DNA/RNAハイブリッド複合体からのテロメリックリピート含有RNAの推定

サマリー

このプロトコルにより、DNA:RNAハイブリッドおよびそれに関連するRNA(TERRAを含む)を複数の組織にまたがって分離することが可能になります。私たちのアプローチはハイブリッド相互作用の一部を捉えていますが、完全なゲノム全体の特徴解析には追加のゲノムマッピングが必要です。

要約

テロメリックリピート含有RNA(TERRA)は、高等真核生物のすべてのテロメアから転写される長く非コードRNAであり、これらの分子の一部のみがテロメアで安定したDNA/RNAハイブリッドを形成します。これらのハイブリッド推定値を特定・精製するための詳細な分子プロトコルをまとめました。この効率的な手法により、 生体内 で自然に形成されるDNA/RNAハイブリッド相互作用を直接抽出でき、すべての領域を検出するために応用可能です。手順を最小限に抑えることで、この技術はDNAに結合したRNAを単離する上で非常に効率的になり、下流のシーケンスの信頼性と再現性を推定します。グアニジンイソチオシアネート試薬は、全細胞溶解および均質化に用いられ、特にDNA/RNAハイブリッドの核酸(DNAおよびRNA)の完全性を保ちます。クロロホルムを加えると遠心分離(下のフェノール-クロロホルム相、間相、上水相)による遠心分離が始まります。核と細胞質の両方から放出されるRNAは水相に保持され、一方で高分子量のDNAやDNA/RNAハイブリッド領域は間期に限定されます。イソプロピルアルコールを用いて遠心分離を行って、水相(遊離RNA)、間相、そしてDNA、特にDNA/RNAハイブリッドが回収されます。残留したタンパク質の痕跡を除去するために、サンプルはプロテナーゼKで培養されます。DNase処理、フェノール/クロロホルム抽出、イソプロピルアルコール、遠心分離によりDNAにハイブリナイズされたRNAが放出されます。

概要

ゲノムの転写により、三本鎖構造からなる一時的なハイブリッド分子(Rループ)が形成されます。これらの構造には、非コード鎖とコード鎖が含まれ、非コード鎖は補完的なRNA¹とのハイブリッド形成によって置換されます。ゲノム転写の過程では、両DNA鎖から多数の非コードRNAが異なる速度で産生されます。これらのRNAの多くは短命な中間体として機能しますが、特にテロメアやセントロ^メア1のような非コード領域に由来するものなど、ゲノム生物学を支配する調節ネットワークにおいて重要な役割を果たすものもあります。ゲノム内のDNA/RNAハイブリッドの分布は、任意の時点での細胞の転写活性を反映することもあります。

非コードRNAの調節機能への関心が高まる中、特に一時的なDNA/RNAハイブリッドの形で、その転写とゲノム全体の分布を追跡することへの関心が高まっています。これに対処するため、安定したDNA/RNAハイブリッドを検出するための独立したアッセイを開発し、あらゆる生物細胞や組織に適用可能となりました。この方法は、DNAと共純化する補完的なRNAを単離し、その後PCR沈殿またはシーケンスによる解析を可能にします。

細胞培養モデルの研究により、DNA複製および転写中に、トポロジカル的、構造的、ハイブリダイゼーションのイベントにより複製ストレス、DNA損傷、複製フォーク衝突、RNAポリメラーゼIIの停止が起こることが示されました。これらの過程、特にDNA二重らせんの展開はねじれ応力を生じさせ、転写1の際にRループなどの異常構造の形成を引き起こす^{ことがあります。}

ほとんどのRループデータは酵母細胞や培養がん細胞を用いて生成され、DNA-RNAハイブリッド特異的モノクローナル抗体S9.6に依存しています。構造的研究により、S9.6の抗原結合断片(Fab)は13塩基のRNA-DNAハイブリッド二重結合1に特異的に結合することが^{示されています。}抗体を用いたRループ検出は、転写時にグアニン豊富な領域で形成されるハイブリッドを主に特定しており、そこでRNA-DNAハイブリダイゼーションが強化される可能性が高いです。S9.6抗体を用いた in vitro 研究では、5′末端近くで4つ以上の連続したグアニンを含むRNAが検出されやすく、Rループ形成の増加と相関していることが示唆されています^1。ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、RNase H1、RNase H2などのさまざまな酵素が、転写中のRループバランスの維持を助けます。Rループ恒常性の崩壊はゲノム不安定性の増加と関連しており、がんや神経変性疾患などの疾患に寄与しています²。

