方法論記事

I TASSER、trRosetta、UCSF Chimera、HADDOCKサーバー、HEX loriaの De Novo および In Silico Design of Proteinsへの応用

DOI：

10.3791/68003

⸱

2025年7月8日

 , 
1Facultad de Ciencias Naturales, Doctorado en Ciencias Biológicas, Campus Aeropuerto. Laboratorio de Biología Cuantitativa y Sistemas Complejos, Universidad Autónoma de Querétaro

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

タンパク質設計には、アミノ酸配列の構築と、機能的なバリアントを作成するための特定のモチーフの組み込みが含まれます。このアプローチは、抗生物質耐性病原体と戦うための抗菌ペプチド(AMP)の開発に不可欠です。この論文では、さまざまなバイオインフォマティクスツールを使用したタンパク質構築の手順を示します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

タンパク質設計の最前線は、アミノ酸配列の構築と、結合部位などの特定のモチーフの受容体、イオンチャネル、またはその他のタンパク質への組み込みにあります。このアプローチにより、特定の機能と目的を持つタンパク質変異体を作製することができます。これらのバイオインフォマティクスリソースの代表的な応用例としては、抗菌ペプチド(AMP)の改良や合成AMPの設計が挙げられます。この発展は、根絶が困難で抗生物質耐性を示す病原体によって引き起こされることが多い新興感染症が最近増加しているため、重要です。この傾向の結果には、動物種の世界的な絶滅と人間の死が含まれます。したがって、新規で効果的なAMPの迅速な合成が不可欠です。これらのサーバーとプログラムは、ワクチン、AMP、またはこれらの病原体に対する効果的な治療法の迅速な開発を促進することができます。この研究の目的は、配列からタンパク質を構築する手順を提示および提案し、これらの分子を段階的に構築するためのさまざまなツールを使用するプロセスを解明することでした。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

動物の病気の発生率は増加しており、この現象は気候変動の影響を受けています。地球の気温上昇は、微生物の増殖と日和見病原体の出現につながり、毒性のある薬剤耐性疾患の発症の一因となっています1。気候変動は、土壌、水、皮膚、腸内細菌叢に影響を及ぼし、その結果、動物の生理機能や環境適応に持続的なストレスがかかります。この現象は、免疫応答を損なうことが証明されており、動物は新たな病原体に対してより感受性が高くなり、致命的な結果をもたらし、特定の種の絶滅につながる可能性があります2,3,4,5。顕著な例は、冬眠中のコウモリに影響を与える真菌Pseudogymnoascus destructansによって引き起こされる病気であるホワイトノーズ症候群(WNS)です。この疾患やその他の疾患は、2006年にアメリカ大陸で相当な死亡イベントが発生するまで特定されませんでした6。このような病原体による被害を軽減するために、研究者たちは、イトラコナゾールやケトコナゾールなどの抗真菌薬の投与や、有益な微生物叢であるシュードモナス・フルオレセンス7の接種を含むプロバイオティクスの投与に目を向けています。真菌によって引き起こされる病気の別の例は、Ophidiomyces ophiodiicola、飼育下と野生のヘビの両方で皮膚炎と多系統性疾患を引き起こす真菌です4,8。

これらの研究は、実用的な解決策を迅速に実施するためには、野生動物の真菌性疾患に対する認識と理解を高める必要性を強調しています。両生類では真菌感染症が報告されており、これらの動物に影響を与える一般的な病原体の1つは、ツボカビ症を引き起こす水生真菌 Batrachochytrium dendrobatidis (Bd)です。この病気は、感受性の高い動物の重度の皮膚病変を引き起こし、正常な皮膚機能を破壊し、死亡につながる可能性があります9。この病原体は20世紀から広く普及し、90種の両生類の絶滅に貢献しています。これらの感染症の蔓延は、さまざまな生態学的、生理学的、マイクロバイオーム、およびその他の要因を考慮する必要があるため、それらを予防し、効果的な治療法を特定する上で大きな課題を提起します10。

