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方法論記事

ラット心筋虚血再灌流障害モデルにおけるジスルフィデプトーシスの鑑別遺伝子解析と検証

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DOI：

10.3791/68019

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2025年4月18日

 , 
1Department of Cardiovascular Medicine, The Affiliated Hospital of Guizhou Medical University

この記事について

サマリー

このプロトコルは、バイオインフォマティクス分析と実験的検証による心筋虚血再灌流障害に関連するいくつかの新規ジスルフィデプトーシス関連差次遺伝子の同定について説明しています。

要約

心筋虚血再灌流障害(MIRI)は、虚血誘発性損傷後の心臓組織の血流を回復する過程で発生する追加の損傷です。MIRIは、心筋 ?? 塞後の再灌流の有効性と短期および長期の予後に深刻な影響を及ぼします。.現在、MIRIのメカニズムは完全には明らかになっていません。ジスルフィデプトーシスは細胞死の新たな様式であり、MIRIとジスルフィデプトーシス関連遺伝子(DRG)の発現との関係はまだ不明です。まず、この研究では、バイオインフォマティクス分析を通じて、MIRIのジスルフィデプトーシスに関連する差次的に発現する遺伝子を調査します。次に、MIRIのラットモデルを構築することにより、DRGがさらに検出されました。この研究では、 Myh9、 SLC7A11、 SLC3A2、 Myh7b、 ACTB、 FLNB、 Actn1、 Actn4、 Flnc、 Dbn1 、 Pdlim1を含む12の関連遺伝子が同定されました。MIRIを有するラットの心筋組織は、明らかな病理学的損傷およびアポトーシスイベントを示す。免疫組織化学の結果は、MIRI刺激が心筋組織におけるGLUT1タンパク質の発現を増加させるが、F-アクチンタンパク質の発現を制限することを示しました。さらに、3つのタンパク質の発現における有意差が、外部データセットとMIRIラットモデルを用いて検証されました。この研究は、DRGがMIRIで有意な予測値を持つことを示し、MIRIのバイオマーカーと潜在的な治療標的を探索するための新たな見通しを提供しました。

概要

急性心筋梗塞(AMI)は重篤な心血管疾患であり、依然として世界の主要な死亡原因となっています。経皮的冠動脈インターベンションは、AMI患者の死亡率を大幅に低下させました1。しかし、心筋の血液供給を回復することを目的とした再灌流療法は、一連の有害な病理学的および生理学的反応を伴います。これらのプロセスは、梗塞サイズの増加、心筋細胞死、持続的な心室性不整脈、および突然死を引き起こす可能性があります2。心筋虚血再灌流障害(MIRI)は、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、酸化ストレス、カルシウム過剰などの要因の影響を受ける複雑な心血管疾患です3。MIRIの軽減は依然として大きな課題です。

近年、ジスルフィデプトーシスは、NADPH+の枯渇により、細胞内にシステインを含むジスルフィドが過剰に蓄積することによる細胞骨格アクチンネットワークの急速な崩壊を特徴とする新しい細胞死形態として浮上しています。ジスルフィドが過剰に蓄積すると、細胞骨格タンパク質間のジスルフィド結合が破壊され、アクチンの遊走と細胞死につながります4,5。アポトーシス、壊死、ピロトーシス、フェロトーシスなど、これまでに報告された細胞死の形態とは異なり、ジスルフィデプトーシスは細胞内ジスルフィドの過剰な凝集によって開始され、他の細胞死経路の特異的阻害剤によって拮抗されません。特徴的な細胞死として、細胞グルコース欠乏症によって引き起こされるSLC7A11過剰発現がジスルフィドトーシスを引き起こす可能性があることを示す証拠があります4。MIRI後、インスリン分泌が不十分になると、低血糖とそれに続くジスルフィドプトーシスが誘発され、心筋細胞にさらなる損傷を引き起こす可能性があり、MIRI5の新たなメカニズムの1つである可能性があります。