かつて転写的に無言と考えられていたテロメアは、テロメリックリピート含有RNA(TERRA⁾³として知られる長い非コードRNAを転写することが発見されています。これらの転写産物はサブテロメア領域から起源を持ち、テロメアの恒常性維持に不可欠な役割を果たし^ます。本論文では、「TERRAハイブリッドRNA」をDNase I処理を経てDNA/RNAハイブリッド複合体から放出されるRNA分子と呼び、抽出特性やプライマー特異性に基づくTERRA配列を含むと推定されます。

TERRAの転写はセントロメアからテロメアへの方向に起こり、長さは100 bpから9 kbまで変動します。TERRAの大部分は水相で遊離RNA分子として回収されます。ごく一部はDNAに残り、がん^{や老化などの}主要な生物学的プロセスに関連しています^。TERRAレベルはサブテロメア遺伝子座によって異なり、テロメアのヘテロクロマティック状態によって調節^{されます。}細胞培養研究では、さまざまなサブテロメア領域からのTERRA転写産物が長さに異質性を示すことも示されています。一部の腫瘍由来細胞培養研究では、20qサブテロメア領域がTERRA転写産物の主な供給源であり、この領域はしばしばCpG島^7,8,9でメチル化されていることがわかっています。マウスでは、染色体18のサブテロメア領域が^TERRA産生の主要な場所^です。さらに、胚細胞の擬常染色体亜テロメア領域に由来するTERRA転写産物であるPAR-TERRAは、染色体18^11,12に比べて最大200倍多くのTERRAを持つことが示されました。

TERRAの転写はDNAメチル化およびH3K9やH4K20トリメチル化などのヒストン修飾によって制御され、これらはTERRAを抑制します。一方、ヒストンアセチル化はTERRA転写^6,13,14と正の相関を示します。TERRAはまた、遺伝子間部位やイントロンを含む外テロメア領域にも結合しており、ゲノム調節におけるより広範な役割^{を示しています。}

さらに、TERRAの枯渇は多くの遺伝子、特に結合部位近くの遺伝子の調節障害を引き起こし、クロマチンのエピジェネティック調節および遺伝子発現に関与していることを示唆しています^。短縮されたテロメアでのTERRA蓄積は相同組換え(HR)に基づくテロメアの延長を促進し、テロメア長の恒常性に寄与します^15,16。

TERRAおよび他のDNA/RNAハイブリッドの役割に対処するため、安定的にハイブリ化されたRNA分子を単離するために特化したアッセイを用いました。簡単に言えば、核を単離し、DNaseフリーRNaseで処理して保護されていないRNAを除去しました。その後、選択的DNase消化を用いてDNA/RNAハイブリッドを抽出しました。これは元々DNAにハイブリ化されたRNAを放出します。この分画は「DNA/RNAハイブリッド関連RNA」と呼ばれ、その後RNA-seqで解析され、標準的なフェノール-クロロホルム抽出で得られた総可溶性RNAと比較^{されました。}このアプローチにより、RNA-DNAハイブリッド形成におけるテロメア部位と非テロメア部位の両方を特定し、DNA結合型と可溶性RNAプールのトランスクリプトムプロファイルを比較することができました。かつてはテロメア転写の副産物と考えられていましたが、現在ではテロメア維持における二重の役割、テロメラーゼ活性および相同組換えに影響を与え、これらはテロメア長の恒常性に不可欠です。さらに、検出アッセイの進歩により、ゲノム全体におけるRNAとDNAの動的相互作用の詳細な理解が可能になりました。この知見は、TERRAのようなDNA/RNAハイブリッドが細胞過程に与える影響や、がんや神経変性疾患などの疾患との潜在的な関連性のさらなる探求への道を開きます。この分野で進行中の研究は、ゲノム調節とそれが健康や病気に与える重要性の理解を確実に深めるでしょう。

本研究で用いられたTERRA分子およびDNA/RNAハイブリッド同定方法は、ここに詳述された最適化されたグアニジニウムチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出プロトコルと同じです。このプロトコルは、RNA-DNA/RNA ハイブリッド、全RNA、ゲノムDNAを統一ワークフロー内で同時に分離できるように開発されました。従来の三相分離法を戦略的に改良することで、このプロトコルはフェノール間期におけるDNA/RNAハイブリッドの選択的保持を促進し、その損失を最小限に抑えます。これは従来の抽出技術の本質的な制約です。

