミクログリア(M2様MG)の割合を分析するためのゲーティング原理は、M1様およびM2様細胞の解析に用いたものと一致しています。正と負の蛍光シグナルを区別するための閾値は、ゲートを設定するための基準として機能するアイソタイプコントロールチューブに基づいています。ソフトウェアの操作プロセスを 図2Bに示し、細胞比率を決定するために用いるマーカー発現プロファイルについては、代表結果セクションで詳細に説明しています。

結果

脊髄組織からの免疫細胞は、ポリビニルピロリドン密度勾配遠心分離でコーティングされたコロイド状シリカを使用して分離されます。遠心分離プロセスでは、細胞は浮力密度に応じて異なる層に分布し、細胞分離が達成されます(図1)。上から順に、細胞破片、単核細胞に富む層、リンパ球に富む層、そして下部に赤血球と顆粒球の層が分布しています。

M1様細胞およびM2様細胞のFCM解析は、CD68、CD45、CD11b、およびCCR7からなる細胞マーカー発現プロファイルを利用します^29,30。CD11b⁺ CD68⁺ CCR7⁺を発現する細胞はM1様細胞と定義され、CD11b⁺ CD68⁺ CCR7^-細胞はM2様細胞と定義されます。また、CD11b⁺CD45⁻...

ディスカッション

SCI動物モデルの作成を成功させることが不可欠です。SCIモデルは、T9セグメントの脊髄を0.5Nの力にさらすことによって確立されました。動物モデルの成功は、マウスの尾が丸くなり、両方の後肢がけいれんを起こし、後肢が麻痺してマウスがSCI後に歩くことが不可能になることによって実証されました(ステップ2.3を参照)。術後のケアは、マウスの生存にとって重要です。マウスが独立して排尿できるようになるまで、排尿ケアが行われます。感染による尿中の血液を防ぐことも必要です。マウスの後肢の腫れや感染は手術後に予防する必要があり、致命的な結果を避けるためにマウスが後肢をかじるのを防ぐための対策を講じる必要があります(ステップ2.5を参照)。

粉砕後の脊髄組織を遠心分離した後に得られた細胞ペレットをトリプシンで消化して細胞接着を防ぎ、単一細胞懸濁液を実現します(ステップ4.1を参照)。密度勾配は、ポリビニルピロリドン溶液でコーティングされた70%のコロイダルシリカとポリビニルピロリドン溶液でコーティングされた30%のコロイダルシリカ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1×PBSの	ソーラービオ	P1020
10&回;PBSの	ソーラービオ	P1022
18 匹の 8 週間齢の雌 C57/BL6 マウス	Cavens Laboratory Animal Ltd、Chang Zhou、中国
APC-eFluor 780標識ラット抗マウスCCR7(IgG2bカッパ)	インビトロゲン	47-1971-82	0.25&ミュー;g/テスト
APC-eFluor 780 標識ラット IgG2b kappa アイソタイプコントロール	インビトロゲン	47-4321-82	0.25&ミュー;g/テスト
APC標識ラット抗マウスCD45(IgG2bカッパ)	インビトロゲン	17-0451-82	0.125&ミュー;g/テスト
APC標識ラットIgG2b kappa アイソタイプコントロール	インビトロゲン	17-4031-82	0.125&ミュー;g/テスト
DMEMの	ギブコ	11965092
ウシ胎児血清	ロンセラ	S711-001
FITC 標識ラット抗マウス CD68 (IgG2b κ)	インビトロゲン	MA5-16676	0.25&ミュー;g/テスト
FITC 標識ラット IgG2b kappa アイソタイプコントロール	インビトロゲン	11-4031-82	0.25&ミュー;g/テスト
パラホルムアルデヒド	バイオシャープ	23319084
PE標識ラット抗マウスCD11b(IgG2bカッパ)	インビトロゲン	12-0112-81	0.25&ミュー;g/テスト
PE標識ラットIgG2bカッパ アイソタイプコントロール	インビトロゲン	12-4031-82	0.25&ミュー;g/テスト
パーコール	ソーラービオ	P8370
トリプシン溶液	バイオシャープ	BL526A型