このプロトコルは、嫌気性条件下での複雑な糞便群集の連続フロー培養に利用されるミニバイオリアクターアレイの組み立てを詳述しています。また、さらなる分析のために、反応器の組み立て、接種、およびサンプリングの方法についても説明します。
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この記事について
サマリー
要約
微生物叢、特に細菌は、微量栄養素や多量栄養素、薬理学的化合物、炎症性メディエーターなどのさまざまな環境曝露に反応し、コミュニティの構成と微生物の代謝出力を動的に変化させます。生理学的培養条件が微生物群集や多様性、およびそれらの代謝能力にどのように影響するかを理解することは、それらが健康と病気に与える影響に関する重要な知識に貢献します。ここでは、Auchtungらが公開したテンプレートを基に、複雑な糞便群集を培養し、栄養素の利用可能性、温度、流量、pH、酸素含有量などの正確な条件下で細菌コンソーシアムまたは単一株を定義できるミニバイオリアクターアレイを作成するためのプロトコルを紹介します。ミニバイオリアクターシステムの構築プロセスについて、公開されたプロトコルの制限を改善するための適応を含めて説明します。また、多様な細菌の増殖をサポートするリッチメディアであるMEGA培地(Han et al.から採用)を使用した嫌気性条件下でのミニバイオリアクターシステムのセットアップについても説明します。腸のヒト化マウス糞便サンプルをミニバイオリアクターシステムに接種し、続いてミニバイオリアクターシステム内で複雑なコミュニティ培養を確立し、コミュニティ組成を監視するための無菌サンプリングを使用して連続フローで成長させる方法について説明します。このシステムは、食事の変更やその他の文化的変更に適応できます。ここで説明する手法は、動的条件下で、または宿主由来の要因から分離して摂動に応答して、多様で気難しい糞便群集の特性評価を可能にします。
概要
腸内細菌叢は、細菌、真菌、古細菌、ウイルスなどの微生物の広大なネットワークであり、これらの微生物には、人間の宿主をはるかに上回る膨大な遺伝的および代謝的レパートリーが含まれています1。マイクロバイオームの豊富な代謝能力には、食事栄養素の細菌処理から生成される代謝物、細菌によって化学的に修飾された宿主代謝物、および微生物叢によって一意に合成される代謝物が含まれます2。微生物叢は、ほぼすべての宿主のバイオプロセスに関与していますが、炎症性腸疾患、癌、代謝障害、さらには神経障害などの病状にも関与しています2,3。微生物叢の寄与と宿主の寄与を解剖することは、健康と疾患における特定の微生物または複雑なコミュニティの役割を理解するために不可欠です。この解剖を可能にする1つのアプローチは、ダイナミックな条件下で多様な微生物群集を培養する微生物バイオリアクターの使用です。大規模なバイオ製品の栽培や代謝過程の研究のための特定の栄養因子の正確な制御など、ほぼすべての目的で糞便細菌群集の成長を可能にする多くの市販のバイオリアクターがあります。しかし、これらのシステムは莫大な費用がかかり、広範な準備が必要であり、多様な実験条件を並行して検討することはできません。より安価で、より適応性があり、多くの並列条件を可能にする簡素化されたアプローチのために、ここでは、Auchtung et al.4から適応された連続フロー下でのミニバイオリアクターアレイのセットアップと使用のためのプロトコルを示します。
ミニバイオリアクターシステムの完全なセットアップを 図1Aに示します。このミニバイオリアクターシステムは、互いに完全に独立し、蠕動流下の嫌気性チャンバーに設置された6つのリアクターウェルのアレイを使用して、連続的な培地の送達と除去を可能にします(図1A)。各リアクターアレイは60ポジションの磁気攪拌プレート上に配置され、2つの48カセット蠕動ポンプがソースメディアと廃棄物の流れのための2ストップチューブを保持しています(図1A)。嫌気性チャンバーには、酸素含有量のCAM-12嫌気性モニター、加熱能力で酸素を除去する触媒ボックス、細菌の代謝から余分なガスを吸収する硫化水素除去カラムが装備されています。各リアクターウェルには、ソースメディアインレット、ディスレットアウトレット、サンプルポートが装備されており、個々のリアクターウェルの接種やサンプリングが可能です(図1B)。
前述のように、バイオリアクターシステムは、温度、培地消費、および栄養素の利用可能性を動的に制御し、糞便群集の培養と維持をサポートします。加熱能力のある触媒ボックスによって温度を調節し、嫌気性チャンバー全体の温度変化を迅速に実施することができます。媒体の消費量は、反応器内の媒体回転を変えるために変更できる蠕動ポンプの流量によって制御されます。培地の回転率は、リアクターで培養されるコミュニティタイプに合わせてカスタマイズでき、例えば、成長の遅いまたは非常に急速に成長する標的株に適応させることができます。最後に、栄養素の利用可能性は、各リアクターウェルの個々のサンプルポートを介してコンポーネントを追加することで動的に変更できます。実験の開始時に変更できる静的条件で、システム内で動的制御が行われていないのは、培地の種類、酸素含有量、および同時反応器の数です。調査担当者は、任意のソース メディアを実装することを選択でき、ここでは 1 つのメディアについて説明しますが、他のソース メディア タイプは無数に成功裏に実装されています。反応器は、好気性または微好気性の条件下で運転することができます(微好気性チャンバーの利用可能性によって異なります)。最後に、研究者の実験ニーズに応じて、必要な数のリアクターを設置できます。リアクタはアレイ内に 6 つのセットにありますが、各リアクターは他のリアクターとは独立して動作し、必要に応じてそれぞれを異なるソースにリンクできます。
