方法論記事

U2 OS細胞培養を用いた生細胞、蛍光顕微鏡法のためのエレクトロポレーションサイトメトリープロトリー

DOI：

10.3791/68005

⸱

2025年6月13日

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1Department of Chemistry and Biology, Toronto Metropolitan University, 2Institute for Biomedical Engineering, Science and Technology (iBEST), a partnership between St. Michael's Hospital, a site of Unity Health Toronto, and Toronto Metropolitan University, 3Keenan Research Centre for Biomedical Science at St. Michael's Hospital

この記事について

サマリー

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エレクトロポレーションとは、パルス電界(PEF)を使用して細胞培養に一過性の細孔を作り、分子カーゴを導入することです。この技術は、最近、研究や臨床現場で広く使用されるようになりました。ここでは、最近開発された「エレクトロポレーションサイトメトリーシステム」を用いた、生細胞の蛍光顕微鏡法を用いたエレクトロポレーション技術について述べます。

要約

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パルス電界(PEF)は、医学研究や臨床応用において幅広い用途があります。研究の主要な分野は、エレクトロポレーション(可逆的または不可逆的)に焦点を当てています。可逆的エレクトロポレーションは、プラスミドDNAなどの細胞膜を介して分子を移動させるために数十年にわたって使用されてきました(一般に遺伝子エレクトロトランスファー(GET)と呼ばれます)。逆に、不可逆的なエレクトロポレーションは、がん治療において一般的な技術となり、PEFを使用して細胞を永久に破裂させることにより、無毒の代替手段を提供します。これは、さまざまな種類の薬物や試薬と組み合わせて、電気化学療法(ECT)として知られるようになった効果を高めることができます。しかし、実用化が広く成功しているにもかかわらず、現在の技術を改善するためには、さらなる支援技術と研究が必要です。これに対処するために、長期の蛍光顕微鏡検査を行う能力を備えた生細胞PEF実験をサポートするエレクトロポレーションサイトメトリーシステムが開発されました。これは、PEF曝露に対する細胞周期の変化を評価するために、安定的に発現するFUCCI(CA)5 U2-OS細胞株と組み合わせたものです。これにより、最大30時間のタイムラプス顕微鏡法が達成され、FUCCI(CA)5レポーターに基づいて細胞活性のリアルタイムな変化が得られました。その結果、フェーズ固有の変化は、ダウンストリーム分析のために定量化可能でした。

概要

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パルス電界(PEF)は、生物学および臨床応用1におけるさまざまな応用の一般的なツールに成長しました。これらは、エレクトロポレーション(EP)と電気刺激(ES)によって大きく分類できます。エレクトロポレーションには、可逆エレクトロポレーションと不可逆エレクトロポレーションと呼ばれる2つのサブフィールドがあります。可逆的エレクトロポレーション(RE)は、プラスミドDNAなどの分子カーゴを哺乳動物、細菌、酵母などの様々な種類の細胞に転写するための効果的なツールとして何十年にもわたって使用されてきた2。最近では、不可逆的エレクトロポレーション(IRE)が、現在のがん治療の無毒な代替手段として注目を集めています3。新たなサブフィールドは、パルスフィールドアブレーション(PFA)と呼ばれ、特に特定の心機能障害の治療のための非熱組織除去に焦点を当てています4。これは、薬物や他の試薬と組み合わせて、電気化学療法(ECT)の開発につながっています。しかし、PEF治療に関する現在の理解は、臨床応用5によって追い越されています。ここでは、電気化学療法を調査するためのエレクトロポレーションサイトメトリーシステムを紹介します。細胞周期は細胞生存率の重要な指標であり、変化は相特異的な影響を特定できます。これらのツールを開発することで、プロトコールをより迅速に適応させ、より広範ながんに対してより効果的な治療を提供することができます。