病原性微生物が遺伝子コードを通じて耐性メカニズムを迅速に進化させる能力を持っていることは十分に文書化された現象であり、このプロセスは、薬物や抗生物質の外部排出ポンプの製造によって例示できます11。さらに、これらの微生物は、特定の分子12の影響を打ち消す目的で膜脂質組成を修飾することが観察されている。タンパク質配列の分野は、特に治療アプローチへの統合やタンパク質構造モデルの構築という文脈で、大きな関心を集めています。これらのモデルは、タンパク質合成の開始に先立って、実験室の時間とリソースを最適化するように設計されています13。これらの場合の感染予防は、複数の生態学的、生理学的、およびマイクロバイオーム要因が関与する複雑な課題である14。このアプローチにより、ラボの時間とリソースをより効果的に管理し、タスクの複雑さが強調されます。

既存の化合物の実用化の可能性を高め、そのような応用の可能性をより大きく持つ新しい化合物を創出するためには、化学、分子生物学、物理学、プログラミングなど、さまざまな分野の専門知識を活用することが不可欠です。この目的のために、I-TASSER(Iterative Threading ASSembly Refinement)15,16やtrRosetta 17,18(TRansform-retrained Rosettaによるタンパク質構造予測)など、いくつかのツールが利用可能です。分子ドッキングとPDBファイル編集のための構造タンパク質予測とUCSF Chimera(カリフォルニア大学サンフランシスコ校の探索的研究および分析のための可視化システム)19およびHEX loria(インタラクティブなタンパク質ドッキングおよび分子重ね合わせプログラム)20。

I-TASSERは、構造と機能を予測する自動化されたオンラインサーバーです。このプログラムは、Webブラウザまたはダウンロードとしてアクセスできます。登録ページでは、配列をFASTA形式で入力したり、アーカイブを.txt形式でダウンロードしたりできます。サーバープロセスには、Local Meta-Threading Server LOMETS 20,21,22,23,24,25で説明されているように、ある程度の相同性を持つ構造テンプレートの識別が含まれます。サーバーによる100万件の潜在的な結果の処理に続いて、ろ過プロセスが開始され、二乗中央値平方根偏差(RMSD)、TM(2つのモデル間の構造的類似性を評価するために使用される指標)、およびCスコア(ツールによって生成されたタンパク質構造モデルの信頼性を評価するために使用される指標)に基づいてフラグメントが選択されます。ユーザは、プログラムで提供される所定のパラメータに基づいて結果をカスタマイズするか、または特定のシーケンスまたは構造的期待に応じて自分自身の値を入力することができる20、21、22、23、24、25。

trRosetta は、タンパク質構造予測に非常に効果的なプログラムです。このサーバーでは、ユーザーはアーカイブ形式、TXT、FASTA、入力配列、またはMultiple Alignment Sequences(MSA)で配列を登録することができます。このプログラムでは、テンプレートから選択するか、trRosetta-singleを実行してシーケンスフォールディングを行うことができます。これらのサーバーは、ディープラーニングネットワークを利用して構造予測を生成します。シーケンス予測プロセスには、接触マップおよび距離マップ予測の最初のステップが含まれ、その後、最終モデルのための上位5つのテンプレートの選択と、折り畳みおよび精緻化のためのエネルギーを最小化するステップ17が含まれる。

HADDOCK (High Ambiguity Protein-Protein Docking) サーバーは、タンパク質、ペプチド、リガンド、および受容体構造を含む 2 つ以上の PDB ファイルを柔軟にドッキングできる計算ツールです。このサーバは、ドッキングプロセス中に予測または同定されたタンパク質からの情報をコードするAIR(Ambiguous Interaction Restraints)を組み込んだアプローチを採用しています。AIRにはアミノ酸制限が含まれ、受動性アミノ酸と能動性アミノ酸に分類されます。活性アミノ酸の取り込みは、タンパク質受容体間の潜在的な結合または相互作用部位を示すため、特に重要です。プログラムの設計では、モデル26に溶剤暴露が組み込まれています。

