ここでは、無細胞合成生物学の原理と、ヒトおよび動物の血清における抗体応答のカスタマイズ可能な検出のためのドットブロット技術に基づいて最近開発されたイムノアッセイプラットフォームについて説明します。
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方法論記事
ヒトおよび動物の血清中の抗体応答を検出するための実用的で適応性の高いイムノアッセイプラットフォームとしての無細胞ドットブロット
この記事について
サマリー
要約
過去20年間にわたる一連の世界的な病原性アウトブレイクは、血清監視戦略の重要性を浮き彫りにしています。患者の血清中の疾患特異的抗体を検出するのに役立つイムノアッセイプラットフォームは、血清サーベイランスの中核をなすものです。一般的な例としては、酵素結合免疫吸着アッセイやラテラルフローアッセイなどがあります。しかし、これらはゴールドスタンダードの方法ですが、病原体に特化した消耗品や特殊な機器が必要なため、リソースの豊富な研究所以外での使用は限られています。
私たちは最近、Cell-Free Dot-Blot (CFDB) と呼ばれる新しい免疫測定プラットフォームを開発し、SARS-CoV-2 に対するヒトおよび動物の血清を使用して検証しました。従来のイムノアッセイとは異なり、CFDB患者の血清サンプルは固相(ニトロセルロース膜)に固定化され、標的抗原はアッセイの移動相に懸濁されます。セロサーベイランス機能へのアクセスを改善するために、CFDB抗原はオンデマンドで、 in vitro タンパク質発現を使用して低負荷のインフラストラクチャで産生されます。ここでは、抗原はペプチドタグと融合しており、任意のCFDBアッセイで単一のユニバーサルレポータータンパク質を使用して検出できます。その結果、CFDBはマルチウェルプレートリーダーや精製された市販の分子アッセイコンポーネントにアクセスする必要がありません。これらの設計上の考慮事項により、CFDBは、非中央集権的な研究所へのアクセス性、新興病原体への適応性、および低所得コミュニティ向けの手頃な価格を提供することにより、既存の免疫測定プラットフォームの欠点に対処します。
本稿では、CFDBイムノアッセイを調製および実施するためのステップバイステップのプロトコルを提供します。SARS-CoV-2 CFDBに関する最近の研究を例にとり、オンデマンドの無細胞生産のための抗原DNA設計、CFDBレポータータンパク質の調製、固相への血清サンプルの固定化、そして最後にアッセイの抗原結合と検出ステップについて説明します。これらの指示に従うことで、研究者はCFDBアッセイを適応させて、任意の病原体に対するヒトおよび動物の血清中の免疫応答を検出できると期待しています。
概要
COVID-19のパンデミックにより、特にリソースの少ない環境に対して、手頃な価格でスケーラブルな診断ツールが不可欠であることが明らかになりました1。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)のような従来の免疫アッセイは、免疫応答の検出に不可欠であることが証明されています2,3。しかし、その高コスト、複雑な試薬への依存、特殊な機器への依存は、特に世界的な健康危機の際には、その入手を制限します。これらの課題に対応するため、ヒトおよび動物血清中の抗SARS-CoV-2抗体を検出するために設計された低コストで適応性の高い免疫測定プラットフォームであるCell-Free Dot Blot(CFDB)を開発しました。
CFDBは、無細胞合成生物学を活用して、直鎖状DNAテンプレート4,5を用いたウイルス抗原の迅速かつオンデマンドな生産を行っています。これにより、従来の細胞ベースのクローニング、発現、精製プロセスが不要になり、抗原産生が大幅にスピードアップし、コストが削減されます。CFDB法では、血清をニトロセルロースメンブレンに直接スポットするドットブロットフォーマットを使用することで、抗体の検出を簡素化します。このシステムにより、高価なマルチウェルプレートや特殊なラボ機器が不要になり、インキュベーションと洗浄のステップにおけるシンプルな「ディッピング」ワークフローが可能になります。このプラットフォームは、SpyCatcher-SpyTagシステムも利用しており、SpyCatcher2-Apex2ペルオキシダーゼキメラが汎用的な二次検出試薬として作用します5,6。これは、標準的な大腸菌ベースの発現を使用して製造されるため、高価な市販の抗体コンジュゲートへの依存が排除されます。その結果、CFDBシステムは、市販のELISAキット5の300米ドル以上と比較して、96サンプルアッセイあたり約3米ドルという大幅に低いコストで、ELISAに匹敵する性能で血清学的アッセイを実施できます。