このモジュール式バイオリアクターシステムは、約25,000ドル(嫌気性チャンバーまたはチャンバー固有のコンポーネントを含まない)で完全にセットアップでき、再利用できない唯一の部品は、システムの実行ごとに100ドル未満で交換できるチューブです。このシステムはほとんどが自動化されていますが、メディアソースのボトルが空になったら交換する必要があるため、メディアレベルを毎日チェックする必要があります。さらに、サンプリングは手動で完了する必要があり、システムに対する動的な条件付き変更(温度の変更など)は手動で開始する必要があります。Auchtungらによって公開された元のシステムプロトコルから、全体的なパフォーマンスとユーティリティ4を改善するためにいくつかの変更が実装されました。まず、バイオリアクターアレイの3Dプリンティング用の材料をABSのような半透明透明プラスチックに改造し、オートクレーブを繰り返してシステムの構造的完全性を向上させます。さらに、外径 1/8 インチ (3.2 mm) の PTFE チューブ、E-LFL、内径 2.06 mm の 100 フィート チューブの代わりに、より頑丈な素材が使用され、崩壊しにくく、システム内の流れが詰まります。最後に、1/4 -28 mmのねじ山からとげのあるオスアダプターを使用した追加のフィッティングを使用して、メディアソースボトルからのチューブの滑りの変化を減らします。Hanらから、適応されたMEGA培地レシピは、気難しい嫌気性微生物の培養を可能にする、未定義で複雑で非常に豊富な培地を提供します5。この培地は、オリジナルが市販されなくなったため、ヒスチジン-ヘマチン成分の代替調製物を利用するように改変されています。水酸化ナトリウムは、培地を7.0または任意のpHにpH化するためにも使用されます。全体として、このシステムは予算とユーザーフレンドリーで、最適化されており、連続フロー培養システムへの優れたエントリーポイントです。
このプロトコルでは、このミニバイオリアクターアレイシステムのセットアップについて、材料、システムの滅菌、その後の腸内ヒト化マウス糞便サンプルの培養への使用などについて詳しく説明します。この方法の全体的な目標は、制御された条件下で微生物群集を培養するために利用できる、適応可能で費用対効果の高いバイオリアクターシステムを構築することです。ミニバイオリアクターシステムの組み立てのワークフローの詳細な概略図を 図2 に示し、プロトコル内の適切なステップで参照します。この例では、ヒト化腸マウスの同じ糞便サンプルを2つのリアクターに接種し、MEGA培地の連続的な流れの下での微生物群集の構造を説明します。
図1:嫌気性チャンバー内のミニバイオリアクターアレイセットアップの概略図(A)嫌気性チャンバー内の完成したミニバイオリアクターアレイセットアップの全景。6ウェルバイオリアクターアレイは、60ポジションのマグネチックスタープレート上に配置されています。ソースルアーティーネットワークは、2穴ボトルキャップを介して左側のソースメディアに取り付けられています。2つの蠕動ポンプが、それぞれ左右のソースネットワークと廃棄物ネットワークから2ストップチューブを保持します。廃棄物のルアーティーネットワークは、右側の廃棄物ボトルに空になります。アレイシステムの周囲には、CAM-12モニター、加熱能力付き触媒ボックス、硫化水素除去カラムなど、嫌気性チャンバーの運転に必要な機器が配置されています。(B)1つの反応器ウェルに取り付けられたソース、サンプル、および廃棄物ポートの上面図で、反応器内の適切な高さに媒体があります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ミニバイオリアクターアレイの組み立てワークフローの概略図。 (A)ミニバイオリアクターアレイの上から見た図、ソース、廃棄物、およびサンプルポートの向きを示しています。(B)プロトコルのステップ2.3〜2.4を示すビューを備えたミニバイオリアクターアレイの側面図。1/8インチPTFEチューブとフィッティング(1)を取り付けて、廃棄物ポートとサンプルポートに挿入します。PTFEなしの継手(1)をソースポートに挿入します。(C)プロトコルのステップ2.5〜2.6を示すミニバイオリアクターアレイの側面図。継手(2)は、ソースポートと廃棄物ポートに取り付けられています。サンプルポートには継手(3)が取り付けられており、その上に継手(4)が挿入されています。(D)ステップ2.9-2.11を示すミニバイオリアクターアレイの側面図。E-LFL 2.06 mmチューブはソースポートとウェイストポートに接続され、もう一方の端はフィッティング(5)と(6)に接続されています。次に、適切な直径の2ストップチューブをフィッティング(6)に接続します。次に、2ストップチューブの端で逆接続が繰り返され、フィッティング(6)が2ストップチューブに接続し、フィッティング(5)がそれに接続します。最後に、E-LFL 2.06 mmチューブをフィッティング(5)に接続して、ルアーティーネットワークに接続します。(E)ステップ2.12-2.15で説明したソースと廃棄物ルアーティーネットワークのセットアップを表示するミニバイオリアクターアレイのトップダウンビュー。E-LFL 2.06 mmチューブは、フィッティング(5)で終わるもので、各リアクターを複数のフィッティング(7)に接続するために使用され、その最後の開口部はソースまたは廃液ボトルのキャップに接続されています。(F)ステップ2.16-2.17で説明されている2穴ボトルキャップアセンブリの側面図。キャップの1つの開口部は、ボトルの内側に配置されているPTFEチューブに接続されています。