本研究では、Gene Expression Omnibus(GEO)などの包括的な遺伝子発現データベースを利用して、正常サンプルとMIRIサンプルの遺伝子発現差を解析することを主な目的としました。MIRIにおいて差次的発現を示すジスルフィデプトーシス関連遺伝子(DRG)の同定を目的として、発現差のある遺伝子とジスルフィデプトーシス関連遺伝子とのクロスリファレンス解析を行った。機械学習アルゴリズムを用いて主要な遺伝子を同定し、動物モデルを用いて選択した対象微分遺伝子の発現パターンを検証しました。このアプローチは、MIRIの発症と進行の根底にある潜在的なメカニズムをより深く理解するための新たな視点を提供します。この研究の主な焦点は、MIRI内の新しい細胞死メカニズムを調査し、関連する差分遺伝子を明らかにし、これらの結果を検証するための予備実験を実施することでした。最終的な目標は、この新たな細胞死メカニズムに基づいて、MIRIを緩和するための新しい治療標的を特定することでした。

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プロトコル

この研究では、湖北実験動物研究センター[SCXK(湖北省)20200018]から、6〜8週齢、体重180〜220 gの9匹のSprague-Dawley(SD)雄ラットを選択しました。ラットは、特定の病原体を含まない動物の家に飼われ、12 h / 12時間の明暗サイクル、無料の飲用と食事で1週間順応しました。本研究は、遵義医科大学第三附属病院動物倫理委員会の承認を得て実施されました(承認番号:(2016)-1-56)。すべての手順は、米国国立衛生研究所が発行した「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals」に概説されている推奨事項に従って実施されました。使用される動物の数を最小限に抑え、その苦痛を軽減するために、厳格な措置が実施されました。

1. MIRIおよびジスルフィデプトーシス関連遺伝子の発現差的解析

注:文献報告6によると、MIRIのGSE214122と名付けられたRNAシーケンシングデータは、ジスルフィデプトーシスに関連する遺伝子をスクリーニングするために選択されました。

  1. GEO データベースを開き、[検索] ボックスに「GSE214122」と入力して Enter キーを押します。生成された Series Matrix File(s) を [ダウンロード] セクションで TXT 形式でダウンロードします。
    注:データ分析を行う前に、通常、ダウンロードしたデータを前処理する必要があります。これには、欠損値のチェック、低品質のサンプルと遺伝子の除去、データの正規化または標準化の実行が含まれます。取得されたGSE214122データセットには、sham-operatedグループとMIRIグループからのサンプルが含まれていました。
  2. DESeq2パッケージ7を使用してサンプルの遺伝子発現差解析を行います。|log2FC|>1 (倍率変化が 2 より大きい) および FDR<0.05 の遺伝子を統計的に有意なものと考え、MIRI に関連する発現差のある遺伝子が同定されます。ステップ1.2で、Rのpheatmap package7を使用して、遺伝子発現の差次的ヒートマップを生成します。
  3. R の VennDiagram パッケージ7 を使用してベン図を作成します ( 材料の表を参照)。Volcano プロットを生成して、R7 の EnhancedVolcano パッケージを使用してジスルフィデプトーシス関連遺伝子を可視化します。
  4. STRINGデータベース7 を用いて、MIRI差次発現遺伝子とジスルフィデプトーシス遺伝子をつなぐPPIネットワークを構築する( 資料表参照)。