HEX Loria は、タンパク質複合体の解析と分子ドッキングを容易にするオンラインインタラクティブサーバーです。このサーバーは、Protein Data Bank(PDB)形式の座標アーカイブを読み取り、NVIDIAまたはCUDAグラフィックターゲットを使用してドッキング計算を迅速に生成できます。このプログラムは、最大1,000のドッキング予測を生成することができ、2つの分子27の全体的な配向に相関フーリエを利用することができる。HEX Loriaインターフェースはユーザーフレンドリーに設計されており、研究者はタンパク質構造をシームレスにアップロードし、ドッキングシミュレーションのパラメーターを設定できます。NVIDIAまたはCUDAグラフィックスプロセッシングユニットを利用できるサーバーの能力は、計算時間を大幅に短縮することが示されており、それにより研究者はより便利に結果を得ることができます。さらに、HEX Loriaは、ドッキング結果のためのさまざまな視覚化オプションを提供し、ユーザーが予測されたタンパク質間相互作用の詳細な分析を行うことを可能にします。

UCSF Chimeraの利用は、研究成果の正確性を確保するために不可欠です。このソフトウェアは、現在のプロトコルを実行するためにインストールが必要であり、その後の機能が採用されます:原子間距離の測定と他のさまざまな分析タスク。このソフトウェアは、ラベリング、着色、表面レンダリング、JPGまたはPNG形式での図のエクスポートなどの機能を誇っています。ラベルと色を組み込むことで、受容体と設計された抗菌タンパク質との間に接触する可能性が高いアミノ酸の同定が容易になります。さらに、これらのアミノ酸間の距離を正確に測定することができます。

このプロトコルは、両生類を苦しめる新たな健康上の懸念に対する代替治療オプションを特定することを目的としています。皮膚の真菌感染症であるツボカビ症は、両生類の発達のさまざまな段階で観察されています。これらの動物の主な感染源は、彼らが通常居住し、さまざまな活動に従事する水域です。効果的な抗真菌剤の開発には、電荷を使用した細胞壁との相互作用、原形質膜への結合、そして最後に、真菌 Bdに重要な役割を果たす膜レベルでの受容体タンパク質との結合と相互作用という、少なくとも3つの分子標的の同定が必要です。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bdの分子標的配列の同定

注:配列中のアミノ酸の選択は、文献からの推奨事項に基づいています。主要なアミノ酸には、K、W、G、A、V、I、およびLが含まれます。使用するプログラムについては、 資料の表を確認してください。

  1. NCBIデータベースからターゲット配列を取得します。
    1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ で国立生物工学情報センター(NCBI)のデータベースにアクセスします。
    2. [すべてのデータベース] を選択し、検索カテゴリとして [Nucleotide] を選択します。
    3. 検索バーにBatrachochytrium dendrobatidisと入力し、株と種で結果をフィルタリングします。
    4. シーケンスをダウンロードしてテキストエディタまたはFASTA形式で保存し、さらに解析します。

2. BLASTまたはSMART BLASTによる配列解析

  1. BLAST 検索を実行します。
    1. Webブラウザを開き、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)に移動します。
    2. Protein BLASTを選択して、クエリ配列をタンパク質データベースと比較 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。
  2. ターゲットの特異性を確認します。
    1. 選択した分子標的が他の分子種に存在しないことを確認してください。ターゲットが複数の種に現れる場合は、特異性が確認されるまで配列選択を繰り返します( 図1を参照)。
      注:このステップにより、望ましくない二次分子標的が AMP または抗真菌タンパク質の機能に干渉しないことが保証されます
  3. タンパク質配列の相同性を確認します。
    1. 設計されたアミノ酸配列が他の種の相同タンパク質と一致しないことを確認します。
      注:このステップでは、抗真菌機能が目的のターゲットに特異的であることを確認します

3. 抗菌タンパク質の配列を設計する

注:アミノ酸含有量および配列は、所望のタンパク質機能、特に抗真菌活性に合わせて調整されるべきである。設計された配列は、 Bdに対する抗真菌作用を持つタンパク質をコードする必要があります。Antifp予測サーバ28でこれを確認してください。