当社のカスタムエレクトロサイトメトリーシステム(図1)は、アルミニウム製の平行プレート電極とカバーガラスの底部を備えたチャンバーと、単純な指数関数的減衰パルス発生器で構成されています。チャンバーは3Dプリントされたチャンバーで構成されており、#1.5カバーガラスの底部は医療グレードの感圧接着剤で貼り付けられています。電極は、チャンバーに組み込まれたサポートの上に配置された接着アルミニウムフィルムから形成され、0.4cm間隔で2つの平行電極を提供します。これは市販の電極の一般的な構成であり、現在のプロトコルに迅速に適応できる堅牢な設計を提供します。このチャンバーは、25 mm x 55 mmスライド用に設計された環境エンクロージャーに収まります。これは、市販の顕微鏡プロバイダーがサポートする一般的なスライド形式でもあります。パルス発生器は、最大330Vの指数関数的減衰パルスを提供し、可逆的および不可逆的なエレクトロポレーションを含む幅広い実験を達成することができます。

PEFが細胞周期に及ぼす影響を研究するために、蛍光生細胞周期レポーターコンストラクトである蛍光ユビキチン化細胞周期指標(CA)5(FUCCI(CA)5)を発現するトランスジェニックヒト骨肉腫細胞株(U2 OS)を使用しました。このシステムでは、2種類の蛍光性の切断型であるジェミニンとCdt1が導入され、細胞周期中に特定の速度で生成およびリサイクルされます。さらに、アポトーシスは、安定して発現するU2-OS細胞のFUCCI(CA)5系統を使用して、実験中に直接的にモニターすることができます。細胞周期中、レポーターは、細胞内で自然に発現する機能バージョンと同じ速度で生成および分解されるため、各フェーズで予測どおりに動作します。アポトーシスが発生すると、このサイクルは中断され、細胞サイクルが急速にシャットダウンします。典型的には、これは細胞周期内で蛍光が衰退し、続いて核の劇的な形態学的変化として視覚的に現れますが、これはレポーターの核への局在化によりはっきりと見えます6。これにより、単一細胞の各フェーズを経時的に視覚的に識別できます(図2)。可逆的なエレクトロポレーションは細胞内条件に変化を引き起こし、180 Vの指数関数的減衰パルスを調査のために選択しました。このパルスは、細胞死を可能な限り制限し、集団の大部分でエレクトロポレーションを確実にするために選択されました。これは、6つの哺乳類細胞株の最適なエレクトロポレーションパルスパラメータを調査した先行研究に基づいて決定されました。180 Vパルスのエネルギー密度は、最適なトランスフェクションパラメータよりもわずかに低く、高ポレーション7でより優れた細胞生存率が得られました。パルスの影響は、PEF適用の有無にかかわらず、チミジンダブルブロックを使用して、非同期細胞およびS期同期細胞で研究しました(図3)。その結果、SとG2の平均長さは対照と比較して減少したことが示されました。これは、S期がPEF曝露に感受性があり、その結果、細胞周期が速くなることを示しました。これにより、エレクトロポレーションサイトメトリーシステムが、PEFの送達と長期の生細胞イメージングを組み合わせて細胞周期を研究できることが実証されました。このプラットフォームを使用して、PEFに応答した細胞周期における細胞の進行を観察しましたが、これはPEFや細胞培養のさまざまなアプリケーションや条件を研究するための有用なツールです。