2. ラットMIRIモデルの構築

  1. 麻酔を行う前に、ラットを一晩絶食します。2% ペントバルビタールナトリウム (40 mg/kg) の腹腔内注射によりラットに麻酔をかけ、手足を仰臥位でラットボードに固定します。足の指をつまむような痛みに反応しないこと、立ち直り反射の喪失、アイウインク反射で麻酔の深さを確認します。麻酔下での乾燥を防ぐために、獣医用軟膏を使用してください。
  2. 首と胸の皮膚をヨードフォアで消毒し、75%アルコールで脱ヨウ素化します。首と左胸の毛皮を電気カミソリで剃り、メスで首の中央部を長さ約2.5cmに切開します( 素材表参照)。
  3. 鉗子で気管を分離し、小動物の人工呼吸器3 に接続して気管内挿管を行います( 材料の表を参照)。
  4. 胸骨の左側に沿って縦4cmを点眼ハサミで切り、皮下筋を鉗子で鈍く分離して、第3肋骨と第4肋骨の間の胸膜を露出させます。
  5. 剣状突起から左第2肋間腔の中央まで4〜5cmの切開を行い、メスを45°の角度で保持します。眼科用鉗子を使用して、大胸筋と前鋸筋を穏やかかつゆっくりと分離し、肋間腔にアクセスします。
  6. 左肋骨、肋骨、肋骨4本目の間に1.5cm横切開を眼ハサミで行います。眼科用鉗子を使用して心膜を解剖した後、鉗子で左心房付属器を上げて、大動脈基部の冠状動脈口を特定します。
  7. 6-0縫合糸を使用して、肺円錐と左心房付属器の間の左前下行冠状動脈を結紮します( 材料の表を参照)。
  8. 30分後、縫合糸を緩めて120分間再灌流し、続いて6-0縫合糸を使用して筋肉層と皮膚層を閉じます。ペニシリンを塗布します( 材料の表を参照)腹腔内注射により、80,000〜100,000ユニット。.
  9. 偽グループでは、モデルグループに対して行われたすべての手順を実行しますが、結紮や再灌流は行わずに左前下行冠状動脈のみを通します。
  10. ラットが意識を取り戻したら、気管内チューブを取り外します。ネズミを動物施設に戻し、回復させ、餌と水を無料で利用できるようにします。手術を受けたラットを、無菌実験室の独立した換気システムを備えた単一のケージに収容します。
  11. 30 分間の虚血と 120 分間の再灌流中に、心エコー検査を行います。モデリングは、左心室駆出率が50%未満である場合に成功したと見なされました1,6。

3.心臓組織3を採取します

  1. 120分の再灌流後、ラットを安楽死容器に入れ、二酸化炭素を吸入して安楽死を実施します。すぐにラットの心臓組織を採取します。
  2. シェービング装置でラットの腹部の毛を取り除き、ヨウ素と75%アルコールで胸部前部を滅菌します。ラットの腹腔を腹部の正中線に沿ってメスで解剖します。
  3. 剣状突起から顎下腔まで上方に手術用ハサミで皮膚を切除し、両側の鉗子で皮膚と皮下組織を鈍く剥がして、胸郭と表在性頸部筋層を露出させます( 材料の表を参照)。
  4. 手術用ハサミで胸部と胸膜を正中線に沿って開いて心臓を露出させ、血管クリップで大動脈をクランプし、眼ハサミで動脈を切断します。心臓を取り出し、氷浴で冷たい生理食塩水で1 mm3 組織ブロックに解剖し、4%パラホルムアルデヒドで48時間固定します( 材料の表を参照)。