その開口部にはフィッティング(1)が挿入され、続いてフィッティング(2)が挿入され、フィッティング(5)に接続されたE-LFL 2.06mmチューブが挿入されます。このフィッティングは、ソースまたは廃棄物のルアーネットワークに取り付けられています。PTFEチューブに接続されていない開口部には、フィッティング(1)を挿入し、続いてフィッティング(2)を挿入し、E-LFL 2.06mmチューブを別のフィッティング(5)に接続します。この端部は、オートクレーブ滅菌中にホイルでキャップされ、滅菌済みの0.22μMシリンジフィルターに将来取り付けることができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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プロトコル
この研究で使用された糞便サンプルは、フロリダ大学(UF)の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認され、UF動物管理施設(IACUCプロトコル #IACUC202300000005)で実施された実験から取得されました。簡単に言うと、男女混合無菌野生型(GF WT;C57BL/6)マウス(UF Animal Care Services Germ-free Divisionによってアイソレーターで飼育および維持されている)を繁殖アイソレーターから移し、微生物操作を可能にするためにISOcage Pバイオエクスクルージョンシステムに入れました。ヒトドナーの糞便から得られる等コロニー形成単位(CFU)をプールしてマウスに強制しました。接種後2週間で、これらのマウスから糞便サンプルを無菌的に収集し、保存し、その後このプロトコルで使用しました。
注:ここで説明する糞便サンプルの収集と調製は、適切な手順の一例としてのみ意図されており、収集されたサンプルの種類(ヒト、マウス、他の動物)とこれらのサンプルの保管方法に応じて、この手順は大きく異なります。個々の研究者は、個々の研究者のニーズに基づいて糞便サンプルの収集と保存のプロトコルを設計するために、適切な文献を参照する必要があります。
1. -80°C保存用の糞便サンプルの典型的な調製
- 嫌気性生存率保存培地を選択します(ここでは、Cary Blairを使用しました)。1 mLの保存培地を滅菌済みにし、バイオセーフティキャビネット内のスクリューキャップ2 mLチューブに分注し、嫌気性チャンバーに移します。
- 糞便サンプルを受け取る前に、すべての供給品(オートクレーブ滅菌スパチュラ、滅菌生理食塩水、および保存培地を含むスクリューキャップ極低温バイアル)が嫌気性チャンバー内で24時間事前に減らされていることを確認してください。
- バイオセーフティキャビネット内の滅菌スナップキャップチューブを使用して、オートクレーブ滅菌された便収集カップと鉗子を使用して、マウスから糞便サンプルを無菌的に収集します。回収後すぐに、チューブを液体窒素で急速冷凍します。
- すぐにサンプルを嫌気性チャンバーに移し、携帯用スケールで計量します。各チューブを事前に計量します。マウスの糞便サンプルの場合、チューブごとに別々の糞便ペレットを分注できます。ヒトサンプルを使用する場合は、滅菌ヘラを使用して各サンプルを攪拌し、極低温バイアルに均等に分割します。各チューブを再計量した後、最適な保存のために、各チューブに推定1:10の糞便培地(質量:質量)の比率で培地を追加します。
注:採取後は、直ちに糞便サンプルを嫌気的に保存することをお勧めします。直ちに保存されなかったサンプルは、新たに保存されたサンプル6,7,8と比較して、生存率、組成変化などが低下している可能性がある。Cary Blair保存培地は、細菌群集の生存率を維持しながら、さらなる増殖を阻害し、-80°Cで保存することができます。 保存培地と糞便の推定比率については、糞便サンプルの湿重量は非常に変動しますが、これが利用可能な最良の推定値です。 - ラベルを貼り、密封し、嫌気性チャンバーからバイアルを取り出し、液体窒素でフラッシュを凍結し、-80°Cで最大1年以上保存します。
2. 6ウェル原子炉アレイの構築
- CADファイル(補足ファイル1)を使用して、6ウェルリアクターの3Dプリントを行います。このファイルは、任意の3Dプリント会社に提出して製造することができます。ABSのような半透明の透明プラスチックを印刷材料として使用することで、リアクターを介した視覚化を可能にすると同時に、オートクレーブサイクルの繰り返しにも耐性があります。
注:6ウェルリアクターアレイは、ABsのような半透明の透明プラスチックからステレオリソグラフィーで作るように依頼しました。生産時にはアレイを傾ける(つまり、パーツを30%〜45%の角度で3Dプリントする)ことをお勧めします。これにより、寸法の不正確さが減少します。この修正により、アレイを斜めに横切るレイヤーラインが表示されますが、リアクタの性能には影響しません。 - 25〜28 mmのタッピングツールを使用して、リアクタアレイの各開口部にネジ山を導入します。
- 1/8インチPTFEチューブから12、25mmのストリップを切り取り、チューブの各セグメントの一方の端をオスルアーのネジ山開口部に挿入して25-28ネジフィッティングにします。フィッティングを指定された廃棄物とサンプルアレイの開口部にしっかりとねじ込みます(図2B)。
注意: かみそりの刃を使用して、チューブの端を円錐形の構成に軽く削り、チューブを挿入により適合させることができます。 - マイクロスターバーをリアクターの各リアクターウェルに挿入し、次にオスの1/4-28ネジを各リアクターウェルのソース穴にねじ込みます(図2B)。