CFDBの有効性を実証するために、事前に特徴付けられたヒトおよび動物の血清中の抗体を検出する能力をテストしました。私たちの結果は、COVID-19陽性および陰性のサンプルを特定する際にELISAと密接に関連していました。ヒトの診断に加えて、SARS-CoV-2に感染したハムスターと組換えヌクレオカプシドタンパク質をワクチン接種したハムスターの血清を試験し、動物モデルにおけるCFDBの有用性を評価しました。これらの試験により、CFDBがヒトと獣医の両方の診断に使用できる可能性が確認され、種を超えた免疫応答をモニタリングするための汎用性の高いツールとなりました。CFDBの主な利点の1つは、その柔軟性です。目的の抗原をコードするDNAテンプレートを変更するだけで、このプラットフォームはさまざまな病原体に対する抗体を検出するために迅速に適応させることができ、将来のパンデミックへの備えに役立ちます。その低コスト、シンプルなワークフロー、最小限のインフラストラクチャ要件により、商用診断へのアクセスが制限されている分散型の研究所やリソースの少ない環境に特に適しています。
この作業では、CFDBアッセイの準備と実施について、段階的に説明します。まず、アッセイの主要な検出試薬である抗原を無細胞で生産するための線状DNAテンプレートの設計と合成について説明します。次に、アッセイの二次検出試薬SpyCatcher2-Apex2の調製手順について説明します。その後、無細胞生産の指示と抗原自体の品質チェックを行います。最後に、ヒトまたは動物の血清サンプルでCFDBアッセイを実施するプロセスについて詳しく説明します。
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プロトコル
すべてのハムスターの実験は、カナダ公衆衛生庁の国立微生物学研究所(NML)で行われ、カナダ人間動物衛生科学センターによって承認され、カナダ動物ケア評議会のガイドラインに従って行われました。すべてのヒト血清/血漿サンプルは、社内試験のために商業的に取得されたか、または臨床協力者によってNMLに提供され、NMLでの独立した試験が行われました。
1. 抗原線状発現テンプレート(LET)の設計と調製
- Norouzi et al.7 の指示に基づき、Norouzi et al.5 に記載されている N/C 末端 SpyTag を含む標的抗原の無細胞発現 LET を設計します。
注:ここでは、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質(NP、アミノ酸2-419)の調製について詳しく説明します。- SARS-CoV-2 NP の LET (図 1 および 補足ファイル 1) に、T7 プロモーターの前と終止コドンの後に 50 塩基対のバッファー配列を持つ 5' および 3' Ter サイトが含まれていることを確認します。
- N末端のNPタンパク質にHis 6-SpyTag-TEVをタグします。
- UniProtデータベース(アクセッションコードP0DTC9)からタンパク質配列を取得し、IDTコドン最適化ツール8を使用して大腸菌ベースの発現用にコドン最適化します。この配列を、10 ng/μLの水に再懸濁した一本鎖DNAフラグメントとして商業合成のためにご注文ください。
注:TEVプロテアーゼ切断部位とHis6 タグは、LET設計の重要な機能ではありません。
- PCRは、ユニバーサルTer FW(GGCTCCGAATAAGTATGTTGTAACTAAAGTGCGGCC)でDNA断片を増幅します。
ACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCG) と Ter RV (CCGAGGCAAGTATATGTTGTAACTAAAGTGCTCAG