4. ヘマトキシリン-エオシン(H&E)染色

  1. 脱水と埋め込み:75%アルコール、85%アルコール、95%アルコール(I)、95%アルコール(II)、100%アルコール(I)、および100%アルコール(II)に順番に各溶液に1時間浸すことにより、心臓組織ブロックを脱水します。キシレン(I)とキシレン(II)で各溶液に15分間浸漬して透明化します。心臓組織ブロックを流動パラフィン(I)、パラフィン(II)、パラフィン(III)に順番に20〜30分間入れます。パラフィンブロックが固まるまで自然に冷まします。
  2. パラフィンスライシングマシンを使用して、パラフィン包埋心臓組織ブロックを4 μmの切片にスライスします( 材料の表を参照)。45°Cのウォーターバスで柔らかいブラシで切片を平らに置き、スライドで完全に拡張した切片を拾います。
  3. 脱ロウ:スライスをオーブンで55°Cで30〜60分間焼き、キシレン(I)で5〜10分、キシレン(II)で5〜10分脱ロウします。その後、キシレンを無水エタノールで1〜5分、95%エタノールで1〜5分、75%エタノールで1〜5分洗浄し、水道水で1〜5分間すすぎます。
  4. 染色:ヘマトキシリン溶液で5〜20分間染色し、水道水で5〜10秒間すすぎ、エオシン溶液で15〜30秒間染色し、75%〜85%エタノールで30秒間洗浄します。
  5. 脱水、透明、およびシーリング:95%エタノール(I)で0.5〜2分間、95%エタノール(II)で2〜5分間、続いて無水エタノール(I)で2〜5分間、無水エタノール(II)で2〜5分間脱水します。キシレン(I)で1分間、キシレン(II)で1分間透明化した後、中性樹脂を2滴加えてシールし、カバーガラスを敷きます。カバーガラスを軽く押して、スライスに中性樹脂を充填します( 材料の表を参照)。
  6. 光学顕微鏡で200倍の倍率で、2人の独立した技術者が二重盲検法で各スライスを観察します。
    1. 3つのランダムな視野を選択して、心筋のうっ血、出血、線維症、壊死、および変性を評価します。次の採点基準を使用してください: 0 は病変がないことを示します。0-1は、病変が指定された領域の1/4未満であることを示しました。1-2は、指定された領域の約1/4−1/2の範囲の病変を示しました。2-3は、指定された領域の約1/2−3/4の範囲の病変を示しました。3-4は、病変が指定された領域の3/4より大きいことを示しました。

5. TUNELアッセイ

  1. プロテイナーゼKをリン酸緩衝液(PBS)で40 μg/mLに希釈し、ステップ4.3で調製した4 μm切片に100 μLのプロテイナーゼKを加えてサンプル領域全体を覆い、室温で10分間インキュベートします。
    注:プロテイナーゼKはTUNELアポトーシス検出キットに含まれています( 材料の表を参照)。
  2. 切片をPBSで2回ずつ5分間洗い、濾紙で吸引して余分な液体を取り除き、切片を湿った箱に入れて湿らせておきます。
    注:プロテイナーゼKは、その後の標識反応を妨げないようにきれいに洗浄する必要があります。
  3. 2 μLのTdT酵素と48 μLのTUNEL反応バッファーを含む50 μLのTUNEL反応溶液を均一に加え、切片をウェットボックスに入れて37°Cで暗所で2時間インキュベートします。
    注:TdT酵素とTUNEL反応バッファーは、TUNELアポトーシス検出キットに含まれています。
  4. TUNEL反応溶液を廃棄し、PBSで2回、各5分間すすぎます。切片を0.1%Triton X-100および5 mg/mL BSAを含むPBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。
  5. 50 μLのDAPI染色溶液を均一に添加し、暗所で室温で10分間インキュベートします。DAPI染色溶液を廃棄し、切片をPBSに毎回3回、5分間浸します。
  6. 励起波長が593/614 nm、発光波長が364/454 nmのTUNEL赤信号とDAPI青信号を取得します。蛍光顕微鏡で200倍の倍率で画像を撮影します( 材料の表を参照)。