- メスのルアーx1/8インチホースバーブアダプターフィッティングを、各リアクターウェルの廃棄物とソースの1/4-28ネジフィッティングにねじ込みます(図2C)。
- メスルアーx3/32インチホースバーブアダプターフィッティングをサンプルポートの1/4-28ネジフィッティングにねじ込みます。3/32インチのホースバーブアダプターの上にゴム製のセプタムを置き、上部を折りたたみます(図2C)。
- 2セットのE-LFL、2.06 mmチューブを、廃棄物ラインとソースライン用に14 cm、15.25 cm、16.5 cm、17.75 cm、19 cm、および20.25 cmの長さで切断します。
注意: 中央部に巻き付けられた色付きのラベルテープを使用して、チューブの各長さを識別できます。 - E-LFL 2.06 mmチューブを、ソースと廃棄物の接続用のメスルアー1/8インチホースバーブアダプターフィッティングに取り付けます(図2D)。お湯を使用して、チューブの可鍛性を高めます。これにより、チューブがアダプターに簡単にフィットします。
- ロックリングx1/8インチホースバーブアダプターフィッティング付きのオスルアーをチューブのもう一方の端に取り付けます。メスルアーx1/16インチホースバーブアダプターをそれに取り付けます(図2D)。
- 適切なサイズの2ストップチューブを、対応する廃棄物とソース接続に接続します。廃棄物ラインは内径1.14 mm 2ストップチューブを使用し、ソースラインは内径1.02 mm 2ストップチューブを使用します。2ストップチューブのもう一方の端に、別のメスルアーx1/16インチホースバーブアダプターフィッティングを取り付けます(図2D)。
- E-LFL、2.06mmチューブを5cm20個カットし、ロックリング付きオスルアー×1/8インチホースバーブアダプターフィッティングを各チューブの両端に挿入します。5 cmチューブの一方の端を、ロックリング付きオスルアーx1/8インチホースバーブアダプターフィッティングで、各2ストップチューブセクションの端にある空いているメスルアーx1/16インチホースバーブアダプターフィッティングに取り付けます。残りの 19 個のチューブに対してこのプロセスを繰り返します (図 2D)。
- リアクターウェル1と2のソースライン用のE-LFL、2.06 mmチューブを、メスのルアーティーの両端を使用して接続します。ロックリング付きオスルアー付き5cmチューブx両端の1/8インチアダプターフィッティングをティーの中央出口に取り付け、2番目のティージャンクションに通じます(図2E)。
- 3 番目のリアクトル用の E-LFL、2.06 mm ソース チューブを 2 番目の T シャツの反対側に接続します。一方の端には、ロックリング×1/8インチアダプター付きのオスルアー付きの5cmチューブを取り付け、もう一方の端にはロックリング×1/8インチアダプター付きのメスルアーを取り付ける必要があります。リアクトル 4、5、および 6 についても同じパターンに従います (図 2E)。
- 25 cmのE-LFL、2.06 mmチューブをカットし、ロックリング付きオスルアー×1/8インチホースバーブアダプターフィッティングをチューブの一方の端に取り付け、最後に残ったメスルアーティージャンクションに取り付け、もう一方の端にメスルアーx1/8インチホースバーブアダプターフィッティングを取り付けます。この端をアルミホイルで覆います(図2E)。
注:手術中は、オープンエンドを滅菌しておくことが不可欠であるため、オートクレーブ中はホイルで蓋をしてテープで固定することをお勧めします。 - 手順2.12-2.14(図2E)で説明したソースラインと同じ手順を繰り返して、廃棄物ラインを準備します。
- 廃棄物収集ボトルを組み立てるには、2穴のボトルキャップを2Lボトルにゆるく固定します。オスの1 / 4-28ネジ継手をキャップの両方の穴に挿入します。1/8インチホースバーブアダプター付きのメスルアーを、キャップに事前に取り付けられているPTFEチューブに接続されていないおねじフィッティングに取り付けます(図2F)。
- 次に、E-LFL 2.06mmチューブを5cmカットし、ボトルのホースバーブアダプターに接続します。ロックリング付きオスルアーx1/8インチホースバーブアダプターを5cmチューブのもう一方の端に取り付け、ホイルで覆います(このチューブは通気孔として機能します。オートクレーブ後、汚染を防ぐために0.22μmシリンジフィルターが追加されます。 図2F)。
- キャップ全体をアルミホイルで覆います。リアクターと廃液ボトルを121°Cで、最低15psiで45分間オートクレーブ処理し、通常は液体に設定された低速排気プログラムを使用します。リアクターが冷えたら、フィッティングとアルミホイルシールを締め、使用前に嫌気性チャンバーに48時間置いてください。
3. MEGAメディアの準備
- 補足表1、補足表2、補足表3、補足表4、補足表5、補足表6、補足表7、補足表8に従って、すべてのストック溶液を調製する。
- 2 Lのガラス瓶に、 補足表9のすべての乾燥成分を加え、次に1640 mLの超純水を加え、次に 残りの補足表10 の液体成分を加えます。.攪拌子を加え、攪拌板上で中火(90°C)で完全に溶解します。メディアは淡い青色から紫色で、完全には透明ではありませんが、明らかな未溶解のしこりはありません。