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プロトコル

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1. 細胞培養の準備

  1. 0.4 cmキュベットに100 μLの再懸濁U2 OS細胞(6 × 106細胞/ mL)と5 μgのプラスミドDNAを注入し、180 Vの方形波パルスを10 msのパラメータで可逆的エレクトロポレーションを使用して安定ラインを調製します。
  2. 適切な3Dプリンターとポリ乳酸(PLA)などの生体適合性プラスチックを使用して、カスタムチャンバーデザインをDプリントします( 補足ファイル1を参照)。完成したチャンバーをエタノール(70%)で消毒し、滅菌容器で保存してから使用してください。
  3. 10 mLのDulbecco's Modified Eagle Media(DMEM)-High Glucose with 10 mL of Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM)-High Glucose containing 10% Fetal Bovine Serum and 1% PenStrepを入れたU2-OS FUCCI(CA)5細胞を10 cmプレートで培養し、37 °Cおよび5% CO2でインキュベートします。
  4. 培養液が80%のコンフルエントに達したら、培地を吸引し、細胞培養物をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、1 mLの0.25%トリプシンを1.5分間使用して細胞を解離します。
  5. 細胞培養液を5 mLのDMEM-High Glucose(10% FBSおよび1% PenStrepを含む)に再懸濁することにより、トリプシンを中和します。
  6. 再懸濁した細胞培養液から100 μLのサンプルを採取し、底面のガラスカバースリップ上のエレクトロポレーションサイトメトリーシステムチャンバーに入れます。サンプルを導入した後、チャンバーが30%コンフルエントであることを確認してください。インキュベーション前にサンプルが過剰にコンフルエントであると思われる場合は、サンプルを吸引し、サンプル量を減らします。
  7. チャンバーの遠端に4 mLのDMEM-High Glucose(10%FBSと1%PenStrepを含む)をゆっくりと加え、液体がサンプルを洗い流すのを防ぎます。
  8. チャンバーの上部に標準的な顕微鏡スライドを置き、チャンバーを37°Cおよび5%CO2 で24時間インキュベートし、培養物がチャンバー底部に完全に付着していることを確認します。オプションで、Hoechst 33342(1 μg/mL)を使用して細胞核を染色すると、下流の細胞定量とアポトーシスが容易になります。タイムラプス顕微鏡検査の30分前に染色を行います。

2. 顕微鏡の準備

  1. まず、環境制御とチャンバーを備えた倒立型蛍光顕微鏡の電源を入れ、エレクトロポレーションを行う前に条件が安定するようにします。
    注:25 mm x 55 mm x 16 mmのチャンバースライドを受け入れることができる環境システムを備えた倒立蛍光顕微鏡。この設計はもともと、参照された倒立顕微鏡( 材料の表を参照)と対応する環境システムで動作するように設計されました。
    ステージの加熱は、金属の膨張により画像にドリフトを引き起こす可能性があります。
  2. 環境システムが最適な温度に達している間に、適切な電気ケーブルを使用してデジタルマルチメータをパルス発生器コンデンサと高電圧スイッチに接続します。このプロトコルに従うには、「ワニ口」クリップケーブルを使用して、エレクトロポレーションチャンバーでの迅速な組み立てと分解を可能にします。
  3. 次に、倍率20倍を選択し、顕微鏡のソフトウェアを使用して、FITC(GFP)およびA594(TexRed/mCherry)チャンネル(オプションでHoechst 33342のDAPIチャンネル)がFUCCI(CA)5システム内の2つの蛍光タンパク質に対応して選択されていることを確認します。低露出設定(通常は<0.05秒)を使用して、長時間のタイムラプスでの写真の損傷を防ぎます。
  4. タイムラプスを開始する前にテスト画像を撮影して、画像の焦点と品質を最適化します。
    注:蛍光は、色の視覚化に必要な明るさだけにする必要があります。
  5. タイムラプスをプログラムして、 10分ごとに3〜6ビューポイントを24時間 キャプチャすると、タイムラプスごとに大量の細胞周期データを取得しながら、写真の損傷を軽減します。
    注:時間の長さは、細胞活動のタイムスケールによって異なる場合があります。
  6. タイムラプス中に細胞培養を追跡する最良の結果を得るために、A594チャンネルでオートフォーカスが有効になっていることを確認してください。
  7. エレクトロポレーションが実行されるまで、ソフトウェアをスタンバイモードのままにします。パルスが送達されたら、すぐにタイムラプスをアクティブにして、可能な限り最高のデータ精度を確保します。

3.エレクトロポレーション

  1. エレクトロポレーションサイトメトリーチャンバーを適切な環境チャンバーを備えた顕微鏡に配置します。エレクトロポレーションの前に、環境システムが稼働している状態でチャンバーを閉じたままにして、細胞周期が影響を受けないようにします。
  2. デジタルマルチメータをパルス発生器に取り付け、ワニ口クリップケーブルを使用してパルス発生器をチャンバー電極に接続します。
  3. パルス発生器のコンデンサを180Vまで充電し、デジタルマルチメータが0ボルトを読み取るまでパルスをチャンバーにすばやく放電します。
  4. チャンバーへの電気接続を取り外し、適切な培養条件を確保するために、できるだけ早く蓋を元に戻します。
  5. 顕微鏡環境システムが設置されたら、すぐにタイムラプスをアクティブにします。