CTTCCTTTCGGGCTTTTTGTTAGCAGCC)プライマーをハイフィデリティDNAポリメラーゼキット( 材料表を参照)を使用- 100 μL の反応液を次のように設定します: ヌクレアーゼフリー水 75 μL、5x DNA ポリメラーゼバッファー 20 μL、10 mM dNTP 2 μL (最終濃度 200 μM)、0.5 μL 100 μM Ter-FW プライマー、0.5 μL 100 μM Ter-RV プライマー、10 ng/μL 一本鎖 LET 1 μL、1 μL(2U) DNA ポリメラーゼ。
- 以下のPCR設定を使用してください:98°Cで30秒間の初期変性。35サイクル:98°Cで6秒、60°Cで15秒、72°Cで90秒。4°Cで保持します。
- 市販のPCR精製キットを使用してPCR産物を精製し、1%アガロースゲルでサンプルを泳動して品質を確認し、UV-Vis分光光度計でその濃度を測定します。
注:粗PCR産物は、無細胞発現に直接使用することもできます。しかし、精製により、より標準化された手順が可能になります。
図1:SARS-CoV-2-NPの線形発現テンプレート。 His-SpyTag-SARS-CoV-2 NP直鎖状DNAテンプレートの特徴を表す概略図。主要なDNAテンプレートエレメントがラベル付けされています。目的のタンパク質(ここではNP)のコード配列は、効率的な発現のためにT7プロモーターの転写制御下に置かれます。N末端で、NPタンパク質にSpyTagを付加し、SpyCatcher2-Apex2検出試薬を使用して特異的に検出します。x6His-tagおよびTEVプロテアーゼ部位は、一般的なLET設計の一部として含まれていますが、CFDBの目的には不要です。直鎖状DNAテンプレートの末端には、それぞれ50の塩基対バッファー配列が先行する「上流」および「下流」のTerサイトが含まれており、無細胞ライセート中の外核分解性DNA分解に対するTusを介した保護のために含まれています。略語:NP =ヌクレオカプシドタンパク質;LET = 線形式テンプレート;TEV = タバコエッチングウイルス;CFDB = 無細胞ドットブロット。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2. SpyCatcher2-Apex2レポータータンパク質の精製
- Norouzi et al.5 で最初に構築されたpET24b-SpyCatcher2-Apex2プラスミド( Supplemental File 2 の全配列および Supplemental Figure S1のプラスミドマップ)を使用して、SpyCatcher2-Apex-2レポータータンパク質を調製します。
- 寒天プレートと50 μg/mLのカナマイシンを含む溶解ブロス(LB)を調製します。 大腸菌 BL21(DE3)細胞をpET24b-SpyCatcher2-Apex2プラスミドで形質転換します。15 mLのスターターLB培養物に1つのコロニーを接種し、250 RPMで振とうしながら37°Cで一晩増殖します。
- 翌日、50 μg/mL カナマイシンを含む新鮮な LB 培地 500 mL に 10 mL のスターター培養液を加えます。250 RPMで振とうしながら37°Cでインキュベートし、培養物が600 nmで0.6-0.8(~3時間)の光学密度に達するまでインキュベートします。
- 0.5 mM イソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシドと 1 mM 5-アミノレブリン酸塩酸塩を培養液に添加することにより、SpyCatcher2-Apex2 の発現を誘導します。増殖温度を30°Cに下げ、培養物をさらに4時間インキュベートします。
- 8,000 × g で15分間遠心分離することにより、細菌を回収します。細胞溶解に進むか、または使用するまでペレットを-80°Cで保存します。
- 50 mM Tris-HCl(pH 7.8)、300 mM NaCl、1 mg/mLリゾチーム、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤錠剤、および1 mMジチオスレイトール(DTT)を含む20 mLの溶解緩衝液にペレットを再懸濁します。50 秒の振幅で超音波処理を行い、5 秒の ON および 10 秒の OFF 間隔で細胞を溶解し、合計 ON 時間 3 分にします。
- ライセートを20,000 × g 、4°Cで1時間遠心分離して清澄化します。 上清を0.2μmシリンジフィルターに通します。
- 清澄化したライセートに最終濃度250 μMの塩化ヘミンを添加し、4 °Cで一晩インキュベートします。 タンパク質精製に進みます。