注:ペプチドの存在下でグルコースやその他の糖をオートクレーブすると、修飾が起こり、培地中の利用可能な糖が低下する可能性があります。所望であれば、全ての糖溶液を滅菌的に濾過し、ステップ3.7に記載したように、 補足表10の成分と共に添加することができる。 - 完全に混合したら、10 Nの水酸化ナトリウム(NaOH)を添加して培地のpHを7.0に調整し、添加される量を正確に測定します。pH測定後、14.4mLの水から水酸化ナトリウムを差し引いた量を加えて、ちょうど2Lにします。
- オスのルアー1 / 4-28mmネジを両方の開口部に挿入して、2穴のボトルキャップを準備します。
- PTFEチューブにあらかじめ取り付けられていないキャップの穴に、5 cmのCフレックスチューブをカットし、メスルアーフィッティングの1/8インチホースバーブに接続します。5 cm チューブのもう一方の端に、ロックリングと 1/8 インチホースバーブアダプター付きの別のオスルアーを挿入し、ホイルで覆います (これも 0.22 μM シリンジフィルターに接続します)。
- キャップ全体をアルミホイルで覆い、2 L MEGAメディアボトルの上にねじ込みます。121°Cでオートクレーブし、最低15psiで45分間、液体用の低速排気プログラムを使用します。
- オートクレーブからメディアを取り出し、ぬるま湯になるまで攪拌しながら冷まします。 補足表10 の成分をバイオセーフティキャビネット内の2L培地ボトルに加え、蓋を密封した後、攪拌板に移して均質化します。メディアが冷えたら、フィッティングとアルミホイルシールを締め、嫌気性チャンバーに48時間置いてから使用してください。
注:ソースポンプを16 μL/min(0.94 mL/h)で16時間の保持時間で運転することをお勧めします。この流量では、6ウェルリアクターは1日あたり約0.135Lの媒体を使用します。また、廃液チューブに詰まりが生じるのを防ぐために、廃液ポンプを40μL/minで運転することをお勧めします。詰まりが発生した場合は、必要に応じて廃棄物の流れを増やすことができることに注意してください。発生源と廃棄物の流量はどちらも変更可能ですが、研究者は、流れが速くなったり遅くなったりすると変化する可能性があるため、コミュニティの構成と成長率を注意深く監視する必要があります。6ウェルリアクターを1週間稼働させるには、少なくとも2Lの培地を作成することをお勧めします(1Lを少し超える消費量になります)。
4. 嫌気性チャンバー内でのアレイセットアップ
注意: 組み立て前に、表面が汚染されないように、フードとフードグローブの内部を3%過酸化水素で洗浄し、その後にトリプル脱イオン水すすぎを行うことが不可欠です。箔を取り外した後、接続が迅速に行われ、継手の内部や嫌気性チャンバーグローブに直接接触しなければ、汚染の可能性は最小限に抑えられます
- アレイを嫌気性チャンバー内の磁気攪拌板に位置合わせします。攪拌板コントローラーを最高速度(1600 rpm)に設定し、攪拌子が回転するのを観察して、アレイが正しく位置合わせされていることを確認します。
- ソースと廃棄物の2ストップチューブを、対応するペリスタルティックポンプのクランプに取り付けます。使用目的の24時間前にこれを行う場合は、clをロックしますamp 所定の位置に。それ以外の場合は、チューブの摩耗を減らすために、使用する準備ができるまで緩めておきます。
- ソースラインと廃棄物ラインのメスルアーx1/8インチホースバーブアダプターフィッティングのホイルキャップを取り外し、キャップにねじ込まれているオスルアーをキャップにねじ込まれている1/4-28脅威フィッティングにねじ込みます(この開口部が内部PTFEチューブに接続されていることを確認してください)。
- ホイルキャップを取り外し、0.22μmシリンジフィルターをソースボトルの5cmベントラインと廃棄物ボトルのベントラインに取り付けます。
- 適度な速度(ソースポンプで1 mL/分、廃棄物ポンプで2 mL/分)でフローを開始し、リアクターへの充填を開始します。各リアクターウェルの廃棄物ラインチューブがソースチューブの廃棄物ラインチューブよりも低いことを確認し、各ウェルの過剰充填や空化を防ぎます。
- リアクターが充填し始めたら、すべてのリアクターが同じ量に達し、メディアが廃棄物ラインに流れ込むことを確認します。ここで説明する測定値では、各反応器の作動容積は15mLです。
注:個々のリアクターが充填されない場合は、緩んだフィッティングを締めてソースラインに問題がないか検査し、必要に応じて準備された追加部品と交換します。問題が解決しない場合は、ソースボトルがある場合は交換してください。中レベルが原子炉の内部廃棄物ラインより上に上昇している場合は、原子炉廃棄物ポートの内部にあるPTFEチューブがまだ所定の位置にあることを確認します。 - 各リアクターが充填されたら、ポンプの設定を16μL / minの流量に調整してから、ポンプをオフにします。
- 接種前に、培地を反応器と廃ボトルに一晩置いておきます。これにより、培地のさらなる嫌気性コンディショニング(合計~72時間)が可能になり、ユーザーはシステムの無菌性を確認できます。
- 糞便サンプルの接種前にシステムの無菌性を確認するには、初期充填の直後(ステップ4.7)とステップ4.8の後に、各リアクターとソースメディアをサンプリングします。ステップ 6 で説明した反応器の無菌サンプリングの手順に従います。
- すべてのサンプルの光学密度測定がソースメディアの光学密度測定と同じであることを確認してください。光学密度の増加が観察された場合は、汚染が疑われるため、すべての媒体とシステムを分解、洗浄、および再組み立てする必要があります。
5.糞便サンプルの接種
- 滅菌ワイドボアピペットチップ、滅菌生理食塩水、50 mLコニカルチューブ、25 mL滅菌血清ピペット、5 mLシリンジ、および16ゲージ針を嫌気性チャンバーに入れ、嫌気性環境で少なくとも24時間コンディショニングします。.