6. 免疫組織化学染色

  1. ステップ4.3の切片に200 μLの強化された内因性ペルオキシダーゼブロッキングバッファーを加え、暗所で室温で10分間インキュベートします。切片を蒸留水で2回、それぞれ5分間洗浄します。
  2. 改良したクエン酸抗原賦活化溶液1 mLと再蒸留水49 mLを抗体インキュベーションボックスに加え、穏やかに混合します。切片を抗原賦活化溶液に浸し、95°Cで20分間加熱してから室温まで冷却します( 材料の表を参照)。
  3. 切片をPBSで2回、それぞれ5分間洗浄します。切片を抗体インキュベーションボックスに入れ、F-actin(1:100)、GLUT1(1:200)、Myh9(1:200)、SLC7A11(1:200)、SLC3A2(1:200)に対する一次抗体100 μLと4°Cで一晩インキュベートします。
  4. 切片をPBSで2回、それぞれ5分間洗浄します。100 μLの二次抗体を切片に添加し、室温で20分間インキュベートします。
  5. 切片をPBSで2回、それぞれ5分間洗浄します。100 μLのDAB作業溶液で室温で5分間染色し、精製水で洗い流して発色反応を停止します。
    注:DABワーキングソリューションは、DABセイヨウワサビペルオキシダーゼカラー現像キットに含まれているDAB発色性溶液AとDAB発色溶液Bを1:1の比率で混合することによって調製されました( 材料の表を参照)。
  6. 切片を100 μLのヘマトキシリン染色溶液で3分間染色し、流水で3分間洗浄します( 材料の表を参照)。
    注:ヘマトキシリンおよびエオシン染色キットには、ヘマトキシリン染色溶液が含まれています。
  7. 切片を75%エタノール、95%エタノール、および100%エタノールにそれぞれ2分間浸します。
  8. 切片を中性樹脂で密封し、カバースリップで覆い、200倍の倍率の光学顕微鏡で切片を検査します( 材料の表を参照)。茶色を呈する組織は肯定的な反応です。正の発現率は、視野の総面積に対する染色領域の比率として計算します。Image Jソフトウェアを使用して定量分析を行います。

7. ウェスタンブロット検出

注:溶解バッファーとプロテアーゼ阻害剤は、BCAタンパク質定量キットに含まれていました( 材料の表を参照)。

  1. ステップ 3.5 で得られた新鮮な心筋サンプル0.1 gを秤量し、1 mLの溶解バッファーおよび10 μLのプロテアーゼ阻害剤と混合した後、ガラス製粉砕容器で粉砕し、10,304 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
  2. 上清を採取し、製造元の指示に従ってBCA法を使用してタンパク質定量を行います8。上清を95°Cで5分間沸騰させます。
  3. 10% 分離ゲルを使用して、10 μL サンプルをロードし、80/120 V でタンパク質電気泳動を行い、分子量の異なるタンパク質を分離します。
  4. ゲル上のタンパク質をPVDFメンブレン9に移す。その後、メンブレンを5%脱脂粉乳で1時間ブロッキングし、Myh9、SLC7A11、SLC3A2、およびβ-チューブリン一次抗体と1:1000の希釈率で4°Cで一晩インキュベートします( 材料の表を参照)。
  5. PBS 3xで各5分間洗浄した後、メンブレンを二次抗体(1:5000; 材料表を参照)と室温で2時間インキュベートし、続いてPBS 3xで各5分間洗浄してから、タンパク質可視化装置で可視化します( 材料の表を参照)。
  6. Image J ソフトウェア 8,9 を使用して、バンドの β-チューブリンに対するグレースケール比を計算します。

8. 統計分析

  1. データを平均±標準偏差として表します。一元配置分散分析とそれに続く最小有意差の事後検定を使用してデータを分析します。市販の統計分析ツール ( 「資料の表」を参照) を使用して統計分析を実行し、p < 0.05 を統計的に有意であると考えます。

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結果

MIRIにおけるDRGのスクリーニング
Gene Expression OmnibusのGSE214122データセットには、3つの偽サンプルデータと3つのMIRIサンプルデータが含まれていました。RのDESeq2パッケージを使用して、MIRIサンプルと偽サンプル間で1233の差次的に発現する遺伝子(DEG)が同定されました。|log2FC|>2 と FDR<0.05 に基づいて、R の pheatmap パッケージを使用して、417 の有意に異なる遺伝子をさらに選択しました (図 1A)。次に、これらの1233個のDEGと106個のDRGとの間の15の交差遺伝子が 図1Bに示されました。差分的に表現された 15 個の DRG には、 図 1C に示すように、火山マップ上に 12 個の DRG がラベル付けされた火山プロットによってさらに注釈が付けられました。次に、15のDRGのPPIネットワークがSTRING...