注:ヘミンクロリドとのインキュベーションにより、ヘムがApex-2ペルオキシダーゼに最大化され、最適な酵素活性が得られます。 - 清澄化したライセートに2.5 mLのNiレジンを加え、4°Cで45分間穏やかに振とうしながらインキュベートします。混合物を重力フローカラムに塗布し、50 mLのTrisバッファー(50 mM Tris-HCl(pH 7.8)、300 mM NaCl、および1 mM DTT)でレジンを洗浄します。
- SpyCatcher2-Apex2タンパク質を、400 mMイミダゾールを含む25 mLのTrisバッファーで溶出します。濃縮液とバッファーは、遠心フィルターユニットを使用して溶出液をトリスバッファーに交換し、最終容量0.5〜1.0 mLを目指します。
- SpyCatcher2-Apex2 (27,390 M-1 cm-1) のモル吸光係数を使用して、UV-Vis 分光光度計でタンパク質濃度を決定します。グリセロールを最終濃度40%まで添加し、アリコートを-20°Cで保存します。
注:このプロトコルでは、標準的な96サンプルブロットサイズで400 CFDBの実行に十分な、約40 mgの高純度で活性なSpyCatcher2-Apex2が得られることが期待されます。 - 従来のウェスタンブロット9 を使用したSpyTaggedタンパク質の検出、およびCFDB実験では、0.05% Tween-20(TBST)を含む1x Tris緩衝生理食塩水中の5%無脂粉乳中のメンブレンを常にブロックしてください。SpyCatcher2-Apex2タンパク質を最終濃度10 μg/mLのブロッキング溶液で使用してください。
注:SpyCatcher2-Apex2レポーターは、シグナル開発のために強化された化学発光(ECL)ソリューションを必要とします。ECL溶液は、市販して入手することも、Mruk et al.10の指示に従って社内で調製することもできます。ここでの最終的なECL溶液は、0.4 mM p-クマル酸、2.5 mMルミノール、および0.015% H2O2 in 100 mM Tris-HCl(pH 8.6)で構成されています。
3. 無細胞での抗原生産と品質確認
- Levine et al.11およびNorouzi et al.5の指示に従って、大腸菌BL21の無細胞発現ライセートおよび反応成分を調製し、組み立てます。代表的な100 μLの反応には、最終反応混合物に5 μM Tusタンパク質と1.2 μM T7 RNAポリメラーゼを次のように添加します:14.6 μLの溶液A、14 μLの溶液B、33.3 μLの大腸菌BL21ライセート、2.5 μLの200 mM Tusタンパク質、1.2 μLの100 mM T7 RNAポリメラーゼ、 1 μL の 1.5 μM 直鎖状 DNA テンプレート、33.4 μL のヌクレアーゼフリー水。
注:大腸菌BL21無細胞溶解物の調製に関する主要な指示については補足ファイル3を、溶液AおよびBの詳細なレシピについては補足表S1を参照してください。 - PCRチューブ内の無細胞反応に10%(v/v)粗PCR産物を添加することにより、最初の5 μLスケールの発現試験を実施します。30°Cで15時間振とうせずにインキュベートします。
- 12%ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)に1 μLの無細胞反応をロードし、その後、ステップ2.12で説明したように、ウェスタンブロット用のニトロセルロースメンブレンに移して、NP抗原の発現品質を確認します。SpyTagによるブロット標識にはSpyCatcher2-Apex2レポータータンパク質を使用し、オプションで標的抗原に対する特異的な市販抗体(ここでは抗SARS-CoV-2-NP)を使用します。
- 1 mLスケールの無細胞反応を15 nMの精製LET生成物とアセンブルし、CFDBアッセイに使用します。発現混合物を15 mLのコニカルチューブ内で、80 RPMで30°C、15時間振とうしながらインキュベートします。 ウェスタンブロットを使用して発現品質を確認し、50 μLアリコートを-20°Cで保存します。
4. 血清サンプル
- ヒト/動物の血清(または血漿)サンプルは、標準的な手順を使用し、機関のヒト研究倫理委員会または動物管理および使用委員会のガイドラインに従って、商業供給源または臨床協力者から、または社内で入手します。汚染のリスクを軽減するために、適切なサンプル前処理対策が講じられていることを確認してください。