- 必要な数の反応器を接種するために必要な糞便の量を計算します。各リアクターウェルには、25% m/v の糞便スラリー中に 3.8 mL の上清が必要です。6つのリアクターウェルの場合、合計22.8mLの25%m/v糞便スラリーが接種に十分な上清を提供する必要があり、これには5.7gの固形糞便が必要です。
- 極低温バイアルに保存された糞便サンプルを嫌気性チャンバーに移し、15分間解凍します。
- ワイドボアピペットチップを使用して、極低温バイアルから糞便物質を50mLのコニカルチューブに移し、しっかりと密封し、200 x g で5分間遠心分離して微粒子を沈殿させます。
- 嫌気性チャンバーに戻し、上清を取り除きます。.オートクレーブ滅菌した実験用スパチュラを使用して、糞便固形物を新しい50 mL円錐管に移し、総質量5.7 gを達成します。17.1 mLの嫌気性滅菌生理食塩水をチューブに加え、しっかりと密封します。
- チャンバーから円錐管を取り外し、ボルテックスで5分間均質化した後、200 x g で5分間遠心分離して微粒子を沈殿させます。
- サンプルを遠心分離機に入れている間に、各リアクターの上部にあるセプタムを10%漂白剤ラボラトリーワイプで少なくとも2分間滅菌します。
- サンプルを嫌気性チャンバーに戻し、滅菌血清学的ピペットを使用して、上清を新しい50 mLコニカルチューブに移します。
- 3.8 mLの糞便スラリー上清を、16 G 1.5インチの針が付いた6つの別々の5 mLシリンジに入れます。.
- ワイプを取り外し、針を中隔に挿入し、糞便スラリーを反応器にゆっくりと注入します。
- 糞便群集が各反応器で約16〜18時間確立してから、反応器への流れを開始します。.マグネチックスタープレートは、糞便スラリーを注入した時点から最高速度(1600rpm)に設定します。
6. リアクターウェルからのサンプルの無菌収集
- 6つの滅菌1 mLシリンジと6つの滅菌22G 3インチ針でラッピングに穴を開け、それらを嫌気性チャンバーに入れて24時間脱気します。.
- サンプリングの直前に、各リアクターの上部にあるセプタムを10%漂白剤ラボラトリーワイプで少なくとも2分間滅菌します。
- 漂白剤ラボ用ワイプを取り外し、すぐに針をシリンジに取り付け、針を最初のリアクターウェルの中隔の中央に挿入します。
- サンプル1 mLを引き上げ、針をセプタムから取り外し、サンプルをシリンジから1.7 mLの標識チューブに移して下流で使用します。ゴム製のセプタムは、針を取り外すと再シールされます。各リアクターウェルに新しいニードルとシリンジを使用して、クロスコンタミネーションを防ぎます。
- 上清が必要な場合は、嫌気性チャンバーからチューブを取り出し、20,000 x g で1分間遠心分離して細菌細胞をペレット化します。
- 上清を別標識の1.7 mLチューブに移し、-80°Cで保存します。
7. ミニバイオリアクターシステムの分解と洗浄
- ソースボトルをソースルアーティーから外し、流量を上げ(ソースポンプで1 mL/分、廃棄物ポンプで2 mL/分)、チューブを空にし始めます。チューブが完全に空になるまで待ちます。攪拌板の電源を切ります。
- チューブが空になったら、廃液ボトルを廃液ルアーティーから外します。次に、リアクターアセンブリを嫌気性チャンバーエアロックに配置し、チャンバーから取り外します。
- すべてのE-LFL 2.06 mmチューブおよびPTFEチューブセグメントを取り外して廃棄します。すべてのフィッティングを外し、10%漂白剤溶液に入れます。
- 各アレイウェルからミニスターバーを取り外し、漂白剤溶液に入れます。リアクターアレイを反転させて、メディアを別の10%漂白剤溶液に空にして消毒します。次に、空の配列を新しい漂白剤溶液に浸します。
- すべてのフィッティングとリアクターアレイを10%漂白剤溶液に30分間浸します(長時間浸漬すると変色の原因になります)。
- フィッティングとリアクターアレイを脱イオン水ですすぎ、メーカーの指示に従って酵素洗剤溶液に一晩浸します。
- フィッティングとリアクターアレイを脱イオン水でトリプルすすぎ、少なくとも3日間完全に風乾させます。乾燥すると、リアクターアレイとフィッティングを再び組み立てに使用できます。
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結果
糞便サンプルは、接種後2週間でヒト糞便スラリーにコロニーを形成したマウスから採取し、-80°Cで保存した。 バイオリアクターシステムは、2つのリピートリアクターウェルに対して連続的なMEGA培地フローでセットアップされました(図3A)。糞便スラリーは、ステップ6に記載のプロトコルに従ってマウス糞便ペレットから調製し、両方の反応器にサンプルポートからレスポンダーマウス糞便スラリーを接種した。静条件下で37°Cの反応器ウェル内の糞便群集を一晩インキュベートした後、反応器への流れを再開し、6日間維持しました。両方のリアクターウェルは、リアクターへの再流開始から1日後、2日後、3日後、4日後、6日後にサンプリングされ、さらなる処理のために-80°Cで保存されました。
微生物群集の経時的な組成の違いおよび複製反応器間の差を評価するために、ビーズビーターの均質化とフェノール:クロロホルム分離、および前述の...