従来、DNA/RNAハイブリッドの検出と分離は、DNA/RNAハイブリッド構造を特異的に認識するS9.6モノクローナル抗体による免疫沈殿に依存してきました(^18,19)。このS9.6ベースのアプローチは広く使われていますが、抗体の利用性、コスト、交差反応の可能性に制約されることがあります。対照的に、当プロトコルは細胞由来および組織由来のサンプルの両方に容易に適用可能な、コスト効率の良い抗体に依存しない代替手段を提供します。

分離されたDNA/RNAハイブリッド画の純度と構造的完全性をさらに高めるために、プロテイナーゼK介在脱タンパク質化を取り入れ、その後DNase I処理を行いました。DNase IステップはDNA/RNAハイブリッドのDNA鎖を選択的に消化し、その結果、ハイブリダイズしたRNAを放出し、その後の分離および下流の^{分子解析を行います}。このアプローチにより、回収されるRNA種が体内で安定的にハイブリッド化されたRNA種であることが保証されます。モジュール構成と拡張性により、当社のプロトコルは多様な生物学的文脈に広く適応可能であり、研究者に多様な実験システムにおけるDNA/RNAハイブリッド生物学の検証に強力なツールを提供します。

プロトコル

動物を対象としたすべての実験プロトコルはエルジエス大学動物倫理委員会(ライセンス番号19-07-2019、決定番号19/127)によって承認されました。この研究では Balb/c マウスが使用され、健康なメス5頭(生後6週、25g)、オス5頭(生後8週、30g)が使用されました。マウスは実験動物ケアの原則(欧州規則)に従ってケア・治療されました。ここで紹介する研究は、エルジエス大学人間倫理委員会(決定番号:17/002)から倫理承認を受けた以前の研究プロジェクトから得られた、健康な対照群13人の血液サンプルを用いました。このプロトコルのグラフィカルな要約は 図1に示されています。RNA分解を最小限に抑えるため、すべての工程でRNaseフリー材料と無菌技術を用いましょう。

1. ネズミ飼育

1. 安楽死に必要な適切な麻酔用量を決定するために、マウスそれぞれの体重を測定し、ケタミンを60 mg/kg、キシラジンを10 mg/kgで腹腔内注射で投与します。
2. 麻酔投与後は、足の引き込み反射(つま先のつまみ)がなく、触覚刺激に反応しないことで完全麻酔を確認します。麻酔が確定したら、子宮頸部脱臼による安楽死を行います。

2. 人体サンプル

1. 慢性疾患(糖尿病、心血管疾患、高血圧、がんなど)、急性感染症、自己免疫または炎症性疾患、神経学的または精神疾患、最近の処方薬使用歴を除外するためにスクリーニングを行い、健康な対照群として選抜します^。
2. 各ボランティアの膝後ろ(膝窩)から皮膚生検サンプルを2mmのパンチツールで採取します。処置前に局所麻酔を皮下で投与し、すべての生検は無菌状態で行います。