注:前処理手段には、溶剤洗剤処理、熱不活化、および血液媒介ウイルスマーカーの試験が含まれる場合があります。全血からの血清および血漿の単離のための有用なプロトコルが利用可能である12。他のイムノアッセイプラットフォームと同様に、最初の感染または疾患発症の早い時期(<3週間)に採取された血清サンプルには、適切なレベルの抗体反応が含まれているとは予想されず、その結果は慎重に扱う必要があります。 - SARS-CoV-2 NP CFDB試薬の品質検証には、米国国立生物標準管理研究所(NIBSC)の世界保健機関(WHO)の抗SARS-CoV-2免疫グロブリンに関する国際リファレンスパネル(COVID-19前x1および抗NP免疫グロブリンのレベルが異なるx4のSARS-CoV-2陽性サンプルを含む)を使用してください13。あるいは、他の供給源から得られた、事前に特徴付けられた健康で陽性の血清サンプルを使用します。
- CFDB実験では、複数の(>3)健康な血清サンプルをプールしてネガティブコントロールサンプルを取得または調製し、精度を高め、結果の解析と解釈を容易にします。
5. 無細胞ドットブロット(CFDB)法
- マスターグリッドイメージファイル(補足図S2)をダウンロードして印刷します。マスターグリッドは、直径2mmの円を12個ずつ含む6 x 6 cmのパターンで、96ウェルプレートと同様のスポッティング能力を提供します。
- グリッドを接着性PCRプレートシーリングフィルムの2つの層の間にしっかりと挟み、外側のグリッド境界に沿ってサイズにカットします。2 mmの生検パンチを使用して、マークされた各円をくり抜きます。
注:このマスターグリッドは、70%エタノールで拭いた後、複数回再利用できます。 - 6.5 x 6.5 cmのニトロセルロースメンブレンをカットし、マスターグリッドの下のきれいな表面に配置し、図2および補足図S3に示すように粘着テープでセットアップを固定します。マーカーペンを使用して、サンプルスポッティング後にメンブレンを切断するためのガイドとして使用するニトロセルロースメンブレン上の最も外側の円の位置をマークします。
- 血清サンプルを1倍リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で1/10に希釈します。マイクロピペットを使用して、各サンプルの0.4 μLの容量を3倍にして、所定のグリッド位置でニトロセルロースメンブレンに分注します。ディスペンスするには、スポットあたり約15秒かかります。
注:各アッセイには、結果の分析に必要となる陰性および陽性のコントロールサンプルの両方を必ず含めてください。 - スポットされたサンプルが結合して乾燥するまで、周囲温度で10分間待ちます。ピンセットを使用して、ニトロセルロース膜を慎重に取り出し、マークされた外側の円に沿って切断します。
- 10 cmのシャーレに10 mLのブロッキング溶液(TBST中の5%脱脂粉乳)でメンブレンを10 mのシャーレで室温で30分間ブロックし、100 RPMで穏やかに振とうします。
- 10 cmのシャーレで、無細胞抗原発現混合物の50 μLアリコートを解凍し、5 mLのブロッキング溶液に加えます。メンブレンをこの抗原含有溶液に直接移し、室温で1時間インキュベートし、100 RPMで振とうします。
注:これは、SpyTagged抗原が抗体含有スポット位置(存在する場合)に結合する主要な検出ステップになります。 - メンブレンをすすぎ、5分間洗浄した後、TBSTで再度すすぎてから、二次検出ステップに進みます。
- 10 μg/mLの精製SpyCatcher2-Apex2タンパク質を含むブロッキングバッファー10 mLでメンブレンを100 RPMで振とうしながら1時間インキュベートします。
- メンブレンをすすぎ、TBSTで2 x 5分間洗浄し、最後にTBSですすぎます。
- パラフィルムをブロットイメージング装置の近くの清潔な作業領域に貼り付けて固定します。ピンセットでメンブレンを軽くたたいて余分な液体を取り除き、パラフィルムの上にメンブレンを置きます。
- 直ちに3 mL(100 μL/cm2)のECL溶液をメンブレンの上に加え、室温で正確に90秒間インキュベートします。
- すぐにメンブレンを直火乾燥し、化学発光適合イメージング装置に移して結果を視覚化します。