4. タイムラプスデータ取得

  1. タイムラプスが完了したら、顕微鏡ソフトウェアを使用して、タイムラプスの長さにわたってキャプチャされた画像に基づいてタイムラプスを単一のビデオとして保存します。この段階で視覚的な品質を向上させて、手動による定量化を支援します。
    注:任意のフレームレートを選択できます。ただし、6 フレーム/秒では、1 ビデオ秒で適度なリプレイ速度が得られ、1 時間のリアルタイムになります。
  2. タイムラプスビデオが準備されたら、FITCおよびA594信号の変化を観察して、細胞相を経時的に追跡します

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結果

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FUCCIシステム(図2)を使用して、タンパク質の発現と非ビキチン化の結果として細胞が各色を発現した時間の長さを測定することにより、視覚的な細胞周期データを取得しました。非同期実験と同期実験の結果(図3)に基づいて、S期PEF曝露が細胞周期をアップレギュレーションすることは明らかでした。これは、平均期長の減少によって証明され、細胞周期が速くなったことを示しています。さらに、細胞周期に対するチミジンの長期的な影響も示しました。同期した集団の対照データは、同期していない集団と比較して、より長い平均細胞周期を示しました。逆に、S期同期集団をパルスした後、平均細胞周期長は非同期対照と同等でした。

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ディスカッション

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正しく実施すれば、細胞周期の位相データを、最大24時間にわたって大量の単一細胞について定量化することができます。このプロトコルでは、FACなどの代替法と同等の細胞周期データが得られました。これは、細胞が細胞周期を進行するにつれて蛍光標識される一般的に使用される方法です。少なくとも24時間インキュベートした後、それらは蛍光強度によって選別され、特定のフェーズ8の集団の量と相関します。この方法を用いた先行研究では、U2 OS細胞が約23-24時間9で細胞周期を実行することが実証された。これは、FUCCI(CA)5システムを使用した結果と一致しており、現在のプロトコルが従来の細胞周期報告技術と同様の精度を再現できたことを示しています。

このプロトコルではU2 OS細胞の使用について概説していますが、FUCCI(CA)5コンストラクトは、他の多くの細胞株で使用するための強力なツールとなります。PEF実験は、利用可能なさまざまな...

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開示事項

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著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

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グプタラボとラクスグループのメンバーの皆様には、ラボ内外での継続的なご支援に感謝申し上げます。Mitacsとのパートナーシップを通じて寛大に提供された助成金。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
チャンバースライド(3Dプリント/アッセンブル) N/AN/A
培養プレート (10 cm)Sarstedt83.3902
Delta VisionOlympusN/A代替顕微鏡モデルも使用できます。ステージと環境システムがエレクトロポレーションチャンバースライド(55 mm x 
DMEM –高グルコースGibco11965092
ウシ胎児血清 サーモフィッシャーA5256701 
i3 MK3S 3DプリンターPrusaN/ASTLファイルを使用できる代替プリンターモデルを使用できます。
ペン 連鎖球菌ThermoFisher15070063
リン酸緩衝生理食塩水Gibco10010031
tFUCCI(CA)5Addgene153521
トリプシンSigma-Aldrich9002-07-07
U2-OS 細胞株ATCCHTB-96

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), 3044(2018).
  2. Kandušer, M., Miklavčič, D. Electroporation in biological cell and tissue: An overview. Electrotechnologies for extraction from food plants and biomaterials. Food Engineering Series. , Springer. New York. (2009).
  3. Cemazar, M., Sersa, G. Recent advances in electrochemotherapy. Bioelectricity. 1 (4), 204-213 (2019).
  4. Iyengar, S. K., Iyengar, S., Srivathsan, K. The promise of pulsed field ablation and the challenges ahead. Front Cardiovasc Med. 10, 1235317(2023).
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