  1. 文献レビューとシーケンスデザイン
    1. 最近の文献の包括的なレビューを実施して、Bdの主要な特性と潜在的な抗菌メカニズムを特定します。
      注:以前の研究では、さまざまな動物や微生物によって合成される Bdに対する抗菌ペプチド(AMP)が説明されています。Shaiのフォーミュラ29は、合成抗真菌ペプチドを設計するためのフレームワークを提供します。この方法は、抗真菌活性を最大化するためのタンパク質配列を最適化するために使用する必要があります。

4. I-TASSERによる3次元構造の予測

注:このプロトコルは、分子標的と設計された抗菌配列に適用されます。

    5. trRosettaを使用した3D構造の予測

    1. trRosetta Webサーバーにアクセスしてください:https://yanglab.qd.sdu.edu.cn/trRosetta/。
    2. 標的受容体配列をFASTA、.txt、またはMSA形式で入力するか、サーバーに直接貼り付けます。
    3. 構造的に予測されたタンパク質に名前を割り当てます。
    4. 「送信」をクリックし、テンプレートを除外するオプションが選択されていることを確認します。trRosettaX-単一ホモログを選択して、予測プロセスを開始します。
      注:結果が受信されるまでプロトコルを一時停止します。
    5. 送信が成功したら、確認メールが届くのを待ちます。
    6. 予測結果を分析します。
      1. TM スコアがモデル品質の尺度であることを確認します。
      2. 接触マップ、アミノ酸あたりの距離マップ、および角度 ω (オメガ)、θ (シータ)、およびφ (phi) でのアルファ炭素とベータ炭素の回転マップを調べます。
    7. 結果をZIP形式でダウンロードして、さらに分析します。

    6. 分子ドッキング・インタラクション解析(HADDOCKを使用)

    1. HADDOCK ドッキング・サーバーにアクセスします (https://wenmr.science.uu.nl/haddock2.4/。
    2. 機関の電子メールを使用してアカウントを登録し、アカウントを確認してログインします。
    3. ホーム ページに戻り、[ 新しいジョブ] を選択して、送信 を開始します 。
    4. HADDOCK登録ページで、ジョブ名、分子番号(この場合は2)などの必要な情報を入力します。すべて選択します。
    5. アップロード ドッキング用分子。受容体とリガンドのPDB構造をアップロードします。両方に タンパク質-リガンドドッキング を選択します。
    6. リガンド提出の手順を繰り返し、すべてのチェーンを選択し、残りの設定はデフォルトのままにします。
    7. [ 次へ ] をクリックして、後続の送信手順に進みます。
      注:セクション1および2では、受容体-リガンド相互作用に関与するアミノ酸のリストを追加し、それらを活性残基としてマークします。不動態残渣は事前に定義されたままです。活性部位は相互作用部位であり、設計されたタンパク質の特性と受容体タンパク質の露出アミノ酸に応じて選択する必要があります。
    8. ドッキング プロセスを完了して実行します。
      1. 「次へ」をクリックして、デフォルトのドッキング・パラメータを変更しないままにします。
      2. 「送信」をクリックして処理を開始します。
        注: 予想される処理時間の範囲は 24 時間から 72 時間です。
    9. ドッキング結果を確認します。
      1. サーバーは、最適なドッキング結果を自動的に選択してランク付けします。構造可視化ソフトウェア(PyMOLやUCSF Chimeraなど)を使用してアミノ酸相互作用を解析します。
    10. 最終的なドッキング構造をPDB形式でダウンロードして、さらに研究を進めてください。
      注意: 補足を参照してください File 1:補足図S1、補足図S2、補足図S3、補足図S4、 および 補足図S5。