注:最適なイメージング時間は、機器によって異なる場合があります。装置のデフォルトの自動取得時間設定を使用し、設定されていない場合は、事前に特性化された血清サンプルを使用して画像取得時間を最適化することをお勧めします。 - 装置の画像解析機能を使用して、ニトロセルロースメンブレン上の3つのブランク(バックグラウンド)位置を含むスポット強度を取得します。スポットあたりの測定量を一定に保ちます。データをスプレッドシートにエクスポートし、各スポット位置に正しくラベルを付けることを忘れないでください。
- 3重のスポット強度の平均と標準偏差(SD)を計算します。次に、すべてのサンプルからニトロセルロース膜のバックグラウンドを差し引きます。
- 次の式を使用して、-/+ 結果の解釈のカットオフ値を取得します。
(ネガティブコントロールの平均)+(ネガティブコントロールの3 x SD)。サンプルの平均強度がカットオフ値を上回っている場合はサンプルを正とし、平均強度がカットオフ値を下回っている場合は負と見なします。
注 : CFDB の手順の概略図を 図 3 に示します。
図2:CFDBアセンブリ。 CFDBマスターグリッドとNCメンブレンアセンブリのセットアップの概略図。マスターグリッドはNCメンブレンに重ねられ、血清サンプルのスポッティングと固定化のための規則的でアドレス指定可能なパターンを提供します。略語:CFDB =無細胞ドットブロット;NC =ニトロセルロース。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:CFDBワークフローの概略図。 CFDBアッセイでは、少量(<0.4 μL)の10倍希釈血清サンプルを、プレカットされたニトロセルロースメンブレン(左パネル)の個別のアドレス指定可能な場所(中央パネル)に手動で分注します。1スポットにつき1つの血清サンプルを三重のスポットに沈着させ、血清の総抗体リザーバーを含むタンパク質含有量を固体NC基質(中央パネルのベージュのスポット)に固定化します。この例では、血清サンプルに含まれる抗NP抗体は、最初にCFDB一次検出試薬SpyTag-NPによって結合され、最後にCFDB二次検出試薬SpyCatcher2-Apex2(右パネル拡大バブル)によって検出されます。この図は、Norouzi et al.5から取得されました。略語:CFDB =無細胞ドットブロット;NP =ヌクレオカプシドタンパク質;LET = 線形表現テンプレート。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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結果
標的抗原の直鎖状発現テンプレートのPCR増幅
SARS-CoV-2 NP LETをPCR増幅するために、プロトコルセクション1.2に記載されているようにユニバーサルTerフォワードプライマーとリバースプライマーを使用し、PCR産物の精製に進む前に、製品の1μLをアガロースゲル(図4)でチェックしました。
図4:線状発現テンプレートのPCR。 Lane 1:1 kb DNA LadderおよびLane 2:His-SpyTag-SARS-CoV-2 NP(1,630 bp)のPCR増幅直鎖状DNAテンプレートを示す1%アガロースゲル。略語:...
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ディスカッション
COVID-19は、感染の発生を制御し、世界の健康戦略を最適化するためのアクセス可能で堅牢な診断の重要性を浮き彫りにしました。防御抗体を検出する血清学的検査は、新しい変異株の感染パターンを追跡し、ホットスポットを特定し、ワクチン開発を指導し、疑わしい症例をトリアージし、脆弱な集団を保護するために不可欠であることが証明されました14。また、パンデミックは、高度な機器を備えた施設のバックログや要件に悩まされ、アクセシビリティのテストにおける不公平さも露呈した15。したがって、現在、焦点は、将来のアウトブレイクに対する世界的な対応を強化することにあり、そのためには、検査の障壁を減らし、予測不可能な脅威に迅速に適応できる新たなイノベーションが必要になります。
CFDBは、患者サンプルを固相に固定化し、抗ウイルス抗体5を検出するための移動相無細胞産生抗原を送達することにより、従来はE...