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ディスカッション

ジスルフィデプトーシスは、細胞の形状と生存率を維持するために不可欠な重要な細胞構造であるアクチン細胞骨格と密接に関連しています。アクチンフィラメントで構成されるアクチン細胞骨格は、細胞全体の形状と構造を付与します。F-アクチンは細胞骨格のマーカーとして機能し、グルコース飢餓の条件下では、ジスルフィド結合が著しく増加し、F-アクチンのダウンレギュレーションにつながります。この現象は、主にアクチン細胞骨格と細胞接着10,11に関連するプロセスと経路に影響を与える。

グルコース代謝の文脈では、グルコーストランスポーター(GULT)はグルコースの動的バランスを維持する上で重要な役割を果たします。GLUT1は、GLUTファミリーの中で最も早く発見されたメンバーの1つであり、広範囲に組織分布するグルコース取り込み関連タンパク質です。これは主に赤血球12 および血液...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

本研究は、貴州省科学技術局(Qiankehe [2022]-583)および貴州省中医薬管理局(QZYY-2016-019)の支援を受けた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
75% アルコール湖南 Tongruijian Pharmaceutical Co. Ltd.、湖南省、中国85026
6-0 ナイロン縫合上海浦東金環医療用品有限公司、上海、中国CS002
BCA タンパク質定量キットBeyotime Biotechnology、上海、中国P0011
雄牛血清アルブミンBeyotime Biotechnology、上海、中国ST2254
遠心分離機湖南省カイダ科学機器有限公司、湖南省、中国 KH19A
DAB 西洋ワサビペルオキシダーゼカラー現像キットBeyotime Biotechnology、上海、中国P0203
DAPI染色液Beyotime Biotechnology、上海、中国C1006
DESeq2パッケージバージョン4.1
電気カミソリKelmerpp235376
Enhanced endogenous peroxidase blocking bufferBeyotime Biotechnology, Shanghai, ChinaP0100B 
濾紙Nanjing Keruicai Equipment Co., Ltd., Nanjing, China1.00049E+11
蛍光顕微鏡NikonECLIPSE Ci
GEO データベースhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
ガラスグラインダーShanghai Leigu Instrument Co. Ltd., Shanghai, ChinaB-013002
GraphPad PrismGraphPadソフトウェアV8.0
ヘマトキシリンおよびエオシン染色キットBeyotime Biotechnology, Shanghai, ChinaC0105M
Image J softwareNational Institutes of Health, Bethesda, USAv1.8.0
Improved Citrate antigen Retrieval solution (50X)Beyotime Biotechnology, Shanghai, ChinaP0083
IodophorFolca, Shenzhen, China1.00077E+11
光学顕微鏡Nikon ECLIPSE Ci
リン酸緩衝液Beyotime Biotechnology, Shanghai, ChinaC0221A
一次抗体 GLUT1Proteintech Group, Inc, Wuhan, China21829-1-AP
MYH9Proteintech Group, Inc, Wuhan, China11128-1-AP
SLC3A2に対する一次抗体Wuhan Lingsi Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, ChinaLJS-D-7468
antibodies against SLC7A11Proteintech Group, Inc, Wuhan, China26864-1-AP
タンパク質可視化装置Thermo Fisher Scientific Inc.iBright CL750
ラットボード鄭州Haopai Biotechnology Co. Ltd., 鄭州, 中国JPB-E
メスShanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd., Shanghai, China1.00471E+13
二次抗体Wuhan Boster Biological Technology, Ltd., Wuhan, ChinaBA1054
STRING データベースhttps://cn.string-db.org/Version12.0
Triton X-100Beyotime Biotechnology、上海、中国ST1722
TUNELアポトーシス検出キットProteintech Group、Inc.、武漢、中国PF00009
糸 Primary

参考文献

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