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ディスカッション
このプロトコルに記載されているミニバイオリアクターシステムは、並行実験のための独立した糞便群集の培養を可能にします。宿主因子を分離して微生物群集を研究するこの能力は、微生物が環境に適応する固有の能力を理解するための重要なアプローチです。このプロトコルは、定義された細菌コンソーシアムの培養や、必要に応じて単一の分離培養にも容易に適合させることができます。ここで説明するMEGA培地は、気難しい嫌気性微生物の培養用に設計された濃厚な嫌気性ブロスですが、培地の選択はコミュニティの構成に最も強い影響を与える可能性があります。そのため、研究者は実験を設計する前に、培地の選択を慎重に検討する必要があります。これらのシステムや他のシステムでは、BRM、BDM、強化クロストリジアルメディア4など、他の多くのメディアタイプが成功裏に実装されています。
意義と潜在的な応用
ミニバイオリアクターシステムは、薬理学的薬物、食事成分、その他の治療が微生物叢...
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開示事項
著者には利益相反はありません。
謝辞
著者らは、16S rRNA遺伝子シーケンシングの支援を提供してくれたJosee Gauthierに感謝しています。この研究は、UF Health Cancer Center Funds(CJ)およびUF Department of Medicine Gatorade Fund(CJ)によって部分的に支援されました。R.Z.G.は、UFヘルスがんセンターの資金によって支援されました。R.C.N.は、フロリダ大学(TL1TR001428年UL1TR001427月)の国立衛生研究所TL1トレーニング助成金、国立衛生研究所の国立がん研究所チームベースの学際的がん研究トレーニングプログラム賞のT32CA257923、およびUFヘルスがんセンターの支援を受けました。本書で報告された研究は、フロリダ州立大学がんセンター(UF Health Cancer Center)の支援を受けており、フロリダ州統計§381.915に規定されている州の予算と、米国国立衛生研究所の国立がん研究所(National Cancer Institutes)の賞番号P30CA247796によって部分的に支援されています。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所またはフロリダ州の公式見解を表すものではありません。資金提供者は、研究デザイン、データ収集、および分析に関与していませんでした。出版の決定;または原稿の準備。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1 mL BD スリップチップシリンジ滅菌、使い捨て | Fisher Scientific | 309659 | |
| 1/4-28 mm スレッドからとげのあるオスアダプター (3.2 mm)、5/パック | Cole-Parmer | 008NB32-KD5L | ウェルアレイを 1 つ構築するには、2 パックが必要です |
| 10M NaOH (水酸化ナトリウム) | シグマ | 72068-100ML | |
| 2.0ml スクリューキャップチューブ、ノンローレット、スカート付き、ナチュラル、電子ビーム滅菌チューブ、キャップ付き | ッシャーScientific | 14-755-228 | |
| 2mag MIXdrive 60 撹拌ドライブ | 2mag | 40060 | 60 ポジション磁気撹拌プレート (加熱能力の追加 - cat# 40260) |
| 6 ウェル リアクター arrray、ABS ライク 半透明 透明 プラスチック | Protolabs | カスタム | 3D プリント用 .stl ファイルの補足ファイルを参照してください |
| 水エタノール (200 プルーフ)フィ | ッシャーサイエンティフィ | BP2818 | |
| 酢酸、氷河 | シグマ | A6283 | |
| アダプター、ナイロン、1/4-28 スレッドへのオス ルアー、25/パック | Cole-Parmer | EW-45505-82 | 6 ウェル アレイを 1 つ構築するには、6 個 (1 パック) が必要です |
| ミホイル | フィッシャーサイエンティフィック | 01-213-100 | |
| 嫌気性チャンバー | コイ ラボ製品 | タイプ B | |
| Bel-Art SP Scienceware ノミ マイクロ スピンバー 磁気撹拌バー (1/pk) | フィッシャーサイエンティフィ | 22-261679 | 6 ウェル アレイを 1 つ構築するには、6 つが必要です。 |
| バイオセーフティキャビネットクラス2 | Nuaire | ||
| 酪酸 | グマ | B103500 | |
| CaCl2 & middot; 2H2O (塩化カルシウム二水和物) | シグマ | C7902 | |
| クロロックス ヘルスケア 殺菌ワイプ 漂白剤付き、無香料、6 インチ x 5 インチ、ワイプ 150 枚パック | オフィス デポ | 129202 | |
| D-(-)-フルクトース | シグマ | F0127-100G | |
| D-(+)-セロビオース | シグマ | C7252-100G | |
| D-(+)-グルコース | シグマ | G8270-100G | |
| D-(+)-マルトース一水和物 | グマ | M5885-100G | |
| ドリル アメリカ プラグ ハンド タップ DWTP1/4-28 | ホーム デポ | 305699489 | |
| ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、Ca および Mg なしの 1X、滅菌 | ネシー | 25-508 | |
| メス ルアー & 1/16&プライム; ホース バーブ アダプター、ナイロン、25/パック | Cole-Parmer | EW-45502-00 | 6ウェルアレイを1つ構築するには、24(1パック) |
| メスルアー× 1/8&プライム;ホースバーブアダプター、ナイロン25/パック | Cole-Parmer | EW-45502-04 | ウェルアレイを1つ構築するには、6(1パック) |
| メスルアー× 3/32&p�me;ホースバーブアダプター、ナイロン、25/パック | Cole-Parmer | EW-45502-02 | ウェルアレイを1つ構築するには、 6 (1 パック) |