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開示事項
M.N.とK.P.は、無細胞ドットブロット法の共同発明者です。 この研究に関連する仮特許出願が提出されました（PCT/CA2024/050097、2024年1月出願)。
謝辞
S.S.とR.Z.は、国防高等研究計画局(DARPA)からの資金提供を受けています(契約番号N66001-23-2-4042)。表明された見解、意見、および/または調査結果は著者のものであり、国防総省または米国政府の公式見解または政策を表すものと解釈されるべきではありません。この研究は、CIHR Foundation助成プログラム(201610FDN-375469)、CIHR Canada Research Chair Program(950-231075および950-233107)、Canada First Research Excellence Fundから資金提供を受け、カナダ国防研究開発省のCanada Safety and Security Program(契約39903-200137)からK.P.に資金提供を受ける、CIHR Foundation助成プログラム(201610FDN-375469)、Canada First Research Excellence FundからK.P.への資金提供を受けたK.P.への資金提供によって支援されました。 図1 と 補足図S1 は、SnapGene Viewerを使用して作成されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1 kb DNAラダー | NEB | N3232 | アガロースゲルのサイズマーカーとして使用 |
| 20 | Sigma-Aldrich | LAA21-1KT | 無細胞反応液B |
| の成分 B 2 mm 生検パンチ | インテグラミルテックス | 33-31-P/25 | CFDBマスターグリッド5 |
| -アミノレブリン酸塩酸塩の調製用 | Sigma-Aldrich | A3785 | SpyCatcher2-Apex2 アガロース粉末の誘導用ヘム前駆体 |
| BioShop | AGA002 | の電気泳動分析用 | |
| Sinobiological | 40588-T62 | 無細胞産生NP抗原のWB検出用 | |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | N/A | ゲルイメージャー装置 |
| 遠心濃縮器 | Cytiva | 28-9323-60 | タンパク質の濃縮およびバッファー交換用 |
| 遠心分離機 | Eppendorf | EP022628257 | 細菌培養 |
| コエンザイムの採取用 ナトリウム塩水和物(CoA) | Sigma-Aldrich | C3144 | 無細胞反応の成分 溶液A |
| カラー染色済みタンパク質標準品(広範囲) | NEB | P7719 | SDS-PAGEゲルのサイズマーカーとして使用 |
| Covid-19血清パネル | RayBiotech | CoV-PosSet | CFDB試薬/条件 |
| の検証と最適化のための事前特性評価血清D-(&マイナス;)-3-ホスホグリセリン酸二ナトリウム塩(3-PGA) | Sigma-Aldrich | P8877 | 無細胞反応溶液Bの成分 |
| ジチオスレイトール(DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | バッファーの成分 |
| 大腸菌 5-α | NEB | C2987 | プラスミド調製用 |
| 大腸菌 BL21 | NEB | C2530 | 無細胞ライセートの調製に |
| 大腸菌 BL21 (DE3) | NEB | C2527 | SpyCatcher2-Apex2の表現用 |
| EDTAフリープロテアーゼ阻害剤錠剤 | Sigma-Aldrich | 11836153001 | 大腸菌溶解バッファーEppendorfのA成分 |
| ニューブランズウィック州 Innova 43/43R インキュベーター シェーカー | エッペンドルフ | EPM1320 | タンパク質発現および無細胞溶解物調製のための大腸菌細胞の増殖用インキュベーター |
| フォリン酸 | Sigma-Aldrich | 47612 | 無細胞反応溶液の成分 |
| A グリセロール | Sigma-Aldrich | G9012 | SpyCatcher2-Apex2 保存バッファーの成分 |
| ヘミンクロリド | シグマ・アルドリッチ | H9039 | SpyCatcher2-Apex2のヘム補給に |
| 過酸化水素 30% | Sigma-Aldrich | H1009 | ECL 試薬作成用 |