3. すべての細胞タイプからのDNA/RNAハイブリッド抽出

1. 組織採取と溶解
   1. 各採取には、心臓血液500μL、視床下部-下垂体複合体全体、副腎全体、または1匹のマウスから採取した精子サンプルを使用します。
   2. 採取したすべてのサンプルを滅菌の1.5 mLチューブに移管します。各チューブに500μLのフェノールを加えます。ボルテックスの血液サンプルを徹底的に混ぜてみて。
      1. 組織サンプルの場合は、2mmのシリンジで完全に均質化し、目に見える断片が残らなくなるまで続けます。
   3. 試料の完全性を保つために、チューブを冷却ブロックの上に置いてください。
      注意:フェノール、クロロホルム、酢酸アンモニウムなどの有害試薬を取り扱う際は、必ず実験室の安全ガイドラインを遵守してください。
2. 相分離
   1. 各チューブに180μLのクロロホルムを加え、短時間渦巻きして混合します。チューブを氷の上で15分間培養して位相分離を許可します。
   2. サンプルを点検し、水相が透明であることを確認しましょう。もし相が曇っている場合は、再び渦を巻き、さらに5分間氷に戻します。
   3. 遠心分離機で12,000 × g、4°Cで15分間サンプルを取る。
3. RNA沈殿
   1. 透明な水相を冷却ブロックに置く新しい無菌1.5mLマイクロ遠心分離機管に慎重に移します。
   2. 水相に同量(1:1)のイソプロパノールを加え、一瞬渦を巻き込んで混ぜ、氷で15分間培養します。
   3. 遠心分離機は12,000 × g、4°Cで15分間。
      注意:RNAペレットはチューブの底に見えるはずです。
4. RNAペレットの洗浄
   1. チューブを慎重に逆さにして、ペレットを乱さずに上清液を排出します。
   2. ペレットに70%エタノールを1.5mL加えます。チューブを5秒ほど優しく叩いて洗います。
   3. 遠心分離機は7,500 × g、4°Cで5分間。
   4. チューブを逆さにして上清液を捨てます。エタノールウォッシュを2回繰り返します(合計3回のウォッシュ)。
5. RNA精製
   1. 最終エタノール洗浄後、チューブを逆さまにし、残留したエタノールを自然乾燥させるか、ピペットで慎重に除去します。
   2. RNAペレットにRNaseフリー水100μLを加え、ピペットを上下に優しく動かすか、チューブをはじいてRNAを完全に再懸濁させます。
      注意:分解を防ぐために、RNAサンプルは常に氷や冷却ラック/冷却ブロックで保管してください。
6. RNAの定量化と蓄積
   1. 再懸濁したRNAを含むチューブを氷の上に置きます。
   2. 分光光度計を使ってRNA濃度と純度を測定します。RNA濃度を測定するために260 nm(A260)で吸収を記録します。純度はA260/A280およびA260/A230の比率を計算して評価します。
   3. 下流用途にはA260/A280比率が1.9から2.1のRNAサンプルのみを使用してください。
      注:本研究における典型的なRNA濃度は100〜180 ng/μLの範囲でした。
   4. RNAサンプルは−80°Cで保存し、使用後に使用します。
7. タンパク質の除去とDNAの分離
   1. RNA分離後は、フェノール抽出ステップの間期を保持します。
      注:このステップは、間期にDNAが含まれており、フェノール添加と遠心分離後にDNA分離のためにさらに処理できるため必要です。
   2. DNA抽出は、間期を出発物質として3.2.1-3.4.1の手順に従って進めます。フェノール抽出からDNAを含む間期全体を慎重に、冷却ラックに置かれた無菌の1.5 mLマイクロ遠心分離機チューブに移します。
   3. タンパク質消化:チューブに0.5mLの溶解バッファー(20 mM Tris-HCl、pH 8.0、100 mM EDTA、0.1% SDS、400 μg/mL プロテイナーゼK)を加えます。タンパク質を消化するために56°Cで一晩培養します。
   4. DNAの塩沈殿
      1. 翌日、各サンプルに5Mアセテートアンモニウム100 μLを加え、短時間混ぜます。室温で1,788× g で20分間遠心分離機にします。
      2. 透明な水相を新しい無菌の1.5 mLマイクロ遠心分離管に慎重に移してください。水相に分子生物学グレードのイソプロパノール(1:1比率)を等量に加え、穏やか反転で混合し、室温で1,788× g で10分間遠心分離します。DNAペレットを乱さずに上澄液を捨てます。
      3. DNAペレットを70%エタノール1mLで洗浄し、1,788 × g で遠心分離機で10分間加熱します。
      4. エタノールウォッシュを取り除いて捨てます。DNAペレットを短時間空気で乾かします。
      5. 乾燥したDNAペレットをヌクレアーゼフリー水50μLに再懸濁させます。
8. DNAをクリーンアップするために遊離核酸を除去する:
   1. 溶解したDNAをDNAスピンカラムに積み込みます。15,000 g で遠心分離機を15秒間×、フロースルーを廃棄します。
   2. 70%エタノールで2回洗い、15,000 × gでそれぞれ1分間遠心分離します。洗うたびに流れたものは捨ててください。
   3. スピンカラムをクリーンな1.5mLの収集チューブに移します。カラムマトリックスにヌクレアーゼフリー水30μLを加え、室温で5分間培養、その後15,000 × g で1分間遠心分離してDNAを溶出します。
   4. 溶出したDNAを氷に保管します。サンプルを2本の管に分けます。1本は4°CでのDNA保存用、もう1本はその後のDNA/RNAハイブリッド抽出用です。
9. DNAに結合したRNAの抽出(DNA/RNAハイブリッド)
   1. DNase処理
      1. DNase Iを5 μL(15 U)と10倍DNase消化バッファー75 μLを組み合わせてDNase分解混合物を調製します。
      2. 乾燥したDNAペレットに80μLのDNase混合物を加えます。サンプルを室温で15分間培養します。
   2. フェノール-クロロホルム抽出
      1. サンプルにフェノール300μLを加え、室温で5分間培養します。
      2. 混合物にクロロホルム180μLを加え、室温でさらに5分間培養します。
      3. 最大速度(例:15,000 × g)で4°Cで10分間遠心分離機を使い、相を分離します。上部水相(RNA:DNAハイブリッドを含む)を慎重に新しいチューブに移します。
10. DNA/RNAハイブリッド分離
    1. ステップ3.3から3.5.2までのDNA/RNAハイブリッドの分離を完了します。
    2. 水相に同量(1:1)のイソプロパノールを加え、一瞬渦を巻き込んで混ぜ、氷で15分間培養します。
    3. 遠心分離機は12,000 × g、4°Cで15分間。チューブの底にあるRNAペレットを探してください。チューブを慎重に逆さにして、ペレットを乱さずに上清液を排出します。
    4. ペレットに70%エタノールを1.5mL加えます。チューブを5秒ほど優しく叩いて洗います。遠心分離機で7,500× g、4°Cで5分間。チューブを逆さにして上清液を捨てます。エタノールウォッシュを2回繰り返します(合計3回のウォッシュ)。
11. RNA精製:
    1. 最終エタノール洗浄後、チューブを逆さまにし、残留したエタノールを自然乾燥させるか、ピペットで慎重に除去します。
    2. DNA/RNAハイブリッドペレットにRNaseフリー水30μLを加え、ピペットを上下に優しく動かすか、チューブをはじいてRNAを完全に再懸浮させます。
    3. DNA/RNAハイブリッドサンプルは−80°Cで保存し、使用まで保存します。