| メス ルアー ティー、ナイロン、25/パック | Cole-Parmer | EW-45502-56 | ウェル アレイを 1 つ構築するには、10 (1 パック) |
| FeSO4 & middot; 7H2O (鉄 [II] 硫酸塩 七水和物) | シグマ | F8633 | |
| ヘマチン | シグマ | H3281 | |
| ヒスチジン | シグマ | H7750 | |
| イソ吉草酸 | シグマ | 129542 | |
| K2HPO4 二塩基性 (リン酸水素二カリウム) | シグマ | P2222-1KG | |
| KH2PO4 一塩基性 (リン酸二水素カリウム) | シグマ | P0662-500G | |
| ラージ オリフィス ピペット チップ | フィッシャー サイエンティフィック | 02-707-134 | |
| L-システイン塩酸塩 | シグマ | C1276-10G | |
| ロック リング付きオス ルアー & 1/8&プライム; ホースバーブアダプター、ナイロン、25/パック | Cole-Parmer | EW-45505-04 | 1 つの 6 ウェル アレイを構築するには、42 個 (2 パック) が必要です。 |
| エキス | Sigma | 70164-500G | |
| Med Vet International Exel ニードル、20G x 1 インチ、皮下注射、100/箱、26417 | フィッシャーサイエンティフィ | 50-209-2532 | |
| メナジオン (ビタミン K3) | シグマ | M5625 | |
| MgSO4 &ミッドドット;7H2O(硫酸マグネシウム七水和物) | シグマ | M1880-500G | |
| Milli-Q | |||
| NaCl(塩化ナトリウム) | シグマ | S9888-500G | |
| NaHCO3 (炭酸水素ナトリウム) | シグマ | S5761-500G | |
| Omnifi t Q シリーズ 2 穴ボトルキャップ | Cole-Parmer | 00945Q-2 | 6 ウェル アレイを 1 台構築するには、 |
| 1 つの PMP IPC-N L 24CHNL 8RLR 115V | MasterFlex | ISM939C-115V | 24 チャンネル蠕動ポンプが必要です、ソース用に 1 個、廃棄物用に 1 個が必要です |
| Precision Seal® ゴムセプタム、白、外径 7 mm ガラス管 (100/pk) | ミリポア シグマ | Z553905-100EA | 1 つの 6 ウェル アレイを構築するには、6 セプタムが必要です |
| プロピオン酸 | シグマ | P5561 | |
| ポンプチューブ、2ストップ、Tygon S3 E-Lab、1.02 mm ID;12/PK | VWR | MFLX96460-28 | 6ウェルアレイを1台構築するには、6 が必要です。(1パック) |
| ポンプチューブ、2ストップ、Tygon S3 E-Lab、1.14 mm ID; 12/PK | VWR | MFLX96460-30 | 6ウェルアレイを1台構築するには、6(1パック) |
| ューリタンキャリーブレア培地、5ml | ッシャーサイエンティフィ | 22-029-646 | |
| PYREX 2Lラウンド培地保存ボトル、GL45スクリューキャップ付き | フィッシャーサイエンティフィック | 06-414-1E | |
| カミソリの刃 | シー12-640 | ||
| サズリン、ナトリウム塩 | サーモフィッシャーの ACROS Organics | AC41890-0010 | |
| 可溶性デンプン | シグマ | S9765-100G | |
| ステンレス鋼マイクロスパチュラ、スプーンライク | フィッシャーサイエンティフィック | S50823 | |
| TBNG TYGON ELFL 2.06MMID 100'VWR | MFLX06449-42 | ウェル アレイを 1 つ構築するには、205.5 cm の | |
| 微量ミネラル サプリメント | ATCC | MD-TMS | が必要です |
| トリプチカーゼペプトン(BBL) | フィッシャーサイエンティフィ | B11921 | |
| 、PTFE、1/8&Pine;(3.2 mm)外径と時間;内径 1.5 mm、10 m | Cole-Parmer | 008 T32-150-10 | 6 ウェル アレイを 1 台構築するには、300 mm |
| Tween 80 | Sigma | P1754 が必要です。 | |
| ビタミンサプリメント | ATCC | MD-VS | |
| 酵母エキス (バクト) | フィッシャーサイエンティフィ | DF0127-17-9 |
参考文献
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biol. 14 (8), e1002533(2016).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metab. 26 (1), 110-130 (2017).
- Rooks, M. G., Garrett, W. S. Gut microbiota, metabolites and host immunity. Nat Rev Immunol. 16 (6), 341-352 (2016).
- Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Farrell, K., Britton, R. A. MiniBioReactor Arrays (MBRAs) as a tool for studying C. difficile physiology in the presence of a complex community. Methods Mol Biol. 1476, 235-258 (2016).
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- He, Z., et al. Campylobacter jejuni promotes colorectal tumorigenesis through the action of cytolethal distending toxin. Gut. 68 (2), 289-300 (2019).
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