| Image Lab Software | Bio-Rad | 1709690 | Software for ChemiDoc gel イメージング機器 |
| イソプロピル-b-D-1-チオガラクトピラノシド | BioShop | IPT001 | SpyCatcher2-Apex2 expressikon |
| カナマイシン硫酸塩 | Sigma-Aldrich | 60615 | SpyCatcher2-Apex2 細菌培養 |
| LB 寒天 | BioShop | LBL406 | 大腸菌増殖用 |
| LBブロス | BioShop | LBL407 | 大腸菌増殖 |
| 用 ルミノール | Sigma-Aldrich | A4685 | ECL試薬作成用 |
| リゾチーム | Sigma-Aldrich | L6876 | 細菌細胞の溶解用 |
| 酢酸マグネシウム | Sigma-Aldrich | M5661 | 無細胞反応液B |
| NEBExpress Ni樹脂の成分 | NEB | S1428S | SpyCatcher2-Apex2 |
| 無脂肪粉ミルク | Bioshop | SKI400 | WBおよびCFDB膜のブロッキング用 |
| Parafilm | Bemis | 2099-1337410 | CFDBブロットのECLインキュベーション用 |
| p-クマル酸 | Sigma-Aldrich | C9008 | ECL試薬 |
| pET24b-SpyCatcher2-Apex2プラスミド | Pardee Laboratory | N/A | 発現に使用 SpyCatcher2-Apex2タンパク質 |
| シャー | フィッシャーブランド | FB0875712 | WBおよびCFDB膜インキュベーション用容器 |
| リン酸緩衝生理食塩水 10% | BioShop | PBS405 | 緩衝液の成分 |
| グルタミン酸カリウム | Sigma-Aldrich | G1501 | 無細胞反応のA成分 溶液B |
| シュウ酸カリウム一水和物(シュウ酸) | Sigma-Aldrich | 223425 | 無細胞反応の成分 溶液A |
| プレキャストSDS-PAGEゲル | BioRad | 4561036EDU | タンパク質 |
| Q5ハイフィデリティDNAポリメラーゼ | NEB | M0491 | LETのPCR増幅に |
| QIAquick PCR精製キット | Qiagen | 28106 | LETsの精製用 |
| リボヌクレオチド溶液セット | NEB | N0450S | 無細胞反応の成分 溶液A |
| スキム粉乳 | BioShop | SKI400 | ウェスタンブロットおよびCFDB塩化ナトリウムのブロッキング剤として使用 |
| Sigma-Aldrich | S9625 | タンパク質精製バッファーの成分 | |
| Sonicator | Qsonica | Q500 | 細菌細胞の溶解用 |
| スペルミジン | Sigma-Aldrich | S2626 | 無細胞反応の成分 溶液A |
| シリンジフィルター | Sigma-Aldrich | SLGSR33SS | バッファーおよび溶液の滅菌用 |
| サーモサイクラー | BioRad | T100 | PCR反応のインキュベーション用機器 |
| RNA(tRNA) | Sigma-Aldrich | R8759 | 無細胞反応溶液A |
| トリス緩衝生理食塩水 | Thermo Scientific | J60764の成分。WB | およびCFDB洗浄バッファーの |
| Trizmaベース | Sigma-Aldrich | T1503 | トリスバッファー作成用 |
| Tunair SS-5012 ハーフバッフルシェイクフラスコ、2.5L | コールパーマー | RK-01835-39 | タンパク質発現および無細胞溶解液調製のための大腸菌細胞増殖用容器 |
| Tween-20 | BioShop | TWN510 | WBおよびCFDB洗浄バッファーの成分 |
| ピンセット | Almedic | 7728-A10-100 | CFDB NC膜 |
| UV-Vis分光光度計 | Thermo Scientific | 13400518 | 核酸およびDNA濃度の測定と細菌培養に使用 抗 |
| SARS-CoV-2免疫グルブリンのOD WHO国際リファレンスパネル | NISBC | 20/268 | CFDB試薬/条件 |
| の検証と最適化のための事前特性評価血清&β;-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド水和物(NAD) | Sigma-Aldrich | 10127965001 | 無細胞反応溶液AのA成分 |
参考文献
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