4. cDNA合成

注意:RNase/DNaseフリーの材料を使用し、検査中はサンプルを氷上保管してRNA、cDNA、DNAの完全性を確保してください。

1. 各サンプルごとに6μL(20 ngのRNA;遊離RNAの場合はステップ3.6.5、DNA/RNAハイブリッドRNAの場合はステップ3.13.3で分離)を使用します。必要なRNA量を標識付きPCRチューブに移します。
2. キットメーカーの指示に従ってcDNA合成マスターミックスを準備してください。各反応ごとに、マスターミックスに逆転写酵素、dNTP、プライマー、バッファー、RNase阻害剤が含まれていることを確認してください。各反応ごとに、マスターミックス14 μLとRNAサンプル6 μLをPCRチューブ内に混ぜます(総体積:1回の反応あたり20 μL)。逆転写酵素を加えずに、同じ量のRNAを用いて並行反応を製製することで、少なくとも1つのノンリバーストランスクリプトターゼ(-RT)コントロールを含みます。
3. 表1に指定された温度プログラムを用いてサーマルサイクラーでcDNA合成を行います。
4. 得られたcDNAをヌクレアーゼフリー水で1:5で希釈し、−80°CでqPCR解析まで保存します。

5. Q-PCRによるTERRA発現レベルの決定

1. メーカーの指示に従い、SYBR GreenベースのqPCRキットを使用してqPCR反応混合物を準備してください。各反応ごとに、SYBRグリーンマスターミックス1μL、TERRA用フォワードプライマー0.μL( 表2参照)、逆プライマー0.μL(b参照)、ヌクレアーゼフリー水μLを組み合わせます。
2. 反応混合物を16μLずつ、96ウェルのqPCRプレートの各ウェルに分散します。
3. 各ウェルに4μLの希釈cDNA(ステップ4.6のもの)を加え、最終反応容積は20μLにします。
   注意:各サンプルには少なくとも2つの技術的複製と2つの生物学的複製を含めること。汚染を検査するためのノーテンプレート対照(NTC)と、RNA由来シグナルの特異性を確保するための逆転写酵素制御を含ませます。
4. 表3に指定された温度プログラムを使ってqPCRを実施します。
5. ^2-ΔΔCt法を用いてTERRA発現をβ正正規化します。

6. テロメア長の決定

1. テロメア長測定用のqPCR混合物を準備します。 ²¹。各反応ごとに、SYBRグリーンマスターミックス1 μL、テロメア前方プライマー0 μL(表2参照)、テロメア逆プライマー 0 μL( 表2参照)、ヌクレアーゼフリー水 μLを組み合わせます。
2. 96ウェルのqPCRプレートの各ウェルに16μLのテロメア反応混合物を分散します。
3. 各ウェルにステップ3.10.5のゲノムDNAを4 μL追加し、最終反応容積は20 μLとなります。
4. qPCRは製造元が指定した適切なプログラムパラメータに従って実施します(表 3参照)。
5. 並行して、同じ濃度と最終体積を用いて単一コピーのリファレンス遺伝子(36B4)の反応を設定します。
6. 標準曲線は合成テロメアオリゴヌクレオチドの連続希釈(表2)を用いて相対存在比と増幅効率を推定しました。絶対的な数値化は行われませんでした。相対テロメア長は、ΔCt法²¹を用いてT/S比(テロメアリピートコピー数と単一コピー遺伝子番号)として計算されます。