    7.距離の測定(オプション)[補足ファイル1:補足図S6、補足図S7、および補足図S8を参照]。

    1. 構造可視化プログラム(PDB)を使用してドッキング結果を解析します。UCSF Chimera で分子ドッキング PDB ファイルを開き、構造的近接性と潜在的な結合部位 (測定距離) を評価します。
    2. Chimera アイコンをダブルクリックして PDB を開きます。「ファイル」、「開く」の順に選択し、ドキュメントディレクトリウィンドウからファイルを選択します。
    3. 原子を特定します。 [アクション]、[原子/結合] に移動し、[ 表示] を選択します。
    4. リガンドと受容体に最も近い原子を選択します。Ctrl + クリックで原子 1 を選択し、Ctrl + Shift + クリックで原子 2 を選択します。
    5. [ツール]、[構造解析]に移動し、距離を選択します。
    6. 「作成 (アトム選択の確認)」をクリックします。このウィンドウには、アミノ酸と原子 1 と 2 の位置が表示されます。
      注:距離列は原子間の角度を示しています。
    7. テーブルをダウンロードして、ローカル コンピューターに保存します。
      注:追加情報については 、補足ファイル1 を参照してください。

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    結果

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    開発中のシーケンスは、K(X)3KW(X)2K(X)2K の式を使用します。ここで、(X) は G、A、V、I、または L28 です。得られた検索結果には、300を超えるアミノ酸のタンパク質配列が含まれていましたが、これらは部分的な配列ではなく、完全なタンパク質配列であるために選択されました。この研究には完全な配列が不可欠であることに注意する必要があります。各受容体/膜チャネルの機能も、配列情報内または別々のデータベース検索で検索されました。得られた結果には、すべての種類のタンパク質が含まれていました。ただし、すべてがこのプロトコルに役立つわけではありません。その結果、Na/Hアンチポーターは、微生物細胞の形状の維持や、両生類の皮膚のように水生環境から陸生環境への細胞移動などの環境変化にさらされる際の浸透圧調節に関連性があることから、Na/Hアンチポーターに着目して選択しました。

    このようなチャネルの「攻撃」または閉塞は、細胞内に浸透圧の不均衡を生じさせ、高濃度では真菌...

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    ディスカッション

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    タンパク質の構造予測に採用されているバイオインフォマティクスアプローチには、計算プログラムに依存しているため、固有の制限があります。これらのプログラムは、実際のタンパク質構造を近似しようとしますが、温度、溶解度、溶媒の存在などの要因によって制約され、in vivo条件で完全に再現できない場合があります。さらに、この方法は、複数のアラインメントとキュレーションされたデータベースを通じて主要な保存されたタンパク質を正確に同定することに依存しているため、これらのデータベースの信頼性は意味のある結果を得るために非常に重要です。

    その制限にもかかわらず、この方法は、病原体、受容体、または結晶化受容体タンパク質からの既存の配列データと統合すると、大きな利点を提供します。天然または合成の抗菌剤を含有し、その有効性を高めるための可能な修正を加えることで、この分析法の汎用性を高めることができます。シーケンシングと実験的テストによる検証により、構造モデルの信頼性がさらに強化されます。精度を確保するために、設計プロセスには、検証済みのプ...

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    開示事項

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    著者には、開示すべき利益相反はありません。

    謝辞

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    ヒメナ・R・ビジャレアルは、ケレタロ自治大学(UAQ)のDoctorado en Ciencias Biológicasプログラムの博士課程の学生であり、Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías(CONAHCyT)フェローシップ(1003112)を受賞しています。

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    材料

    この記事で使用された材料の一覧
    名前会社カタログ番号コメント
    BLASTN/AN/Aオンラインサーバー
    コンピューターAMDN/ASO: XP、W7、W8、W10、ubuntu、linux
    ハドックサーバーBONVINLABN/Aオンラインサーバー
    HEX 5.2BBSRC-INRIAN/A ダウンロード-オンラインサーバー
    I-TASSERZHANG LABN/Aダウンロード-オンラインサーバー
    MUSCLEN/AN/Aオンライン サーバー
    NCBIN/AN/Aオンライン サーバー
    PYMOLSCHRÖDINGERN/ADownload-XP, W7, W8, W10, W11, LINUX
    SWISS-MODELBIOZENTRUMN/Aオンラインサーバー
    trRosetta serverYANG LABN/A オンラインサーバー
    USCF CHIMERARBVIN/ADownload-XP, W7, W8, W10, W11, LINUX

    参考文献

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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