結果

本研究では、複数のマウス組織(血液、精子、皮膚、視床下部、下垂体、副腎)およびヒトの血液および皮膚サンプルにおける遊離TERRA、DNA/RNAハイブリッドTERRA、テロメア長のレベルを定量・比較し、組織特異的な動態とテロメア生物学との関係を調査しました。フェノール-クロロホルム抽出後の水相から遊離TERRAは単離され(プロトコルステップ3.6.1-3.6.5)、クロマチンやDNAに関連しないTERRA分子を含む細胞質および核質RNAを濃縮しました。テロメアでDNA/RNAハイブリッドに関与するTERRAを表すハイブリッドTERRAは、DNase I処理後の間期画分から分離され(プロトコルステップ3.11)、テロメアDNAと安定的に関連したTERRAのみの回復を保証しました。

各フラクションの特異性は、ハイブリッドのRNase H消化や既に検証済みの...

ディスカッション

ここで紹介するプロトコルの中心的な強みは、複雑な組織サンプルから遊離TERRAおよびDNA/RNAハイブリッドTERRAを段階的に抽出・識別することにあります。重要なステップには、フェノール・クロロホルム抽出時に水相および間相の分離を慎重に行うことが挙げられます。交差汚染は自由TERRAとハイブリッドTERRAの区別を混乱させる可能性があるからです。その後の間期分画のDNase I処理も極めて重要です。消化が不十分だとDNA結合RNAにアクセスできなくなり、過剰消化はハイブリッドを分解するリスクがあります。RNase H処理などの検証済みハイブリッド特異的酵素対照群やqPCRプライマーセットの使用は、画分特異性の確認とアーティファクトの回避に不可欠です(^22,23)。qPCRによるテロメア長の正確な測定は、分離されたDNAの品質と純度、そして単一コピー遺伝子への正確な正規化に依存しています²⁴。

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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.2 mL PCRチューブ	グライナー	671201
15 mL ファルコンチューブ	アイソラボ	078.02.001
2 mL シリンジ	ハヤト	該当なし
96- マルチウェルプレート	グライナー	50-720-3203
絶対エタノール	メルク	1070172511
アモニウムアセテート	シグマ	238074-500G
cDNAシンヘシスキット	ロッシュ	07 912 439 001
クロロホルム	メルク	1024451000
DNAse I キット	ザイモ	E1010
EDTA	シグマ	E9884-1KG
ガラス瓶	アイソラボ	LB。IS.061.01.901
目盛りシリンダー	アイソラボ	015.01.901
グアニジン・イソチオシアネート	シグマ	G9277-100G
アイソプロポナル	メルク	1096342511
ライトサイクラー480 II	ロッシュ	5015278001
マイクロ遠心分離機チューブ(1.5 mL)	グライナー	616201
マイクロピペット(10およびマイクロ;L)	ギルソン	FD10001
マイクロピペット(100およびマイクロ;L)	ギルソン	FD10004
マイクロピペット(1000およびマイクロ;L)	ギルソン	FD10003
マイクロピペット(2およびマイクロ;L)	ギルソン	GFAM00064
ナノドロップ	島津	C101-E112
PBSタブレット	シグマ	P4417-50TAB
PCRデバイス	センソクエスト	T3-0140
PGL3 基本ベクター	プロメガ	#212936
ピペットチップ(10 & micro;L、200 & micro;L、1000 & micro;L)	グライナー	772352
プラスチック製ペトリ皿	グライナー	627102
プロテイナーゼK	シグマ	P6556-10MG
SDS	シグマ	8170342500
血清学的ピペット	グライナー	760107
スピン	ギルソン	PMC880
シブル・グリーン・マスター	ロッシュ	4707516001
サーモミキサー	エッペンドルフ	#5355
トリズマ基地	シグマ	1503-1KG
トリゾール	バイオラッド	7326890
ユニマックス1010 DTシェイカー	ハイドルフ	543-12310-00-6
渦	ハイドルフ	541-10000-00-1
Zymo-Spin Iカラム	ザイモ	C1003-50